Οι αναλύσεις συστατικών του αίματος αποτελούν σημαντική παράμετρο στην κλινική πράξη, επηρεάζοντας τη διάγνωση ασθενειών και το σχεδιασμό κατάλληλων θεραπευτικών αγωγών. Η απομόνωση πλάσματος με χρήση φιαλιδίων συλλογής (vacutainers), που περιέχουν κάποιο αντιπηκτικό, είναι ένα καθημερινό φαινόμενο σε νοσοκομεία και κλινικές. Η μη σωστή επιλογή του κατάλληλου αντιπηκτικού και πρωτοκόλλου επεξεργασίας των δειγμάτων μπορεί να οδηγήσει σε λανθασμένα αποτελέσματα με κόστος χρημάτων και κυρίως κόστος ανθρώπινων ζωών. Επίσης, οι καθιερωμένες σήμερα βiοχημικές εξετάσεις παρέχουν συνήθως μεμονωμένες και όχι ολιστικές μετρήσεις του μεταβολικού/βιοχημικού προτύπου του δότη. Αυτό σημαίνει πως πρέπει συνήθως να ληφθούν πολλά δείγματα ή και μεγάλη σχετικά ποσότητα δείγματος, με καταπόνηση του δότη, και να εφαρμοστούν πολλαπλά πρωτόκολλα διαφορετικής ακρίβειας για τις επιμέρους αναλύσεις. Υπάρχει επομένως αναγκαιότητα για την προτυποποίηση των πρωτοκόλλων συλλογής και χειρισμού των δειγμάτων αίματος στο πλαίσιο ολιστικών μελετών του προτύπου συγκέντρωσης μεταβολιτών του. Με την παρούσα εργασία διερευνάται η τυχόν επίπτωση του αντιπηκτικού και συγκεκριμένα των δύο ευρύτερα χρησιμοποιούμενων στις βιοχημικές αναλύσεις πλάσματος, δηλαδή EDTA και ηπαρίνης, στην μέτρηση του προτύπου συγκέντρωσης των μεταβολιτών μικρού μοριακού βάρους στο πλάσμα αίματος με τη χρήση χρωματογραφίας αερίων – φασματομετρίας μάζας. Για την επίτευξη του στόχου αυτού, αναλύονται και συγκρίνονται τα πρότυπα συγκέντωσης μεταβολιτών στο πλάσμα τριών εθελοντών, που απομονώθηκε (α) σε φιαλίδιο συλλογής αίματος (vacutainer) εσμυρισμένο με ηπαρίνη λιθίου (lithiumheparin) της εταιρείας BD και (β) σε φιαλίδιο falcon που περιέχει 400μL διαλύματος 0,5M EDTA pH 8,0. Τα αποτελέσματα αυτής της ανάλυσης έδειξαν πως το υγρό EDTA επηρέασε την παραγώγιση του εκχυλίσματος των μεταβολιτών, ένα στάδιο που είναι απαραίτητο στη μεταβολομική με χρωματογραφία αερίων – φασματομετρία μάζας και δεν είναι δυνατή η ποσοτική σύγκριση μεταξύ των δύο προτύπων. Όμως, ποιοτική σύγκριση μεταξύ των προτύπων των δειγμάτων στα δύο αντιπηκτικά, έδειξε ότι μετρώνται οι ίδιοι μεταβολίτες, με εξαίρεση την ιδιαίτερα αυξημένη συγκέντρωση της κλειστής μορφής της γλυκόζης στα δείγματα που απομονώθηκαν στο EDTA. Αυτό συνάδει με προηγούμενες μελέτες που ανέφεραν την επίδραση της ηπαρίνης στη μέτρηση της γλυκόζης στο αίμα. Περαιτέρω συγκριτική ανάλυση με τη χρήση εσμυρισμένων φιαλιδίων συλλογής με EDTA και ηπαρίνη, σε διαφορετικούς χρόνους παραμονής του αίματος στο αντιπηκτικό και περισσότερα δείγματα είναι απαραίτητες για την αριστοποίηση των πρωτόκολλων συλλογής δειγμάτων πλάσματος και ορού για μεταβολομικές και πρωτεωμικές αναλύσεις. / Blood tests constitute an important part of clinical practice, contributing significantly to disease diagnosis and the design of appropriate therapeutic treatments. Plasmaisolationusingcollection tubescontaining a specific anticoagulant, aka vacutainers, isa regular procedure taking place multiple times per day in hospitals and medical clinics. Erroneous selection of the appropriate anticoagulant, as well as the sample collection and handling protocol may lead to inaccurate measurementswith negative financial consequences, but mainly to the medical care of the patients. Moreover, current standard biochemical tests usually measure individual biochemical parametersand not the holistic metabolic and biochemical profile of the patient. This may mean multiple collections of relatively large volumes of blood samples from the subjects,while various analytical protocols of different accuracy have to be followed. Therefore, there is a need for the standardization of the protocols for the collection and handling of blood samples in the context of holistic analyses of its metabolite concentration profile. The present study aims at investigating the effect of anticoagulants, and more specifically of the two more widely used in biochemical analysis of blood plasma, EDTA and heparin, on the measurement of the concentration profile of low molecular weight metabolites in the blood plasma, using gas chromatography - mass spectrometry (GC-MS). To achieve this objective, the plasma metabolite concentration profilesof three donors were measured after plasma isolation in (a) BD lithium heparin glass vacutainers and (b) falcon tubes containing 400mL of n 0.5 M EDTA pH 8.0 solution. The results of this analysis showed that the liquid EDTA influenced the derivatization of metabolite extract, derivatization being a necessary step in GC-MS metabolomic analysis. Thus, the obtained metabolic profiles of plasma from isolation in EDTA and heparin cannot be quantitatively compared. However, a qualitative comparison between indicated that the same metabolites can be quantified in the two profiles. The only major difference was the observed high concentration of glucose in the form of glucopyranose in the plasma samples from the EDTA isolation compared to those isolated in heparin. This observation is consistent with previous studies that have reported the negative effect of heparin isolation on the measurement of plasma glucose. Further comparative analysis between the two isolation protocols using glass vacutainersfor both coagulants investigating also the effect of the duration of the isolation protocol in a larger number of samplesis necessary for optimizing the plasma and serumsamples collection protocols for metabolomics and proteomic analyses.

Στην παρούσα εργασία, για πρώτη φορά, τίθεται η πιο πρόσφατη εισαχθείσα τεχνολογία των –omics, η μεταβολομική, στην υπηρεσία της μοριακής βιολογίας για την μελέτη της θερμοκρασιακής μεταβολικής πλαστικότητας. Με τον όρο θερμοκρασιακή μεταβολική πλαστικότητα αναφερόμαστε στην ιδιότητα ενός γονότυπου να παράγει ποικίλους φαινότυπους σε επίπεδο μεταβολισμού, ως απόκριση στις θερμοκρασιακές συνθήκες στις οποίες υπόκειται. Σκοπός, λοιπόν της παρούσας ερευνητικής εργασίας ήταν η μελέτη της επίδρασης της πρώιμης θερμοκρασίας ανάπτυξης στο μεταβολικό πρότυπο ενήλικων θηλυκών και αρσενικών zebrafish σε γονάδες, εγκέφαλο και μυϊκό ιστό. Στα πλαίσια του σκοπού αυτού, τρεις πληθυσμοί zebrafish τοποθετήθηκαν στους 22οC, 28οC και 32οC από 0-20 ημερών, κατά την 20η ημέρα και οι τρεις πληθυσμοί αναπτύχθηκαν σε κοινή θερμοκρασία 28οC μέχρι την πάροδο εφτά μηνών, οπότε και πραγματοποιήθηκε δειγματοληψία. Ακολούθησε η ανάκτηση των μεταβολικών προτύπων, μετά την αριστοποίηση του πρωτοκόλλου για κάθε ιστό, χρησιμοποιώντας αέριο χρωματογράφο-φασματόμετρο μάζας. Τα αποτελέσματα της πολυπαραμετρικής στατιστικής ανάλυσης έδειξαν να μη διαφαίνεται θερμοκρασιακή μεταβολική πλαστικότητα στις γονάδες και στο μυϊκό ιστό, μιας και η ομαδοποίηση των μεταβολικών προτύπων έγινε ως προς το φύλο. Συγκεκριμένα και στις δυο κατηγορίες ιστών παρατηρήθηκε μεγάλη μείωση της μεταβολικής ενεργότητας στα θηλυκά ως προς τα αρσενικά zebrafish. Εξαιρετικής σημασίας, όμως, είναι το γεγονός ότι, για πρώτη φορά, αποδείχθηκε η επίδραση της πρώιμης θερμοκρασίας ανάπτυξης, στο μεταβολικό πρότυπο ενήλικων θηλυκών και αρσενικών zebrafish μέσω της δραματικής μείωσης της ενεργότητας του κεντρικού μεταβολισμού των εγκεφάλων 22ο C και 32ο C ως προς τους 28ο C. / With the term temperature induced metabolic plasticity one refers to the feature of genotype to produce different phenotypes on a metabolic level, due to the temperature conditions of its environment. The aim of this thesis is to study the effect of temperature on the metabolic profile during the early growth stage of adult male and female zebrafish in three tissues: gonads, brain and muscle. For this end three populations of zebrafish were bread at 22οC, 28οC and 32οC from 0 to 20 post-fertilization (pf) days. After the 20th pf day all populations were bread at 28οC for seven months. The metabolic profiles of all tissues were acquired using gas chromatography-mass spectrometry; in this thesis the protocol of metabolic profile acquisition was optimized for each tissue separately. Multivariate statistical analysis of the profiles showed no temperature plasticity in gonads and muscles. However, for the first time worldwide it was shown temperature induced plasticity in the brains metabolism of adult male and female zebrafish. Characteristically, a decline of the metabolic activity was observed in the 22ο C and 32ο C grown zebrafish compared to the 28ο C grown.

Στην εποχή της συστημικής βιολογίας, οι υψηλής απόδοσης (-ομικές) τεχνικές βιομοριακής ανάλυσης επέτρεψαν την ολιστική ανάλυση των διαφόρων μοριακών επιπέδων κυτταρικής λειτουργίας μέσω της ταυτόχρονης μέτρησης εκατοντάδων έως χιλιάδων αντιπροσωπευτικών μοριακών ποσοτήτων. Η μεταβολομική αναφέρεται στην ποσοτικοποίηση του (σχετικού) προτύπου συγκέντρωσης των ελεύθερων μικρών μεταβολιτών. Λαμβάνοντας υπ’ όψιν, το ρόλο των μεταβολιτών ως, αντιδρώντα ή/και προϊόντα των μεταβολικών αντιδράσεων, το πρότυπο συγκέντρωσης τους επηρεάζει και επηρεάζεται από την κατανομή των μεταβολικών ροών, αποτελώντας επομένως ένα αποτύπωμα της μεταβολικής κατάστασης ενός βιολογικού συστήματος. Μεταξύ των πλεονεκτημάτων της μεταβολομικής ανάλυσης είναι ότι μπορεί να χρησιμοποιηθεί σε μεταβαλλόμενη κατάσταση φυσιολογίας, ενώ δεν απαιτεί ολοκληρωμένη γνώση του μεταβολικού δικτύου ενός οργανισμού. Αυτά τα χαρακτηριστικά είναι ιδιαίτερα πλεονεκτικά για τη μελέτη της μεταβολικής ενεργότητας του εγκεφάλου, λαμβάνοντας υπ’όψιν την ανατομική, μορφολογική και φαινοτυπική πολυπλοκότητα αυτού του οργάνου και την έως τώρα κατανόηση των μεταβολικών του μηχανισμών. Πιο συγκεκριμένα για την επίδραση του ενήλικου υποθυρεοειδισμού στον μεταβολισμό του εγκεφάλου, η μέχρι σήμερα γνώση παραμένει αποσπασματική, ενώ προέρχεται από διαφορετικά πειράματα και διάφορες εγκεφαλικές περιοχές. Μια ολιστική θεώρηση του μεταβολισμού σε συνθήκες υποθυρεοειδισμού σε συγκεκριμένες εγκεφαλικές περιοχές αναμένεται να αυξήσει σημαντικά τη γνώση μας για την ασθένεια αυτή. Σε μια πρόσφατη μελέτη της ερευνητικής μας ομάδας, που ήταν η πρώτη μεταβολική ανάλυση εγκεφαλικού ιστού σε ζωικό μοντέλο μακρόχρονου υποθυρεοειδισμού, η πολυπαραμετρική στατιστική ανάλυση των μεταβολικών προτύπων της παρεγκεφαλίδας μυός έδειξε διαφορές στη μεταβολική φυσιολογία του ιστού στα ευ- σε σχέση με τα υποθυρεοειδικά ζώα, παρέχοντας ισχυρές ενδείξεις ότι ο μεταβολισμός της παρεγκεφαλίδας θηλαστικών επηρρεάζεται από τον μακρόχρονο υποθυρεοειδισμό. Στην παρούσα εργασία, συγκρίθηκε η επίδραση του μακρόχρονου υποθυρεοειδισμού στη μεταβολική φυσιολογία της παρεγκεφαλίδας μεταξύ αρσενικών και θηλυκών Balb/cJ μυών, αφού επεκτάθηκε για επιπλέον μεταβολίτες η αυτοματοποιημένη μέθοδος προσδιορισμού κορυφών στο χρωματογράφημα. Ο μακρόχρονος υποθυρεοειδισμός επήχθη με χορήγηση 1% υπερχλωρικού καλλίου για 64 μέρες στο πόσιμο νερό των ζώων. Αυτή είναι και η πρώτη μελέτη της επίδρασης του ενήλικου υποθυρεοειδισμού στην μεταβολομική φυσιολογία του 4 εγκεφάλου των θηλυκών μυών. Τα μεταβολικά πρότυπα αναλύθηκαν με το λογισμικό ανοικτού κώδικα ΤΜ4/ MEV(www.tm4.org/MEV) για την πολυπαραμετρική στατιστική ανάλυση των -ομικών δεδομένων. Τα αποτελέσματα συζητήθηκαν στο πλαίσιο ενός κατάλληλα ανακατασκευασμένου μεταβολικού δικτύου για την παρεγκεφαλίδα μυός με βάση τις μεταβολικές βάσεις δεδομένων KEGG και EXPASY και δεδομένα από τη βιβλιογραφία. Η ανάλυση των προτύπων έδειξε ότι η επίδραση της δίμηνης χορήγησης υπερχλωρικού καλλίου στη μεταβολική φυσιολογία της παρεγκεφαλίδας ήταν πιο οξεία στα αρσενικά απ’ότι στα θηλυκά ζώα. Αυτή η παρατήρηση υποστηριζόταν και απο την σημαντικά μικρότερη μείωση του μέσου βάρους των υποθυρεοειδικών σε σχέση με αυτό των ευθυρεοειδικών ζώων στο τέλος της δίμηνης χορήγησης στα θηλυκά σε σχέση με τα αρσενικά. Τέος, σύγκριση των μεταβολικών προτύπων της παρεγκεφαλίδας των ευθυρεοειδικών αρσενικών και θηλυκών μυών έδειξε τους μισούς από τους μεταβολίτες στην παρεγκεφαλίδα των αρσενικών να έχουν σημαντικά μεγαλύτερη συγκέντρωση απ’ ότι στον ιστό των θηλυκών. Αυτή η παρατήρηση καταδεικνύει την ανάγκη της παρεγκεφαλίδας των θηλυκών σε μικρότερες συγκεντρώσεις ελεύθερων μικρών μεταβολιτών για την εύρυθμη λειτουργία της ως ένα πιθανό παράγοντα «προστασίας» του μεταβολισμού της από την επίδραση του μακρόχρονου ενήλικου υποθυρεοειδισμού. Καθώς η παρεγκεφαλίδα των αρσενικών χρειάζεται μεγαλύτερες ποσότητες ελεύθερων μικρών μεταβολιτών, η αναμενώμενη μείωση της συγκέντρωσης των μεταβολιτών που λαμβάνει ο εγκέφαλος μέσω του αιματοεγκεφαλικού φραγμού λόγω του υποθυρεοειδισμού θα την επηρεάσει πιο γρήγορα και πιο δραστικά από αυτή των θηλυκών. Αυτές οι σημαντικές παρατηρήσεις χρειάζονται περαιτέρω διερεύνηση μέσω κατάλληλα σχεδιασμένων αναλύσεων μεταβολομικής και φυσιολογίας και άλλων εγκεφαλικών περιοχών, συνδυάζοντας επίσης μετρήσεις των επιπέδων των θυρεοειδικών ορμονών με μεταβολομική ανάλυση του εγκεφαλικού ιστού με Υγρή Χρωματογραφία- Φασματομετρίας Μάζας, καθώς και μετρήσεις ομικών αναλύσεων από άλλα επίπεδα κυτταρικής λειτουργίας, κυρίως της πρωτεωμικής. / In the systems biology era, the high-throughput “omic” technologies have enabled the holistic analysis of the various molecular levels of cellular function through the simultaneous measurement of hundreds to thousands of relevant molecular quantities. Metabolomics refers to the quantification of the (relative) concentration profile of the free small metabolites. Taking into consideration the role of the metabolites as reactants and products of the metabolic reactions, their concentration profile affects and is affected by the metabolic pathway flux distribution. Thus, the metabolic profile provides a fingerprint of the metabolic state of a biological system. Among the advantages of the metabolomic analysis is that it can be easily used to monitor transient metabolic conditions without requiring extensive knowledge of the structure and regulation of the investigated metabolic networks. This characteristic is especially advantageous for the analysis of brain metabolism, considering the anatomical, morphological and phenotypic complexity of this organ and our current shortages in understanding its metabolic mechanisms. For the effect of adult onset hypothyroidism (AOH) on brain metabolism in particular, the current knowledge remains fragmented, concerning different experimental setups and recovered from various brain regions. A holistic view of metabolism under AOH in particular brain regions is expected to significantly enhance the current knowledge about the disease. In a recent study of our group, which was the first metabolomic analysis of brain tissue in a prolonged AOH mouse model, multivariate statistical analysis of the metabolic profiles of the mouse cerebella indicated differences in the metabolic physiology of the tissue in the eu- compared to the hypo- thyroid animals, providing strong evidence that the mammalian cerebellum is metabolically responsive to prolonged AOH. In the present work, we compared the effect of prolonged AOH on the cerebellar metabolic physiology between male and female Balb/cJ mice, after enhancing the metabolite peak identification method to include additional metabolites. The prolonged AOH was induced by a 64-day treatment with 1% potassium perchlorate in the drinking water of the animals. This is the first reported analysis of the effect of AOH on the brain metabolic physiology of female mice. The raw metabolic profiles were normalized and appropriately filtered. The normalized metabolic profiles were analyzed using the open-source TM4/MeV software (www.tm4.org/MeV) for the multivariate statistical analysis of “omic” data. The acquired results were interpreted in the context of an appropriately reconstructed metabolic network for the mouse cerebellum based on the metabolic databases, KEGG and Expasy, and a plethora of information mined from the literature. The analysis of the metabolic profiles 6 indicated that the effect of the 2-month potassium perchlorate treatment on the metabolic physiology of the cerebellum is more acute in the male with respect to the female mice. The time profile of the body weight of the female compared to the male mice indicated a significantly smaller decrease in the mean weight of the hypothyroid compared to the euthyroid mice in the female compared to the male population at the end of the KClO4 treatment, an observation that further supports the metabolic profiling results. Finally, comparison between the metabolic profiles of the euthyroid male and female cerebellum indicated a significantly higher concentration in half of the measured free metabolites in the male compared to the female animals. This indicates the “leanness” of the metabolic profile of the female cerebellum as a potential “protective” parameter to the effect of AOH on its metabolic physiology, in the sense that the expected due to AOH decrease in the concentrations of the metabolites that are transferred to the brain through the blood brain barrier may affect more the male cerebellum that requires higher levels of free metabolites for its regular activity. These significant observations are in need of further investigation through appropriately designed physiological and metabolomic studies, integrating also thyroid hormone measurements from Liquid Chromatography-MS metabolomic analysis of brain tissue as well as omic measurements from other molecular levels of cellular function, mainly from proteomics.

Το οξειδωτικό στρες θεωρείται ότι διαδραματίζει σημαντικό ρόλο στη παθογένεση πολλών εκφυλιστικών νόσων, όπως τα καρδιαγγειακά νοσήματα, ο καρκίνος και οι νευροεκφυλιστικές διαταραχές. Πολλές μελέτες μέχρι τώρα έχουν δείξει τη σημαντική επίδραση της διατροφής στην εξουδετέρωση των ελευθέρων ριζών. Η Ελληνική χλωρίδα είναι πλούσια σε πηγές φυσικών αντιοξειδωτικών, στις οποίες ανήκουν και τα φυτά του γένους Sideritis. Στόχος της παρούσας μελέτης ήταν να διερευνηθεί η επίδραση της πόσης, για 40 ημέρες, ενός αφεψήματος (4% κ.ό.), που παραδοσιακά καταναλώνεται στην Ελλάδα, του είδους Sideritis clandestina subsp. cyllenea, σε βιοχημικές παραμέτρους εγκεφαλικών περιοχών ενηλίκων μυών. Το ανωτέρω φυτό, που φύεται στα βουνά της Β. Πελοποννήσου, επιλέχθηκε μετά από προσδιορισμό της πολυφαινολικής σύστασης και των αντιοξειδωτικών ιδιοτήτων υδατικών εκχυλισμάτων από διάφορους πληθυσμούς του είδους Sideritis clandestina. Η αντιοξειδωτική ικανότητα των εγκεφαλικών περιοχών στα ζώα-μάρτυρες παρουσίασε διαφορές (φλοιός>παρεγκεφαλίδα>μεσεγκέφαλος). Η κατανάλωση του αφεψήματος μετέβαλε την αντιοξειδωτική ικανότητα των εγκεφαλικών περιοχών με ιστοειδικό τρόπο. Ο φλοιός και η παρεγκεφαλίδα επιλέχθηκαν για περαιτέρω μελέτη βιοχημικών παραμέτρων αυτών, με ανάλυση του μεταβολικού τους προφίλ, μεταβολομική, πριν και μετά την κατανάλωση του αφεψήματος, με τη χρήση αέριας χρωματογραφίας-φασματομετρίας μάζας (GCMS). Από την ανάλυση αυτή ταυτοποιήθηκαν μέχρι τώρα αρκετοί μεταβολίτες, η βιοχημική αξία των οποίων είναι σημαντική. Τα ανωτέρω αποτελέσματα υποδεικνύουν ότι η πόση του αφεψήματος επηρεάζει τις εγκεφαλικές λειτουργίες, παρατήρηση που χρήζει περαιτέρω διερεύνηση. / Oxidative stress is considered to play a pivotal role in the pathogenesis of many degenerative diseases, such as cardiovascular disease, cancer and neurodegenerative disorders. Until recently many studies have shown the important effect of diet in the destruction of free radicals. Hellenic flora is very rich in sources of natural antioxidants, including the plants of the genus Sideritis. The aim of this study was to investigate the effect of consumption for 40 days, of a beverage (4% w/v) that is traditionally consumed in Greece, of species Sideritis clandestina subsp. cyllenea, on biochemical parameters of adult mice brain regions. This plant that grows on the mountains of North Peloponnesus was chosen after determination of the polyphenolic content and the antioxidant properties of water extracts of various Sideritis clandestina populations. The antioxidant activity of the brain areas of the control mice differed (cerebral cortex>cerebellum>midbrain). The consumption of the beverage altered the antioxidant activity of the brain regions in a tissue-specific manner. The cerebral cortex and cerebellum were chosen for further study of their biochemical parameters, analyzing their metabolic profile, (metabolomics) before and after the beverage consumption, using a gas chromatography-mass spectrometry (GCMS) technology. Many metabolites, of high biochemical value, have identified with that analysis, until now. Consequently, the above results indicate that the consumption of this beverage can influence various brain functions, an observation that needs further delineation.

Η ενδοκυττάρια έγχυση σπέρματος (ICSI) εισήχθη ως μέθοδος υποβοηθούμενης αναπαραγωγής (ΑRT) κυρίως για την αντιμετώπιση της ανδρικής στειρότητας. Όμως, λόγω των υψηλών ποσοστών επιτυχίας, και παρά τις αυξανόμενες ανησυχίες για τους κινδύνους από τη σημαντική ανθρώπινη παρεμβολή στο γονιδίωμα, το επιγονιδίωμα και την ανάπτυξη των παιδιών, προτιμάται ακόμα και σε περιπτώσεις όπου δεν απαιτείται ιατρικά. Από τις λίγες σήμερα συστηματικές μελέτες παιδιών από ART, καταγράφεται αυξημένο ποσοστό προδιάθεσης τους σε ασθένειες που σχετίζονται με κακό καρδιομεταβολικό πρότυπο στην ενήλικη ζωή. Στόχος της εργασίας ήταν η διερεύνηση της δυνατότητας χρήσης της μεταβολομικής ανάλυσης για τον πρώϊμο και έγκυρο προσδιορισμό σχετικών διαταραχών σε δείγματα πλάσματος προεφηβικών κοριτσιών και αγοριών από ΙCSI, που επιλέχτηκαν από ένα συστηματικά χαρακτηρισμένο σύνολο παιδιών μελέτης της Α’ Παιδιατρικής Κλινικής, Νοσοκομείου «Αγία Σοφία», Ιατρικής Σχολής, ΕΚΠΑ. ΥΛΙΚΑ ΚΑΙ ΜΕΘΟΔΟΙ: Τα μεταβολικά πρότυπα πλάσματος (α) 10 κοριτσιών από ΙCSI και 10 από φυσιολογική γονιμοποίηση (NC) και (β) 16 αγοριών από ΙCSI και 16 από NC ποσοτικοποιήθηκαν με χρωματογραφία αερίων – φασματομετρία μάζας (GC-MS). Μετά από την ταυτοποίηση κορυφών και την κατάλληλη κανονικοποίηση των προτύπων, 86 πρότυπα 70 μεταβολιτών στα κορίτσια και 92 πρότυπα 80 μεταβολιτών στα αγόρια αναλύθηκαν ξεχωριστά, και συγκριτικά με αλγορίθμους πολυπαραμετρικής στατιστικής ανάλυσης των λογισμικών TM4-MeV (v.4.9.0), και ΧLSTAT (v.2013.4.03). Οι διαφορές στο πρότυπο σύστασης του πλάσματος σε μικρού μεγέθους μεταβολίτες μεταξύ των ΙCSI και ΝC ομάδων σε κορίτσια και αγόρια και μεταξύ των δύο φύλων οπτικοποιήθηκαν σε κατάλληλα ανακατασκευασμένο από τη βιβλιογραφία και σχετικές βάσεις δεδομένων μεταβολικό δίκτυο πολλών ιστών. ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ: Στα κορίτσια, ο αλγόριθμος μερικών ελαχίστων τετραγώνων-διακριτής ανάλυσης (PLS-DA) κατέδειξε σαφή διαχωρισμό των μεταβολικών πρoτύπων μεταξύ των ομάδων ΙCSI και NC. Ο διαχωρισμός αυξάνεται με το συνυπολογισμό των βιοχημικών μετρήσεων. Στα αγόρια, η PLS-DA των μεταβολικών ή και βιοχημικών προτύπων κατέδειξε επίσης διαχωρισμό, αν και μικρότερο, σε σχέση με κορίτσια. Η ανάλυση σημαντικότητας για μικροσυστοιχίες (SAM), που ενδείκνυται για την ανάλυση ομικών δεδομένων, ανέδειξε 37 από τους 70 μεταβολίτες που αναλύθηκαν στα κορίτσια με σημαντικά διαφορετική συγκέντρωση μεταξύ των ΙCSI και ΝC ομάδων, με 34 από αυτούς να αυξάνονται στην ICSI ομάδα. Οι 34 μεταβολίτες αφορούν κύρια σε σάκχαρα, αλκοόλες και οξέα σακχάρων, οργανικά οξέα και λιπίδια, που έχουν συνδεθεί με αντίσταση στην ινσουλίνη, μεταβολικό σύνδρομο, ή/και την παχυσαρκία. Η ίδια ανάλυση στα αγόρια ανέδειξε 25 από τους 80 μεταβολίτες που αναλύθηκαν με χαρακτηριστική διαφορά μεταξύ των ομάδων ICSI και NC, εκ των οποίων 9 με σημαντικά μικρότερη συγκέντρωση στην ομάδα ΙCSI. Χαρακτηριστικά αναφέρεται ότι στους 9 μεταβολίτες ανήκουν οι 4 με την πλέον διαφορετική συγκέντρωση μεταξύ των ICSI και NC ομάδων, που είναι η σορβιτόλη, και τα αρωματικά αμινοξέα τρυπτοφάνη, φαινυλαλανίνη και τυροσίνη. Συγκριτική ανάλυση του μεταβολικού προτύπου των δύο φύλων στην NC ομάδα κατέδειξε μια σαφή διαφοροποίηση, η οποία φαίνεται να αποτελεί κύρια αιτία της παρατηρούμενης φυλο-ειδικής μεταβολικής διαφοροποίησης μεταξύ των ομάδων ICSI και ΝC. ΣΥΜΠΕΡΑΣΜΑΤΑ: Η πολυπαραμετρική ανάλυση της σύστασης του πλάσματος σε μικρού μοριακού βάρους μεταβολίτες επέτρεψε τον προσδιορισμό μεταβολικών διαφορών μεταξύ των ομάδων ICSI και NC, που υποστηρίζουν την προδιάθεση των παιδιών από ICSI σε αντίσταση στην ινσουλίνη, με διακριτούς όμως μεταβολικούς και βιοχημικούς δείκτες μεταξύ των δύο φύλων. Τα ευρήματα αυτά πρέπει να επιβεβαιωθούν σε ένα ευρύτερο σύνολο παιδιών και των δύο φύλων. Καταδεικνύουν όμως την αξία της μεταβολομικής να παρέχει μία υψηλής ευκρίνειας προοπτική της μεταβολικής κατάστασης, οδηγώντας στον προσδιορισμό χαρακτηριστικών μεταβολικών προτύπων ακόμα και σε πολύπλοκες καταστάσεις φυσιολογίας. / The intracytoplasmic sperm injection (ICSI) method was introduced in artificial reproduction technology (ART) mainly to treat male infertility. However, due to its high success rates and despite the growing concerns concerning the risk that the significant human intervention associated with this method may have to the genome, epigenome and development of the offspring, the use of ICSI has gradually increased in the recent years, even when it is not medically required. Based on the few currently available systematic studies of ART conceived children, the latter are considered of higher risk for cardio-metabolic diseases as adults. The goal of the present study is to investigate whether metabolomic analysis of the blood plasma could contribute to the early and accurate determination of relevant predisposition in ICSI conceived prepubertal girls and boys, specifically selected from a systematically characterized group of children, participated in a study of the First Department of Pediatrics of the “Agia Sophia” Hospital, Medical School, University of Athens. MATERIALS AND METHODS: The blood plasma metabolic profiles of (a) 10 ICSI- and 10 naturally conceived (NC) girls and (b) 16 ICSI and 16 NC boys were acquired using gas chromatography-mass spectrometry. After peak identification and appropriate normalization, 86 profiles of 70 metabolites in girls and 92 profiles of 80 metabolites in boys were analyzed separately and comparatively using multivariate statistical analysis algorithms of TM4-MeV (v.4.9.0) and XLSTAT (v.2013.4.03) software. The differences in the plasma metabolite concentration profiles between the ICSI and NC groups in girls and boys were visualized in an inter-tissue metabolic network that was reconstructed based on relevant literature and metabolic databases. RESULTS: For the girls, the algorithm of partial least squares-discriminant analysis (PLS-DA) indicated a clear differentiation of the metabolic profiles between the ICSI and NC groups. The discrimination is more pronounced, when biochemical data are also considered. For the boys also, PLS-DA indicated separation between the metabolomic profiles of the two groups analyzed individually or in combination with the biochemical data, but not as explicit as in girls. Significance analysis for microarrays (SAM) determined 37 out of the 70 analyzed metabolites in the plasma profiles of the girls with significantly different concentration between the ICSI and the NC groups; 34 of these were of higher concentration in the ICSI group. The 34 metabolites include mainly sugars, sugar alcohols and acids, organic acids and lipids that have been associated with insulin resistance, metabolic syndrome and/or obesity. The same analysis in the plasma profiles of the boys determined 25 out of the 80 analyzed metabolites with significant difference between the ICSI and NC groups; nine of these were of significantly lower concentration in the ICSI group. It is underlined that the four most discriminatory metabolites between the ICSI and NC groups, i.e. sorbitol and the aromatic amino acids tryptophan, phenylalanine and tyrosine, are among the nine negatively significant. Comparative analysis of the metabolic profiles between the two sexes within the NC group indicated an unequivocal differentiation, which is considered to be the main cause of the observed sex-specific metabolic differences between the ICSI and NC groups. CONCLUSIONS: The multivariate statistical analysis of blood plasma metabolite profiles enabled the determination of sex-specific metabolic differences between the ICSI and NC groups; these differences support increased predisposition to insulin resistance for the ICSI offspring, with clearly different, however, metabolic and biochemical markers in the two sexes. These findings need to be confirmed in a wider group of children. They demonstrate, however, the value of metabolomics to provide a high-resolution perspective of the metabolic state, leading to the determination of characteristic metabolic profiles even in complex physiological conditions.

Στην μετα-γονιδιωματική εποχή, την εποχή της συστημικής βιολογίας, η κατανόηση της πολυπλοκότητας της κυτταρικής φυσιολογίας απαιτεί την ανάλυση της δυναμικής των δικτύων βιομοριακών αλληλεπιδράσεων σε όλα τα μοριακά επίπεδα κυτταρικής λειτουργίας. Με τη σειρά της, η λειτουργική γονιδιωματική, ένας θεμελιώδης λίθος της συστημικής βιολογίας, στοχεύει στον πολυδιάστατο χαρακτηρισμό ενός γονιδίου, συνδυάζοντας δεδομένα από τις τεχνολογίες υψηλής απόδοσης. Είναι αυτή ακριβώς η ενοποίηση όλων των μοριακών προτύπων για ένα διαταραγμένο βιολογικό σύστημα που μπορεί να δώσει πληροφορίες αναφορικά με την λειτουργία ενός αγνώστου γονιδίου. Στο πλαίσιο αυτό, η παρούσα Διπλωματική Εργασία αποτελεί μέρος της ολιστικής λειτουργικής ανάλυσης δύο αλληλεπιδρώντων, αγνώστου βιολογικού ρόλου, πρωτεϊνών, της DGCR14 και της FRA10AC1, οι οποίες έχουν απομονωθεί ως συστατικά του σωματιδίου συναρμογής και έχουν συσχετιστεί με νευρολογικές ασθένειες. Η παρούσα εργασία επικεντρώνεται στην μεταβολομική μελέτη των μοριακών επιπτώσεων της υπερέκφρασης της DGCR14 σε ένα ανθρώπινο κυτταρικό μοντέλο, τα κύτταρα HeLa, με την χρήση της αέριας χρωματογραφίας - φασματομετρία μάζας. Ωστόσο, για να επιτευχθεί αυτό, θέματα σχετικά με τις δυνατότητες ποσοτικοποίησης των πολυβηματικών ομικών αναλύσεων έπρεπε να επιλυθούν. Μια σημαντική παράμετρος αφορά στην γρήγορη αδρανοποίηση των ενζυματικών διεργασιών έτσι ώστε οι αποκτηθέντες μετρήσεις να αντικατοπτρίζουν την πραγματική κυτταρική φυσιολογία. Για τον σκοπό αυτό, ο πειραματικός σχεδιασμός πρέπει να τροποποιείται κατάλληλα έτσι ώστε οποιεσδήποτε απαιτούμενες προ-αναλυτικές διαδικασίες χειρισμού των κυττάρων να έχουν ελάχιστη επίδραση στην φυσιολογία τους. Μελετήσαμε συνεπώς την επίδραση τεσσάρων πρωτοκόλλων συλλογής προσκολλημένων κυττάρων και δύο διαφορετικών διαλυμάτων έκπλυσης στο μεταβολικό πρότυπο κυττάρων HeLa. Τα μεταβολομικά δεδομένα αξιολογήθηκαν στο πλαίσιο της καρκινικής μεταβολικής φυσιολογίας και το πρωτόκολλο με την ελάχιστη δυνατή επίδραση στην κυτταρική φυσιολογία καθορίστηκε. Μεταξύ των αποτελεσμάτων αυτής της μελέτης, πολύτιμες πληροφορίες σχετικά με την μεταβολική φυσιολογία των αθανατοποιημένων κυτταρικών σειρών προέκυψαν, οι οποίες ενίσχυσαν σημαντικά την υπάρχουσα γνώση γύρω από τον καρκινικό μεταβολισμό, σε σταθερές ή μεταβαλλόμενες περιβαλλοντικές συνθήκες. Επακόλουθα, η βελτιστοποίηση της διαδικασίας συλλογής είχε ως αποτέλεσμα την δημιουργία ενός αντιπροσωπευτικού μεταβολικού προτύπου κυττάρων HeLa πάνω στο οποίο πραγματοποιήθηκε η αξιολόγηση της υπερέκφρασης της πρωτεΐνης DGCR14 χωρίς να επισκιάζεται από πειραματικές αποκλίσεις εισαγόμενες από την διαδικασία χειρισμού των κυττάρων. Αναφορικά με τα κύτταρα που υπερεκφράζουν την DGCR14, η μεταβολομική ανάλυση εντόπισε μια αλλαγή φυσιολογίας συνδεόμενη με συγκεκριμένα μεταβολικά μονοπάτια τα οποία υποδηλώνουν έντονο μεταβολικό στρες. Για να διερευνήσουμε την συσχέτιση της υπερέκφρασης της DGCR14 με τον παραπάνω μεταβολικό φαινότυπο, χρησιμοποιήσαμε το ανακατασκευασμένο δίκτυο πρωτεϊνικών αλληλεπιδράσεων του σωματιδίου συναρμογής στον άνθρωπο και το δίκτυο πρωτεϊνικών αλληλεπιδράσεων στον άνθρωπο από την μετα-βάση δεδομένων PICKLE, προκειμένου να αντλήσουμε επιπλέον πληροφορίες για τον ρόλο της DGCR14 βάσει της θέσης της σε σχέση με άλλους κόμβους και υπερ-κόμβους. Μια πιθανή λειτουργική συσχέτιση της DGCR14 με αυτοφαγικούς και λυσοσωμικούς μηχανισμούς βρέθηκε, η οποία θα αξιολογηθεί και μελλοντικά μέσω της ανάλυσης, ξεχωριστά και συνδυαστικά, των μοριακών συνεπειών της υπερ- και υπο-έκφρασης σε όλα τα μοριακά επίπεδα κυτταρικής λειτουργίας. / In the post-genomic, systems biology era, developing a systems level understanding of a physiological process requires the analysis of biomolecular network dynamics at all molecular levels of cellular function. Likewise, functional genomics, an essential foundation of systems biology research, aims to define and analyze gene function at a global level by integrating data obtained from multiple high-throughput technologies. It is the integration of all the molecular profiles for a systematically perturbed system that can provide insight about the function of unknown genes. Along these lines, the present study is part of the systematic functional analysis of two interacting, but yet of unknown biological role, spliceosomal proteins, DGCR14 and FRA10AC1, that have both been implicated in neurological diseases. The present work focuses on studying the molecular consequences of DGCR14 overexpression in a human cell model, HeLa cells, at the metabolic level using Gas Chromatography-(ion trap) Mass Spectrometry. However, to succeed in this, issues regarding the quantification capabilities of the multistep omic analysis procedures needed to be resolved. A major concern refers to the fast quenching of any enzymatic processes, so that the acquired measurements indeed reflect the cellular physiology in vivo. To this end, the experimental design should be appropriately adjusted so that any required sample handling actions before quenching have a minimal effect on cellular physiology. Thus, we investigated the effect of four cell collection protocols and two different washing solutions on the intracellular metabolic profile measurements of a HeLa cell culture. The measurements were interpreted in the context of the known cancer cell metabolic physiology and the protocol with the minimum possible effect on cellular physiology was specified. Among the results of this study, valuable information about the metabolic physiology of the immortal cell line arise, which improved our knowledge about cancer metabolism under steady or varying environmental conditions. Subsequently, the optimization of the collection procedure enabled us to establish a representative metabolic profile of HeLa cells against which the overexpression of DGCR14 was evaluated without being obscured by the effect of the sample handling. Regarding the overexpressing cells, the metabolomic analysis detected a trend of physiological change connected to specific metabolic pathways indicating strong metabolic stress. To understand how DGCR14 overexpression generates this particular metabolic phenotype, we used the human spliceosomal complex protein-protein interaction (PPI) network and the integrated human PPI meta-database PICKLE to extract additional information about DGCR14 role based on its location with respect to other nodes and hubs. A possible functional correlation of DGCR14 to autophagic and lysosomal mechanisms was established, that will be further evaluated in the future through the analysis, separately and in combination, of the consequences of DGCR14 over- and under-expression at all molecular levels of cellular function.