H παρούσα διδακτορική διατριβή στοχεύει στη διερεύνηση της σχέσης του οξειδωτικού στρες με τη σκληρωτιακή διαφοροποίηση και την παραγωγή αφλατοξίνης του μύκητα Aspergillus flavus. Ο μύκητας αυτός έχει σπουδαία αγροτική σημασία διότι μπορεί να επιμολύνει αποθηκευμένους καρπούς. Επίσης μπορεί να αποτελεί παθογόνο μικροοργανισμό για τον άνθρωπο που σχετίζεται με ασπεργιλλώσεις των πνευμόνων και άλλες λοιμώξεις. Πολλά στελέχη παράγουν μεγάλες ποσότητες αφλατοξίνης, μιας καρκινογόνου και εξαιρετικά τοξικής ένωσης. Συγκεκριμένα, διερευνήθηκε ο ρόλος κεντρικών παραμέτρων του οξειδωτικού στρες όπως η λιπιδική και πρωτεϊνική υπεροξείδωση, η θειολική οξειδοαναγωγική κατάσταση αλλά και συγκεκριμένων αντιοξειδωτικών ενζύμων, καθώς και η επίδραση συγκεκριμένων αντιοξειδωτών στη σκληρωτιακή διαφοροποίηση ενός στελέχους αγρίου τύπου σε σύγκριση με ένα μεταλλαγμένο μη σκληρωτιογόνο και μη αφλατοξινογόνο στέλεχος (ΔveA). Για την ολοκλήρωση αυτής της διατριβής χρειάστηκε η ανάπτυξη νέων μεθοδολογιών για την ποσοτικοποίηση στους μύκητες της ολικής πρωτεΐνης, και εξειδικευμένων θειολικών και λιπιδικών παραμέτρων του οξειδωτικού στρες. Τα αποτελέσματα της διατριβής δείχνουν μια σαφή συσχέτιση του οξειδωτικού στρες με τη διαφοροποίηση των σκληρωτιογόνων μυκήτων, αφού το αγρίου τύπου στέλεχος εμφανίζεται περισσότερο στρεσαρισμένο οξειδωτικά σε σύγκριση με το αδιαφοροποίητο μεταλλαγμένο στέλεχος. Η χορήγηση αντιοξειδωτών ανέστειλε πλήρως (με εξαίρεση το ασκορβικό οξύ) τη σκληρωτιογένεση του αγρίου τύπου στελέχους επιδρώντας διαφορετικά στις παραμέτρους του οξειδωτικού στρες, ενώ μείωσε έως ανέστειλε πλήρως τη βιοσύνθεση αφλατοξίνης, αποκαλύπτοντας τη συμμετοχή του οξειδωτικού στρες σε αυτές τις διαδικασίες. Τα αποτελέσματα της διατριβής εκτός από επιστημονικό ενδιαφέρον έχουν και πρακτική σημασία εξαιτίας της παθογένειας του συγκεκριμένου μύκητα τόσο στον άνθρωπο όσο και στα φυτά. / The present thesis aims to elucidate the relationship between oxidative stress and sclerotial differentiation and aflatoxin production of the fungus Aspergillus flavus. This fungus has great agricultural importance because it can infect stored grains. It can also be a human pathogen, associated with aspergillosis of the lungs and other infections. Many strains produce significant quantities of aflatoxin, a carcinogenic and acutely toxic compound. In particular, the role of central parameters of oxidative stress such as lipid and protein peroxidation, thiol redox state and antioxidant enzymes, and the influence of certain related exogenous antioxidants were studied on the biosynthesis of aflatoxin, on the biogenesis of sclerotia in a wild type in comparative relationship with a non-sclerotiogenic and non-aflatoxigenic mutant strain (ΔveA). The experimental needs of this thesis necessitates the development of new methodologies for the precise quantification of certain thiol and lipid markers of oxidative stress and protein concentration. The results show a clear relationship between oxidative stress and sclerotial differentiation since the wild type strain is more oxidatively stressed than the mutant non-differentiating strain. Administration of certain antioxidants completely inhibited sclerotiogenesis in the wild type strain (with the exception of ascorbic acid), and decreased or even halted the biosynthesis of aflatoxin, thus revealing an implication of oxidative stress on these processes. The results besides having scientific interest, have also practical importance since this fungi is both human and plant pathogen.

Ο εγκέφαλος των θηλαστικών είναι αρκετά ευάλωτος στις επιδράσεις περιβαλλοντικών τοξινών, λόγω των ιδιαίτερων δομικών και λειτουργικών χαρακτηριστικών του. Η έκθεση σε μια νευροτοξίνη εκδηλώνεται συνήθως μέσω γνωστικών και συμπεριφορικών διαταραχών, που συνοδεύουν δυσμενείς νευροχημικές αλλαγές και καθορίζονται από το είδος, την ηλικία, το φύλο, το γενετικό προφίλ, τη δόση, την οδό και τη χρονική περίοδο έκθεσης. Ωστόσο, η χρόνια έκθεση σε ένα νευροτοξικό παράγοντα είναι δυνατόν να επάγει μη αναστρέψιμη νευρωνική βλάβη και εκφύλιση. Το αργίλιο (Al), που συνιστά το τρίτο σε αφθονία στοιχείο στη φύση, ασκεί ποικίλες νευροτοξικές επιδράσεις, ανάλογα με τη χημική μορφή του μετάλλου, τη δόση, την οδό και την περίοδο έκθεσης, ενώ αμφιλεγόμενη παραμένει η εμπλοκή του στην παθογένεια της νόσου του Alzheimer. Η αφλατοξίνη Β1 (AFB1) ανήκει στην ομάδα των μυκοτοξινών (δευτερογενής μεταβολίτης των μυκήτων του γένους Aspergillus), μολύνει καλλιέργειες και ζωοτροφές και αποτελεί ισχυρή ηπατοτοξίνη και ηπατοκαρκινογόνο. Εντούτοις, η νευροτοξικότητα της AFB1 είναι ελάχιστα μελετημένη και οι λίγες αναφορές που παρουσιάζουν την εκδήλωση συμπεριφορικών διαταραχών, αφορούν την έκθεση σε αναπτυξιακό στάδιο. Εκτενής και εντατική είναι τις τελευταίες δεκαετίες η έρευνα της νευροπροστατευτικής δράσης φαρμακευτικών φυτών και των βιοδραστικών συστατικών τους, με απώτερο στόχο την πρόληψη ή αντιμετώπιση της εγκεφαλικής δυσλειτουργίας που επάγεται από γενετικούς ή/και περιβαλλοντικούς παράγοντες. Ενδιαφέρον για τον ελλαδικό χώρο, λόγω της υψηλής εμπορικής του αξίας, έχει το καλλιεργούμενο φυτικό είδος Crocus sativus L., του οποίου οι στύλοι (κρόκος ή σαφράν) χρησιμοποιούνται στη διατροφή ως άρτυμα και η φαρμακευτική τους αξία έχει αναγνωριστεί εδώ και χιλιετίες. Στόχος της παρούσας διδακτορικής διατριβής ήταν να συμβάλλει στην έρευνα της νευροτοξικής δράσης του Al και της AFB1 και του νευροπροστατευτικού ρόλου των στύλων του C. sativus, εστιάζοντας σε παραμέτρους της μνημονικής λειτουργίας ενηλίκων μυών, της χολινεργικής/μονοαμινεργικής διαβίβασης και της οξειδωτικής/αντιοξειδωτικής κατάστασης του εγκεφάλου τους. ΜΕΘΟΔΟΙ: Σε αρσενικούς ενήλικες Balb-c μύες (n=7-10/ομάδα) χορηγήθηκε δια στόματος AlCl3 (50 mg/kg σωματικού βάρους/ημέρα) διαλυμένο στο κανονικό πόσιμο νερό για 5 εβδομάδες ή ενδοπεριτοναϊκά (i.p.) AFB1 (0.3 και 0.6 mg/kg σωματικού βάρους/ημέρα) για 4 ημέρες. Η ικανότητα εκχυλισμάτων των στύλων του C. sativus και της κροκετίνης, του κύριου βιοδραστικού μεταβολίτη των καροτενοειδών συστατικών (κροκίνες) του κρόκου, να προλαμβάνουν ή να ανατρέπουν τις βλαπτικές επιδράσεις του Al και της AFB1 στον εγκέφαλο των μυών, διερευνήθηκε ακολουθώντας τα εξής σχήματα χορήγησης: α) υδατικό/μεθανολικό εκχύλισμα κρόκου (60 mg/kg σωματικού βάρους/ημέρα) χορηγήθηκε i.p. τις τελευταίες 6 ημέρες της περιόδου χορήγησης του AlCl3 (50 mg/kg σωματικού βάρους/ημέρα στο πόσιμο νερό για 5 εβδομάδες), β) αφέψημα κρόκου (0.45 mg/mL) καταναλώθηκε για 2 εβδομάδες πριν τη χορήγηση AFB1 (0.6 mg/kg σωματικού βάρους/ημέρα i.p. τις τελευταίες 4 ημέρες της περιόδου χορήγησης του αφεψήματος), και γ) καθαρή κροκετίνη (4 mg/kg σωματικού βάρους/ημέρα) χορηγήθηκε i.p. για 3 ημέρες πριν ή μετά τη χορήγηση AFB1 (0.6 mg/kg σωματικού βάρους/ημέρα i.p. για 4 ημέρες). Μελετήθηκαν επίσης, οι επιδράσεις των προηγούμενων σχημάτων χορήγησης του αφεψήματος κρόκου και της κροκετίνης στον εγκέφαλο υγιών ενηλίκων μυών. Η ικανότητα μάθησης/μνήμης των μυών αξιολογήθηκε με τη δοκιμασία παθητικής αποφυγής. Η ενεργότητα της ακετυλοχολινεστεράσης [AChE, διαλυτές σε άλας (SS)/απορρυπαντικό (DS) ισομορφές], της βουτυρυλοχολινεστεράσης (BuChE, SS/DS ισομορφές) και της μονοαμινοξειδάσης (ΜΑΟ, -Α και -Β ισομορφές) προσδιορίστηκαν στον ολικό εγκέφαλο (-ce, πλην παρεγκεφαλίδας) και την παρεγκεφαλίδα, ως δείκτες της χολινεργικής και μονοαμινεργικής διαβίβασης, αντιστοίχως. Επίσης, μετρήθηκαν οι συγκεντρώσεις της μηλονικής διαλδεΰδης (MDA) και της ανηγμένης γλουταθειόνης (GSH), ως δείκτες της λιπιδικής υπεροξείδωσης και της αντιοξειδωτικής άμυνας, αντιστοίχως, των εγκεφαλικών ιστών. Με τη χρήση φασματομετρίας ατομικής απορρόφησης μετρήθηκαν τα επίπεδα Al στους εγκεφαλικούς ιστούς, ενώ, για πρώτη φορά, η κροκετίνη προσδιορίστηκε στον ολικό εγκέφαλο (-ce) των μυών μετά την i.p. χορήγηση εκχυλίσματος κρόκου, με HPLC ανάλυση. ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ: Η μακρόχρονη πρόσληψη υψηλής δόσης AlCl3 μέσω του πόσιμου νερού οδήγησε σε εξασθένηση της μάθησης/μνήμης των μυών, σημαντική μείωση της ενεργότητας της AChE και BuChE, αύξηση της ενεργότητας των ισομορφών της ΜΑΟ του ολικού εγκεφάλου (-ce), αλλά αναστολή της ΜΑΟ-Β της παρεγκεφαλίδας, σημαντική αύξηση των επιπέδων MDA στον εγκέφαλο και μείωση της συγκέντρωσης GSH στους εγκεφαλικούς ιστούς. Συσσώρευση του μετάλλου καταγράφηκε στους εγκεφαλικούς ιστούς των μυών που λάμβαναν AlCl3. Μνημονικό έλλειμμα εμφάνισαν οι μύες που έλαβαν την υψηλή (0.6 mg/kg) αλλά όχι χαμηλή δόση (0.3 mg/kg) AFB1. Επίσης, η βραχύχρονη i.p. χορήγηση της μυκοτοξίνης ανέστειλε τις χολινεστεράσες (ChEs), ενεργοποίησε τη ΜΑΟ, αύξησε σημαντικά τη λιπιδική υπεροξείδωση και μείωσε τα επίπεδα GSH στους εγκεφαλικούς ιστούς. Ωστόσο, διαφορική απόκριση στην έκθεση στην AFB1 παρουσίασαν οι ισομορφές της BuChE και ΜΑΟ των εγκεφαλικών ιστών, ανάλογα με τη χορηγούμενη δόση. Αντιχολινεστερασική και αντιοξειδωτική δράση επέδειξαν τόσο η μακρόχρονη πρόσληψη αφεψήματος κρόκου όσο και η βραχύχρονη i.p. χορήγηση κροκετίνης στους εγκεφαλικούς ιστούς των υγιών μυών, ενώ δεν μετέβαλλαν τη μνημονική τους ικανότητα. Η βραχύχρονη συγχορήγηση εκχυλίσματος κρόκου στο τέλος της περιόδου πρόσληψης AlCl3, αν και δεν είχε καμία επίδραση στη γνωστική ικανότητα των μυών, αντέστρεψε σημαντικά τις επαγόμενες από το Al αλλαγές της ενεργότητας της ΜΑΟ και των επιπέδων MDA και GSH των εγκεφαλικών ιστών. Επιπλέον, η ενεργότητα των ισομορφών της AChE των εγκεφαλικών ιστών μειώθηκε περαιτέρω σημαντικά μετά τη χορήγηση του εκχυλίσματος. HPLC ανάλυση του ολικού εγκεφάλου (-ce) των μυών αποκάλυψε, για πρώτη φορά στην παρούσα μελέτη, την παρουσία κροκετίνης μετά τη βραχύχρονη συγχορήγηση εκχυλίσματος κρόκου, η οποία δεν ανιχνεύτηκε στους μύες μάρτυρες. Η μακρόχρονη καθημερινή κατανάλωση αφεψήματος κρόκου πριν την έκθεση σε υψηλή δόση AFB1 απέτρεψε την επαγόμενη από τη μυκοτοξίνη μνημονική εξασθένηση, αναστολή της DS-BuChE του ολικού εγκεφάλου (-ce), αύξηση της ενεργότητας της ΜΑΟ-Α του εγκεφάλου και της ΜΑΟ-Β της παρεγκεφαλίδας και οξειδωτική βλάβη των λιπιδίων στους εγκεφαλικούς ιστούς. Επίσης, οι μύες που κατανάλωναν το αφέψημα εμφάνισαν περαιτέρω σημαντική μείωση της ενεργότητας των ισομορφών της AChE του ολικού εγκεφάλου (-ce), της DS-AChE της παρεγκεφαλίδας και των επιπέδων GSH των εγκεφαλικών ιστών. Αν και η βραχύχρονη i.p. χορήγηση καθαρής κροκετίνης πριν ή μετά την έκθεση σε υψηλή δόση AFB1 δεν επηρέασε την ικανότητα μάθησης/μνήμης των μυών, έδρασε αποτελεσματικά στην πρόληψη ή αντιστροφή της επαγόμενης από τη μυκοτοξίνη αναστολής της BuChE του ολικού εγκεφάλου (-ce), ενεργοποίησης των ισομορφών της ΜΑΟ του εγκεφάλου και αύξησης της λιπιδικής υπεροξείδωσης των εγκεφαλικών ιστών. Ωστόσο, μόνο η προηγηθείσα χορήγηση κροκετίνης απέτρεψε την αύξηση της ενεργότητας της ΜΑΟ-Β της παρεγκεφαλίδας και τη μείωση των επιπέδων GSH των εγκεφαλικών ιστών, που προκάλεσε η χορήγηση της AFB1. Διαφορική απόκριση (περαιτέρω αναστολή ή αύξηση) στη χορήγηση κροκετίνης εμφάνισαν οι ισομορφές της AChE των εγκεφαλικών ιστών, ανάλογα με τη χρονική ακολουθία της χορήγησης. ΣΥΜΠΕΡΑΣΜΑ: Τα αποτελέσματα της παρούσας μελέτης δείχνουν ότι η μακρόχρονη πρόσληψη AlCl3 μέσω του πόσιμου νερού και η βραχύχρονη συστημική έκθεση στην AFB1 ασκούν ισχυρές νευροτοξικές επιδράσεις στους ενήλικες μύες, όπως απέδειξαν η επαγωγή μνημονικής εξασθένησης και οι νευροχημικές διαταραχές. Η αναστολή του γνωστικού ελλείμματος από τη μακρόχρονη κατανάλωση αφεψήματος κρόκου, υποστηρίζει τη νευροπροστατευτική δράση του κρόκου έναντι της νευροτοξικότητας της AFB1 και τον αναδεικνύει ως ελπιδοφόρο διατροφικό παράγοντα στην πρόληψη της εγκεφαλικής δυσλειτουργίας. Ωστόσο, οι ευεργετικές επιδράσεις της κροκετίνης στους νευροχημικούς δείκτες της εγκεφαλικής λειτουργίας υπό συνθήκες τοξικότητας και η απόδειξη της βιοδιαθεσιμότητάς της στον εγκέφαλο, προτείνουν τη συμβολή των καροτενοειδών συστατικών του κρόκου στις νευροπροστατευτικές του ιδιότητες και ενθαρρύνουν την περαιτέρω διερεύνησή τους ως νευροπροστατευτικών παραγόντων. / Mammalian brain is quite susceptible to environmental toxins, due to its special structural and functional features. Exposure to a neurotoxin is commonly manifested through cognitive and behavioral disturbances that follow adverse neurochemical changes and are defined by the animal species in question, the age, the gender, the genetic profile, the dose, the route and the period of exposure. However, chronic exposure to a neurotoxic agent may induce irreversible neuronal damage and degeneration. Aluminum (Al), which is the third most abundant element in nature, exerts diverse neurotoxic effects, depending on the metal’s chemical form, the dose, the route and the period of exposure, while its implication in the pathogenesis of Alzheimer’s disease remains controversial. Aflatoxin B1 (AFB1) is classified to the group of mycotoxins (secondary metabolite of the fungi of Aspergillus sp.), contaminates crops and feeds and constitutes potent hepatotoxin and hepatocarcinogen. Nevertheless, AFB1 neurotoxicity is poorly studied and the few reports focus on the manifestation of behavioral disorders after exposure at developmental stage. During the last decades, extensive research on the neuroprotective action of medicinal plants and their bioactive components is carried out, with the aim of prevention or treatment of brain dysfunction that is provoked by genetic and/or environmental agents. The plant Crocus sativus L. is of particular interest in Greece ,due to its large-scale cultivation and the high commercial value of its styles (saffron); saffron is used as a spice in diet and its medicinal properties have been recognized for millenia. The aim of the present study was to contribute to the investigation of the neurotoxic activity of Al and AFB1 and the neuroprotective role of saffron, focusing on aspects of memory function, brain cholinergic/monoaminergic transmission and oxidant/antioxidant state in adult mice. METHODS: Male adult Balb-c mice (n=7-10/group) received either AlCl3 orally (50 mg/kg body weight/day) dissolved in normal drinking water for 5 weeks or AFB1 intraperitoneally (i.p.) (0.3 and 0.6 mg/kg body weight/day) for 4 days. The potential of saffron extracts and crocetin, the main bioactive metabolite of saffron carotenoid constituents (crocins), in prevention or reversal of the detrimental effects of Al and AFB1 on mouse brain, was investigated by adopting the following administration schemes: a) aqueous methanolic extract of saffron (60 mg/kg body weight/day) was administered i.p. for the last 6 days of AlCl3 treatment period (50 mg/kg body weight/day in drinking water for 5 weeks), b) saffron infusion (0.45 mg/mL) was consumed for 2 weeks prior to AFB1 administration (0.6 mg/kg body weight/day i.p. for the last 4 days of saffron infusion treatment period), and c) pure crocetin (4 mg/kg body weight/day) was administered i.p. for 3 days before or after AFB1 administration (0.6 mg/kg body weight/day i.p. for 4 days). The effects of the previous administration schemes of saffron infusion and crocetin on brain of healthy adult mice, were also studied. The learning/memory ability of mice was evaluated by step-through passive avoidance task. The activity of acetylcholinesterase [AChE, salt-(SS)/detergent-soluble (DS) isoforms], butyrylcholinesterase (BuChE, SS/DS isoforms) and monoamine oxidase (MAO, -A and -B isoforms) was assessed in whole brain (-ce, minus cerebellum) and cerebellum, as indices of cholinergic and monoaminergic transmission, respectively. Moreover, malondialdehyde (MDA) and reduced glutathione (GSH) concentrations were determined as indices of lipid peroxidation and antioxidant defence, respectively, in cerebral tissues. Cerebral tissues’ Al levels were measured by atomic absorption spectrometry, while, for the first time, crocetin was determined in mouse whole brain (-ce) after i.p. administration of saffron extract by HPLC analysis. RESULTS: Long-term intake of high dose of AlCl3 through drinking water resulted in learning/memory impairment of mice, significant reduction of AChE and BuChE activity, increase of MAO isoforms’ activity in whole brain (-ce), but inhibition of cerebellar MAO-B, significant elevation of brain MDA levels and decrease of GSH content in cerebral tissues. Metal accumulation was recorded in brain tissues of AlCl3 treated mice. Mice receiving high (0.6 mg/kg) but not low dose (0.3 mg/kg) of AFB1 displayed memory deficit. Furthermore, short-term i.p. administration of mycotoxin inhibited cholinesterases (ChEs), activated MAO, increased significantly lipid peroxidation and reduced GSH levels in cerebral tissues. However, brain tissues’ BuChE and MAO isoforms presented differential response to AFB1 exposure, depending on the administered dosage. Both long-term saffron infusion intake and short-term i.p. administration of crocetin exerted anti-cholinesterase and antioxidant action in healthy mice’ cerebral tissues, while their memory performance remained unchanged. Although short-term co-administration of saffron extract at the end of AlCl3 treatment period had no effect on cognitive capacity of mice, it reversed significantly the Al-induced changes in MAO activity and the levels of MDA and GSH of cerebral tissues. Moreover, cerebral AChE isoforms’ activity was further significantly decreased following saffron extract co-administration. HPLC analysis of mouse whole brain (-ce) revealed, for the first time, the presence of crocetin after short-term saffron extract co-administration, which was not detected in control mice. Long-term daily consumption of saffron infusion prior to AFB1 (high dose) exposure prevented the mycotoxin-induced memory impairment, inhibition of whole brain (-ce) DS-BuChE, increase of brain MAO-A and cerebellar MAO-B activity, and oxidative damage of lipids in brain tissues. Also, saffron infusion pre-treated mice displayed further significant decrease of the activity of AChE isoforms in whole brain (-ce), DS-AChE in cerebellum and the levels of GSH in cerebral tissues. Although, short-term i.p. administration of pure crocetin before or after AFB1 (high dose) exposure had no effect on learning/memory ability of mice, it effectively prevented or reversed the mycotoxin-induced inhibition of whole brain (-ce) BuChE, activation of brain MAO isoforms and elevation of cerebral tissues’ lipid peroxidation. However, only crocetin pre-treatment inhibited the increase of cerebellar MAO-B activity and reduction of brain tissues’ GSH content which were provoked by AFB1 administration. Cerebral tissues’ AChE isoforms presented differential response (further decrease or increase) to crocetin treatment, depending on time course of administration. CONCLUSION: The findings of the present study show that long-term intake of AlCl3 through drinking water and short-term systemic exposure to AFB1, exert strong neurotoxic effects on adult mice, as evidenced by the induction of memory impairment and the neurochemical disturbances. The inhibition of cognitive deficit by long-term saffron infusion consumption supports its neuroprotective action against AFB1 neurotoxicity and highlights saffron as a promising dietary agent in prevention of brain dysfunction. However, the beneficial effects of crocetin on neurochemical indices of brain function under toxicity and the demonstration of its bioavailability in brain, suggest the contribution of saffron carotenoids in saffron’s neuroprotective properties and encourage their further investigation as neuroprotective agents.