Η χορήγηση φαρμάκων μέσω της αναπνευστικής οδού αποτελεί τον πιο αποτελεσματικό τρόπο αντιμετώπισης νόσων του αναπνευστικού συστήματος όπως το άσθμα. Τα τελευταία χρόνια, η αύξηση στη συχνότητα εμφάνισης του άσθματος δημιούργησε την ανάγκη βελτίωσης της θεραπείας με το σχεδιασμό νέων συσκευών εισπνοής και την ανάπτυξη καλύτερης μορφοποίησης των φαρμάκων ώστε να εξασφαλίζεται ικανοποιητική κατανομή τους στο αναπνευστικό δένδρο. Στην παρούσα μελέτη, λαμβάνοντας υπόψη τις δυσκολίες ανάπτυξης ενός φαρμάκου για εισπνεόμενη χορήγηση, αποφασίσαμε να ασχοληθούμε με τη μορφοποίηση της φουμαρικής φορμοτερόλης, ενός ευρέως χρησιμοποιούμενου βρογχοδιασταλτικού φαρμάκου στη θεραπεία του βρογχικού άσθματος. Στόχος είναι η ανάπτυξη της βέλτιστης μορφοποίησης με την οποία θα επιτυγχάνεται το μέγιστο θεραπευτικό κλάσμα FPD. Διερευνήθηκε η επίδραση διαφόρων παραγόντων στη μεταφορά και εναπόθεση των λεπτόκοκκων σωματιδίων της φουμαρικής φορμοτερόλης στο αναπνευστικό δένδρο. Συγκεκριμένα, μελετήθηκε η επίδραση της κατανομής μεγέθους των σωματιδίων της λακτόζης στη μορφοποίηση και προσδιορίστηκε η κατανομή που επιτρέπει ικανοποιητική προσκόλληση της φουμαρικής φορμοτερόλης στη λακτόζη αλλά και εύκολο διαχωρισμό της απ’ αυτήν κατά την εισπνοή. Στη συνέχεια, διεξήχθησαν πειράματα προσδιορισμού του ιδανικού χρόνου ανάμιξης και των συνθηκών παραγωγής που εξασφαλίζουν ικανοποιητική ροή των κόνεων και πλήρωση των κυαθίων και δεν επηρεάζουν τη χημική σταθερότητα του φαρμάκου. Ακολούθησαν πειράματα για την αξιολόγηση της επίδρασης της μεταβολής στο βάρος πλήρωσης του κυαθίου στη μορφοποίηση και κατ’ επέκταση στο θεραπευτικό κλάσμα FPD. Τέλος, η μελέτη ολοκληρώθηκε μ’ ένα πείραμα ελέγχου της επίδρασης των εργαστηριακών συνθηκών στο Andersen Cascade Impactor και συνεπώς στη σταθερότητα του προϊόντος αλλά και την ικανότητα διασποράς του. / Drug delivery through the respiratory tract constitutes the most effective way of treating respiratory diseases such as asthma. Over the last years, the increased frequency of asthma occurrence challenged the improvement of therapy with the design of new inhalers and a better formulation development of drugs so as to achieve effective drug distribution to the respiratory tree. In the current study, having taken into consideration the difficulties of drug development for inhalation delivery, we have decided to work on the formulation of formoterol fumarate, a bronchodilator broadly used to the treatment of bronchial asthma. The aim is the optimization of formulation development so as to achieve the optimum therapeutic fraction FPD. The main idea was the examination of the effect of certain parameters on the delivery and deposition of formoterol fumarate fine particles to the respiratory tree. Specifically, the effect of lactose size distribution on the formulation was studied and the size distribution that allows not only effective adherence of formoterol fumarate to lactose but also efficient release during inhalation was determined. As a next step, experiments were carried out for the determination of the ideal mixing time and manufacturing conditions for satisfactory powder flowability, blister filling and chemical stability of drug. Experiments for the evaluation of the effect of blister filling variation on the formulation and consequently on the therapeutic fraction FPD followed. Finally, this study was completed by controlling the effect of laboratory conditions on the Andersen Cascade Impactor and consequently on the product stability and its dispersion ability.

Στη παρούσα εργασία, μελετήθηκαν διάφοροι τύποι αρσονολιποσωμάτων, ως προς την επίδραση της λιπιδικής τους σύστασης στην σταθερότητα τους, την αλληλεπίδραση τους με φυσιολογικά και καρκινικά κύτταρα και την βιοκατανομή τους. Παρασκευάστηκαν sonicated αρσονολιποσώματα με 1,2-rac-διάκυλοοξυπροπυλ-αρσονικό οξύ με παλμιτόυλ- παράπλευρες αλυσίδες (αρσονολιπίδιο, Ars), χοληστερόλη (Chol) και φωσφατιδυλοχολίνη (PC) [PC-based αρσονολιποσώματα] ή 1,2-διστεαρόυλ-sn-φωσφατιδυλοχολίνη (DSPC) [DSPC-based αρσονολιποσώματα], με αναλογίες PC/Ars/Chol και DSPC/Ars/Chol ίσες με 12:8:10 mol:mol:mol. Επίσης παρασκευάστηκαν παρόμοια αρσονολιποσώματα με αναλογίες PC/Ars/Chol και DSPC/Ars/Chol ίσες με 17:3:10 mol:mol:mol. Παρασκευάστηκαν επίσης αρσονολιποσώματα που, εκτός από αρσονολιπίδιο, χοληστερόλη, φωσφατιδυλοχολίνη ή 1,2-διστεαρόυλ-sn-φωσφατιδυλοχολίνη περιείχαν στην σύσταση τους και PEG2000-λιπίδιο (πολυαιθυλενογλυκόλη, Μ.Β. 2000, συζευγμένη με 1,2-διστεαρόυλ-φωσφατιδυλοαιθανολαμίνη, DSPE-PEG2000) [PEGylated PC- και DSPC-based αρσονολιποσώματα]. Εκτός από τα παραπάνω αρσονολιποσώματα, παρασκευάστηκαν και sonicated λιποσώματα με χοληστερόλη και PC ή DSPC σε αναλογίες PC:Chol και DSPC:Chol 2:1 mol:mol («συμβατικά» λιποσώματα, χωρίς αρσονολιπίδιο). Μελετήθηκε αρχικά η τοξικότητα όλων των παραπάνω λιποσωμάτων έναντι διάφορων τύπων καρκινικών κυττάρων: ανθρώπινων λευχαιμικών κυττάρων (ΝΒ4), κυττάρων από καρκίνο του προστάτη (PC3), ανθρώπινων κυττάρων από καρκίνο του μαστού (MDA-MB-468) και Τ-λεμφοκυττάρων από ασθενείς με λευχαιμία (ΜΤ-4), καθώς και έναντι φυσιολογικών ενδοθηλιακών κυττάρων από φλέβες ανθρώπινου ομφάλιου λώρου (HUVEC). Η τοξικότητα των αρσονολιποσωμάτων υπολογίσθηκε με μετρήσεις της βιωσιμότητας των κυττάρων μετά από αλληλεπίδραση τους με τα λιποσώματα με την μέθοδο MTT. Από τις καμπύλες βιωσιμότητας υπολογίσθηκαν και οι IC50 τιμές, οι συγκεντρώσεις δηλαδή στις οποίες κάθε λιπόσωμα προκαλεί 50% μείωση της κυτταρικής βιωσιμότητας. Σύμφωνα με τα αποτελέσματα όλοι οι τύπο αρσονολιποσωμάτων είναι τοξικοί έναντι των καρκινικών κυττάρων (PC3, NB4 και MT-4), με εξαίρεση τα MDA-MB-468 κύτταρα, ενώ αντιθέτως δεν επηρεάζουν την βιωσιμότητα των φυσιολογικών HUVEC κυττάρων. Ωστόσο, για τον ίδιο τύπο κυττάρων, υπάρχουν σημαντικές διαφορές μεταξύ των διαφορετικών τύπων αρσονολιποσωμάτων, οι οποίες δεν είναι ανάλογες με τις διαφορές της σταθερότητας των αρσονολιποσωμάτων, γεγονός που υποδηλώνει ότι η ακεραιότητα της μεμβράνης των αρσονολιποσωμάτων δεν αποτελεί ανασταλτικό παράγοντα για την εμφάνιση τοξικότητας. Είναι φανερό επομένως πως η σύσταση των αρσονολιποσωμάτων πρέπει να προσαρμόζεται κατάλληλα, ανάλογα με την in vivo κινητική τους και την επιθυμητή βιοκατανομή τους. Μελετήθηκε επίσης ο μηχανισμός αλληλεπίδρασης των λιποσωμάτων με NB4 και MDA-MB-468 κύτταρα, καθώς αυτές οι δυο κυτταρικές σειρές ήταν οι σειρές που επέδειξαν την περισσότερη και την λιγότερη ευαισθησία αντίστοιχα έναντι των αρσονολιποσωμάτων στις μελέτες βιωσιμότητας, με χρήση μιας φθορισμομετρικής μεθόδου. Η μέθοδος επιτρέπει την παρακολούθηση της ενδοκυττάρωσης, της δέσμευσης και διαφυγής των λιποσωμάτων από τα κύτταρα. Το HPTS, μια υδατοδιαλυτή, έντονα φθορίζουσα ουσία, της οποίας ο φθορισμός εξαρτάται από το pH, εγκλωβίστηκε στο εσωτερικό των λιποσωμάτων. Η τιμή του φθορισμού του HPTS στα 413 nm εξαρτάται από το pH, ενώ είναι ανεξάρτητη από το pH στα 454 nm, με μήκος κύματος διέγερσης 512 nm. Η ύπαρξη ισοασβεστικού σημείου στα 413 nm επιτρέπει την «μετάφραση» του φθορισμού σε ποσότητα της ουσίας. Τα NB4 και MDA-MB-468 κύτταρα επωάστηκαν με λιποσώματα που είχαν εγκλωβίσει φθορίζουσα στο εσωτερικό τους (HPTS-λιποσώματα) στους 37 oC για διάφορα χρονικά διαστήματα και υπολογίστηκε ο λόγος των τιμών φθορισμού στα 413 nm και τα 454 nm (Ι454/Ι413), που λειτουργεί ως ένδειξη της ενδοκυττάριας εντόπισης των λιποσωμάτων. Με σκοπό να διευκρινιστεί ο εντοπισμός των λιποσωμάτων στα κύτταρα μετά την επώαση τους, τα κύτταρα επωάστηκαν με NH4Cl, που αλκαλοποιεί το όξινο περιβάλλον των υποκυτταρικών διαμερισμάτων, με αποτέλεσμα αύξηση της τιμής φθορισμού στα 454 nm, εφόσον η φθορίζουσα βρίσκεται στα ενδοσώματα (π.χ. λυσοσώματα). Το φαινόμενο αυτό μπορεί να αναστραφεί με απομάκρυνση του NH4Cl. Υπολογίσθηκαν οι λόγοι Ι454/Ι413 πριν και μετά την επώαση τους με NH4Cl, καθώς και μετά από την απομάκρυνση του. Προσδιορίστηκε επίσης το % ποσοστό πρόσληψης αρσονολιποσωμάτων από τα κύτταρα. Η τιμή του φθορισμού στα 413 nm αποτελεί μέτρο της συγκέντρωσης αρσονολιποσωμάτων στα κύτταρα, ανεξάρτητα από το σημείο εντόπισης τους (ανεξάρτητα από το pH). Με σύγκριση των τιμών φθορισμού με πρότυπες καμπύλες αναφοράς προσδιορίστηκε η συγκέντρωση φθορίζουσας σε NB4 και MDA-MB-468 κύτταρα, μετά από επώαση τους με HPTS-λιποσώματα στους 37 oC για διάφορα χρονικά διαστήματα. Οι ίδιες μετρήσεις πραγματοποιήθηκαν και μετά από επώαση NB4 και MDA-MB-468 κυττάρων με τα ίδια HPTS-αρσονολιποσώματα στους 4 oC, με σκοπό να διευκρινιστεί αν ο μηχανισμός αλληλεπίδρασης τους εξαρτάται από την θερμοκρασία, αν είναι δηλαδή ενεργειακά εξαρτώμενη διαδικασία. Για τις μορφολογικές μελέτες που πραγματοποιήθηκαν, προστέθηκε στα λιποσώματα επισημασμένο με φθορίζουσα λιπίδιο στην μεμβράνη τους (ροδαμίνη συζευγμένη με φωσφατιδυλοαιθανολαμίνη, Rho-PE) και η κατανομή των λιποσωμάτων παρατηρήθηκε μικροσκοπικά μετά από επώαση τους στους 37 oC για διάφορα χρονικά διαστήματα με NB4 και MDA-MB-468 κύτταρα. Η επίδραση αναστολέων της ενδοκυττάρωσης μελετήθηκε με επώαση των NB4 και MDA-MB-468 κυττάρων με χλωροπρομαζίνη (CPZ, αναστολέας της ενδοκυττάρωσης μέσω κλαθρίνης) και με μεθυλο-β-κυκλοδεξτρίνη (ΜeβCD, αναστολέας της ενδοκυττάρωσης μέσω caveolae) πριν την επώαση τους με HPTS-λιποσώματα. Προσδιορίστηκαν στην συνέχεια οι λόγοι Ι454/Ι413 και τα % ποσοστά πρόσληψης των αρσονολιποσωμάτων από τα κύτταρα, με σκοπό να διευκρινιστεί ο μηχανισμός της ενδοκυττάρωσης. Όλα τα αρσονολιποσώματα επέδειξαν σχεδόν την ίδια συμπεριφορά σε σχέση με τον τρόπο που αλληλεπιδρούν με τα MDA-MB-468 κύτταρα. Ο κύριος μηχανισμός ενδοκυττάρωσης τους φαίνεται να περιλαμβάνει συμμετοχή υποδοχέων, όπως κλαθρίνη ή/και caveolae. Σε σύγκριση με τα αποτελέσματα των μελετών βιωσιμότητας προκύπτει ότι η έλλειψη τοξικότητας αυτών των αρσονολιποσωμάτων μπορεί να οφείλεται στην αποικοδόμηση τους στο εσωτερικό των λυσοσωμάτων ως φυσικό επακόλουθο της ενδοκυττάρωσης μέσω κλαθρίνης, γεγονός που συμφωνεί και με τον προσδιορισμό αρσενικού που έγινε στα MDA-MB-468 κύτταρα κάτω από τις ίδιες συνθήκες επώασης και ανιχνεύτηκαν ποσοστά αρσενικού μόνο στην περίπτωση των πιο σταθερών DSPC-based λιποσωμάτων (PEGylated και μη). Στην περίπτωση των NB4 κυττάρων, προκύπτει πως η τοξικότητα των αρσονολιποσωμάτων μπορεί να συνδέεται επίσης με το ποσοστό συμμετοχής υποδοχέων, όπως κλαθρίνη ή/και caveolae. Λιποσώματα όπως τα PEGylated PC-based αρσονολιποσώματα (που είναι τα πιο τοξικά), δεν αλληλεπιδρούν καθόλου με τα NB4 κύτταρα μέσω υποδοχέων, ενώ αντίθετα τα PEGylated DSPC-based αρσονολιποσώματα, που αποδείχθηκαν τα λιγότερο τοξικά έναντι των NB4 κυττάρων, φαίνεται να εισέρχονται στα κύτταρα αποκλειστικά μέσω κλαθρίνης ή/και caveolae. Κάτω από τις ίδιες συνθήκες επώασης, δεν ανιχνεύτηκαν παρ’ όλα αυτά ποσοστά αρσενικού στα κύτταρα, γεγονός που θέτει πολλά ερωτηματικά για την ενδοκυττάρια τύχη των αρσονολιποσωμάτων και συγκεκριμένα των αρσονολιπιδίων, δεδομένου ότι γίνεται ενδοκυττάρωση ολόκληρων των λιποσωμάτων αφού «control» (χωρίς αρσενικό) λιποσώματα δεν αποδείχθηκαν τοξικά για τα κύτταρα. Τέλος, με σκοπό να μελετηθεί η βιοκατανομή των αρσονολιποσωμάτων, πραγματοποιήθηκαν in vivo πειράματα. Σε ένα πρώτο σετ πειραμάτων, ενέθηκαν ενδοπεριτοναϊκά (i.p.) DSPC-based και PEGylated DSPC-based αρσονολιποσώματα σε balb-c ποντίκια και η κατανομή του αρσενικού στα διάφορα όργανα 1, 2, 5, 12 και 24 ώρες μετά την χορήγηση μετρήθηκε με Φασματομετρία Ατομικής Απορρόφησης με χρήση φούρνου γραφίτη (GFAAS). Ένα υψηλό ποσοστό της δόσης που χορηγήθηκε αποβλήθηκε ταχέως, καθώς στην πρώτη ώρα μετά την χορήγηση σχεδόν 30-40% της δόσης ανιχνεύθηκε στις ιστούς των ζώων. Από το χρονικό σημείο αυτό και μετά, η απομάκρυνση του αρσενικού ήταν βραδεία με χρόνους ημιζωής 27.6 h για τα PEGylated DSPC-based αρσονολιποσώματα και 83 h για τα DSPC-based. Και για τους δύο τύπους αρσονολιποσωμάτων, η κατανομή αρσενικού ήταν υψηλότερη στα έντερα, μετά στο ήπαρ και μειωνόταν κατά την ακόλουθη σειρά: δέρμα + τρίχωμα, στομάχι, σπλήνα, νεφρά, πνεύμονες και καρδιά. Από τα αποτελέσματα αυτά, αν συγκριθούν με τα αποτελέσματα από παρόμοιες μελέτες που έχουν γίνει με PC-based και PEGylated PC-based αρσονολιποσώματα, φαίνεται πως τα DSPC-based και PEGylated DSPC-based αρσονολιποσώματα χαρακτηρίζονται από καλύτερη βιοδιαθεσιμότητα. Από το γεγονός αυτό γίνεται φανερό πως η λιπιδική σύσταση (και κατ’ επέκταση η σταθερότητα) των λιποσωμάτων επηρεάζει το φαρμακοκινητικό τους προφίλ και συνεπώς, η σωστή επιλογή της λιπιδικής σύστασης των λιποσωμάτων είναι πολύ σημαντική ανάλογα με την εφαρμογή για την οποία προορίζονται τα λιποσώματα. Παρόμοιες in vivo μελέτες πραγματοποιήθηκαν τόσο με DSPC-based και PEGylated DSPC-based, όσο και με PC-based και PEGylated PC-based αρσονολιποσώματα. Τα λιποσώματα χορηγήθηκαν ενδοφλέβια (i.v.) σε balb-c ποντίκια και η κατανομή του αρσενικού στα διάφορα όργανα προσδιορίστηκε με Φασματομετρία Ατομικής Απορρόφησης με χρήση φούρνου γραφίτη (GFAAS) 1, 3 και 24 ώρες μετά την χορήγηση. Στην περίπτωση των DSPC-based, τα επίπεδα αρσενικού στους ιστούς των ζώων ήταν γενικά υψηλότερα συγκριτικά με τα επίπεδα μετά από χορήγηση PC-based αρσονολιποσωμάτων. Η επικάλυψη των λιποσωμάτων με PEG επηρέασε περισσότερο την συμπεριφορά των DSPC-based. Τα PEGylated PC-based αρσονολιποσώματα επέδειξαν παρόμοια συμπεριφορά με τα PEGylated «συμβατικά» (χωρίς αρσενικό) λιποσώματα. Μετά από σύγκριση με τα αποτελέσματα των πειραμάτων με i.p. χορήγηση, προκύπτει πως ο ρόλος της οδού χορήγησης είναι σημαντικός στην κινητική των αρσονολιποσωμάτων, όπως και στην περίπτωση των «συμβατικών» λιποσωμάτων. Ενδιαφέρον παρουσιάζει το γεγονός ότι, μετά από την i.v. χορήγηση, βρέθηκαν ανιχνεύσιμες ποσότητες αρσενικού στον εγκέφαλο, που αποτελεί ένδειξη πως τα αρσονολιποσώματα μπορούν να περάσουν τον αιματεγκεφαλικό φραγμό σε κάποιο ποσοστό, όταν βρίσκονται σε υψηλές συγκεντρώσεις στο αίμα. / In this study we investigated the behavior of arsonolipid containing liposomes, in respect with their lipid composition and its effect on their stability, their interactions with normal and cancer cells and their biodistribution. Sonicated arsonoliposomes were prepared using arsonolipid with palmitic acid acyl chain (Ars), mixed with cholesterol (Chol) and phosphatidylcholine (PC-based arsonoliposomes) or 1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DSPC-based arsonoliposomes), with PC/Ars/Chol and DSPC/Ars/Chol 12:8:10 molar ratio. Arsonoliposomes with PC/Ars/Chol and DSPC/Ars/Chol 17:3:10 molar ratio was also studied. PEG2000-lipid (1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine conjugated to polyethylenoglycol 2000) containing vesicles (PEGylated arsonoliposomes, PC-based and DSPC-based) were also prepared. Sonicated liposomes were also prepared using phosphatidylcholine or 1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphocholine, both mixed with cholesterol, PC/Chol and DSPC/Chol 2:1 molar ratio. The cytotoxicity of these arsonoliposomes towards different cancer cells (human promyelocytic leukemia (NB4), prostatic cancer (PC3), human breast adenocarcinoma (MDA-MB-468), human T-lymphocyte (MT-4) and also towards HUVEC (human umbilical vein endothelial cells) was evaluated by calculating the arsonoliposome-induced growth inhibition of the cells by the MTT assay. IC50 values were interpolated from cell number/arsonolipid concentration curves. The results reveal that all types of arsonoliposomes evaluated significantly inhibit the growth of most of the cancer cells studied (PC3, NB4 and MT-4) with the exception of the MDA-MB-468 breast cancer cells, which were minimally affected by arsonoliposomes in some cases even less than HUVEC. Nevertheless, for the same cell type the differences between the different types of arsonoliposomes were significant but never proportional to their stability, indicating that high rigidity of the arsonoliposome membrane is not a problem for their anticancer activity. Thereby it is concluded that arsonoliposome composition should be adjusted accordingly depending on their in vivo kinetics and the desired biodistribution. The interaction of liposomes with NB4 and MDA-MB-468 cells (cells with minimum and maximum viability after interaction with the arsonoliposomes accordingly) was monitored by a fluorescence method, which allows for the simultaneous monitoring of endocytosis, binding and leakage. Pyranine (1-hydroxypyrene-3,6,8-trisulfonic acid, HPTS), a highly fluorescent, water-soluble, pH sensitive dye, was encapsulated at high concentration into the lumen of liposomes. HPTS exhibits two major fluorescence excitation maxima (403 and 450 nm), which have a complementary pH dependence. The intensity of fluorescence of HPTS at 413 nm (the isosbestic point of HPTS) is pH-independent, while the intensity of fluorescence at 454 nm is pH-dependent. NB4 and MDA-MB-468 cells were incubated at 37 oC with HPTS-encapsulating liposomes for different time periods and the intracellular fate of liposomes was monitored by measuring the fluorescence, at excitation wavelengths of 413 nm and 454 nm and an emission wavelength of 512 nm. The ratio of the fluorescence intensities (Ι454/Ι413) was calculated and evaluated, since it serves as an indicator of liposomes intracellular fate. In order to gain quantitative proof concerning the localization of cell-associated liposomal fluorescence in endosomes or lysosomes of NB4 and MDA-MB-468 cells, after incubation with HPTS-encapsulating liposomes, the cells were incubated with NH4Cl. This results in an increase of pH in the acidic cellular compartments, which would induce an increase in HPTS fluorescence at 454 nm, if the dye is localized in cell endosomes (i.e. lysosomes). This effect can be reversed by removal of NH4Cl. The ratio Ι454/Ι413 was calculated, before and after NH4Cl incubation, as well as after its removal. The % uptake of liposomal contents by cells and their subsequent exposure to acidified endosomes or secondary lysosomes was also monitored. The intensity at 413 nm serves as a measure of total number of liposomes associated with cells, regardless of their location along the endocytotic pathway. The concentration of dye associated with cells was determined by measuring fluorescence at 413 nm (pH independent point) and comparing the results to a standard curve, after incubation of NB4 and MDA-MB-468 cells at 37 oC with HPTS-encapsulating liposomes for different time periods. Fluorescence microscopy studies were performed to visualize the uptake of HPTS-encapsulating arsonoliposomes in NB4 and MDA-MB-468 cells. The intra- and extracellular distribution of Rho-PE-arsonoliposomes (arsonoliposomes with 0,2% rhodamine conjugated with phosphatidyl-ethanolamine in their lipid composition), was observed after incubation with cells at 37 oC for different time periods, by fluorescence microscopy, using appropriate excitation and barrier filters. Furthermore, in another set of experiments, pretreatment of cells with endocytosis inhibitors was performed. Chloropromazine (clathrin mediated endocytosis inhibitor, CPZ) and methyl-β-cyclodextrin (caveolae mediated endocytosis inhibitor, ΜeβCD) were preincubated with cells, HPTS- encapsulating liposomes were added and the Ι454/Ι413 ratio and the % uptake of liposomal contents by cells were measured for different time periods., in order to clarify in which cases the endocytosis is clathrin- or caveolae-dependent. The interaction of liposomes with cells was monitored at 4 oC as well, in order to study the time-course of the binding of liposomes to cells and clarify whether the mechanism of the association of liposomes with cells is energy dependent. NB4 and MDA-MB-468 cells were incubated at 4 oC with HPTS-encapsulating liposomes for different time periods in two different concentrations and the estimation of the intracellular fate and amount of bound liposomes on the cells was once again based on of Ι454/Ι413 ratio and uptake measurements. The mechanism of the association of the liposomes seems to be similar for all arsonoliposomes in the case of MDA-MB-468 cells. The results reveal that arsonoliposomes are uptaken by a receptor-mediated mechanism, probably clathrin- or/and caveolae-mediated. In comparison with the results of the viability studies, the fact that arsonoliposome did not induce growth inhibition of the MDA-MB-468 cells may correlate to their lysosomal degradation resulting from the clathrin-mediated endocytosis. Moreover, the fact that no arsenic was detected by Graphite Furnace Atomic Absorbance Spectrometry in the cells after incubation under the same conditions, except for the more rigid DSPC arsonoliposomes (PEGylated or not), comes in agreement with this previous hypothesis. In the case of NB4 cells, the mechanism of the association and the extent of receptor-mediated endocytosis role may affect the induced growth inhibition. More cytotoxic PEGylated PC-based arsonoliposomes are not endocytosed through receptors at all, while PEGylated DSPC-based seem to be endocytosed through clathrin- or/and caveolae-mediated mechanism. The fact though that no arsenic was detected, after both cancer cell lines were incubated with all arsonoliposomes studied under identical conditions, needs further investigation, given that whole liposomes internalization is taking place and that control liposomes (with no arsenic in their lipid composition) have been found not to be toxic against cancer cells. In order to study the biodistribution of arsonoliposomes, DSPC-based and PEGylated DSPC-based arsonoliposomes, were administered by intraperitoneal (i.p.) injection in balb-c mice and the distribution of arsenic in the organs after 1, 2, 5, 12 and 24h post-injection was measured by atomic absorption spectroscopy. Results demonstrate that a high portion of the dose administered is rapidly excreted, since 1h post-injection only about 30–40% of the dose was detected cumulatively in animal tissues. After this, the whole body elimination of arsenic was a slow process with a half-life of 27.6 h for PEGylated DSPC-based arsonoliposomes, and 83 h for the DSPC-based ones. For both arsonoliposomes, arsenic distribution was greater in intestines, followed by liver, carcass + skin stomach, spleen, kidney, lung and heart. Different arsenic kinetics in blood between the two liposome types was observed. Compared to the results obtained previously with PC-based arsonoliposomes, both the DSPC-based and PEGylated-arsonoliposomes have better bioavailability. This proves that arsonoliposome lipid composition (and consequently their integrity) influences their pharmacokinetic profile. Thus, the proper arsonoliposome composition should be used according to the intended application. The same set of in vivo studies were also performed with DSPC-based and PC-based arsonoliposomes intravenous (i.v.) injection. In all cases PEG-lipid (1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine conjugated to polyethylenoglycol 2000) was also added in the lipid membrane of the arsonoliposomes (PEGylated-arsonoliposomes) at 8 mol %. The liposomes were injected intravenously in balb-c mice. For all arsonoliposome types, the biodistribution of arsenic in mice organs was measured by atomic absorption spectroscopy, at 1, 3 and 24 h post-injection. DSPC-based arsonoliposomes give higher arsenic levels in most tissues (compared to PC-based ones) and are also affected to a higher extent by surface PEGylation. PEGylated DSPC arsonoliposomes behave similarly to PEGylated conventional liposomes that bear anionic charge. By comparison with the previous biodistribution values obtained after intraperitoneal administration of most of the vesicle types studied herein, it is concluded that the administration route has a significant effect on arsonoliposome kinetics, in some ways similar to that observed for conventional liposomes. Interestingly, after i.v. injection of all the arsonoliposome types tested, arsenic was found in detectable amounts in the animal brains, indicating that perhaps arsonoliposomes (intact or not) can pass the brain barrier to a certain extent, when high vesicle concentrations are present in the bloodstream.