Η ΒΥΠ διαθέτει αντίτυπο της διατριβής σε έντυπη μορφή στο βιβλιοστάσιο διδακτορικών διατριβών που βρίσκεται στο ισόγειο του κτιρίου της. / Το σύστημα του συμπληρώματος περιλαμβάνει πάνω από 30 πρωτεΐνες του πλάσματος (διαλυτές και υποδοχείς) και παίζει σημαντικό ρόλο, τόσο στη φυσική όσο και στην προσαρμοστική ανοσία. Το συμπλήρωμα ενεργοποιείται μέσω τριών οδών, της κλασσικής, της εναλλακτικής και της λεκτινικής, καταλήγοντας σε κάθε περίπτωση, μέσω της λυτικής οδού, στη διαμόρφωση ενός τελικού συμπλόκου, που λύει το παθογόνο. Τα συστατικά του συμπληρώματος τα οποία απαρτίζουν το τελικό σύμπλοκο MAC, και συμμετέχουν έτσι στη λυτική οδό, είναι τα C5b, C6, C7, C8α, C8β, C8γ και C9. Προκειμένου να μελετήσουμε την μοριακή εξέλιξη της λυτικής οδού του συμπληρώματος κλωνοποιήσαμε και χαρακτηρίσαμε την α και γ υπομονάδα του όγδοου συστατικού του συμπληρώματος στην ιριδίζουσα πέστροφα. Τα cDNA που προέκυψαν για τα C8α και C8γ ήταν 2.037 και 977 νουκλεοτίδια, αντίστοιχα, ενώ η συναγόμενη αμινοξική αλληλουχία ήταν 615 και 221 αμινοξέα, αντίστοιχα. Τα δύο μόρια παρόλο που αλληλεπιδρούν άμεσα και δευσμεύονται επι του συμπλόκου MAC, ανήκουν σε διαφορετικές πρωτεϊνικές οικογένειες. Η μοριακές τους δομές ομοιάζουν με τις αντίστοιχες των μορίων των θηλαστικών και οι αμινοξικές τους αλληλουχίες παρουσιάζουν σημαντικό βαθμό συντήρησης. Στην πέστροφα, το C8α δείχνει να εκφράζεται κύρια στο ήπαρ και στο νεφρό, ενώ το C8γ εκφράζεται επιπλέον και στον ιστό της καρδιάς και της σπλήνας. Ανάλυση κατά Southern έδειξε πως τα δύο γονίδια συναντώνται ως μοναδικά αντίγραφα στο γονιδίωμα της ιριδίζουσας πέστροφας. Αξίζει, τέλος, να σημειωθεί οτι αυτή είναι η πρώτη αναφορά για την κλωνοποίηση της α και γ υπομονάδας του όγδοου συστατικού του συμπληρώματος στα κατώτερα σπονδυλωτά. / The complement system consists of 30 and more proteins present in blood and cell membranes and plays an important role in host defense by interacting with components of both innate and adaptive immunity. It is activated through three distinct activation pathways: the antibody-dependent classical pathway and the alternative and lectin pathways, which are activated by direct binding of complement components to microbial surfaces. Unlike mammalian and other species, teleost are the only organisms that reveal a completely developed and extended complement system, via gene duplication and functional diversity. Complement activation via the classical, lectin, or alternative pathway leads to the formation of the (pore forming) membrane attack complex (MAC) on the surface of complement-opsonized cells. The assembly of MAC involves the aggregation of the lytic complement components C5b, C6, C7, C8α, C8β, C8γ, and C9. In order to elucidate the phylogeny of the lytic pathway of complement we now report the cloning and characterization of the C8α and C8γ genes in rainbow trout (Oncorhynchus mykiss). The deduced amino acid sequence of the trout C8α gene exhibits 44 and 43% identity with human and frog orthologs, respectively. The domain architecture of the trout C8α resembles that of mammalian orthologs, and the cysteine backbone shows a high degree of conservation. The trout C8α shows a similar expression profile with that of trout C8β and C8γ, pointing to the liver as the main source of the C8α gene expression. Although the presence of a fully developed lytic pathway of complement system is expected in teleost, this is the first report of the C8α gene in an organism other than mammalian. The deduced amino acid sequence of trout C8γ shows significant identity (37%) to the human C8γ homolog and much lower to the other known lipocalins. The lipocalin domain is present and all the cysteine residues are conserved. The trout C8γ gene is probably present as a single copy in the trout genome showing a differential expression pattern among tissues investigated. This is the first report the C8α and C8γ genes in an organism other than mammalian.

Στην Ελλάδα γενικά, αλλά και στο Νομό Αχαΐας ειδικότερα, υπάρχουν αρκετές μονάδες παραγωγής χάρτου. Αρκετές από αυτές δεν βρίσκονται εντός των ορίων Βιομηχανικών Περιοχών (ΒΙ.ΠΕ.), με συνέπεια τα ακατέργαστα απόβλητά τους να συμβάλλουν σημαντικά στη ρύπανση του περιβάλλοντος. Το μεγαλύτερο περιβαλλοντικό πρόβλημα που προκαλείται από τις συγκεκριμένες μονάδες είναι η εναπόθεση μεγάλων ποσοτήτων υγρών ακατέργαστων αποβλήτων κυρίως στα υδάτινα οικοσυστήματα. Τα απόβλητα αυτά περιέχουν μεγάλο οργανικό φορτίο, οργανοαλογονωμένες ενώσεις, υψηλά επίπεδα αιωρούμενων στερεών , φαινολών και λιγνινών, με αποτέλεσμα να προκαλούν δυσμενείς επιπτώσεις στους υδάτινους αποδέκτες, όπως τοξικότητα στους υδρόβιους οργανισμούς, ευτροφισμό και άνοδο της θερμοκρασίας. Η παρούσα μελέτη έχει ως βασικό σκοπό την εκτίμηση της τοξικότητας των αποβλήτων δυο μονάδων παραγωγής χάρτου, εγκατεστημένων στην ΒΙ.ΠΕ. Πατρών, με τη χρήση βιοδεικτών. Ως βιοδείκτες χρησιμοποιήθηκαν τόσο ψάρια του γλυκού νερού (πέστροφες του είδους Oncorhynchus mykiss), όσο και μακροασπόνδυλα (των ειδών Daphnia pulex και Thamnocephalus platyurus) με τη μορφή των μικροβιοτέστ Thamnotoxkit F και Daphtoxkit FTM pulex. Συνολικά ελήφθησαν 16 δείγματα (τέσσερα διπλά δείγματα από την κάθε μονάδα). Στα τεστ τοξικότητας που εφαρμόστηκαν (Thamnotoxkit F, Daphtoxkit FTM pulex και πέστροφες), υπολογίσθηκαν τα L(Ε)C50 24h, 48h και 96h αντίστοιχα σύμφωνα με τα πρωτόκολλα εργασίας. Για το μικροβιοτέστ Thamnotoxkit F, τα απόβλητα και από τις δυο μονάδες δεν ήταν τοξικά. Μετά από την μετατροπή των τιμών αυτών σε τοξικές μονάδες, ευρέθη ότι στο Daphtoxkit FTM pulex κυμαίνονταν από 0,79 εώς 1,12 για την ΜΠΧ1 και 1,21 έως 1,38 για την ΜΠΧ2, ενώ στις πέστροφες μεταξύ 2,92 και 4,85 για την ΜΠΧ2. Τα απόβλητα της ΜΠΧ1 δεν ήταν τοξικά για την πέστροφα. Οι τιμές αυτές και για τους τρεις ελέγχους κατατάσσουν τα απόβλητα ως «τοξικά», εκτός από το δείγμα Β της ΜΠΧ1 που ταξινομείται ως «ελαφρά τοξικό». Τα προαναφερθέντα αποδεικνύουν ότι η μονάδα παραγωγής χάρτου με πρώτη ύλη ανακυκλωμένο χαρτί (ΜΠΧ2) είναι σε κάθε περίπτωση πιο τοξική από εκείνη που παράγει χαρτί από καθαρό χαρτοπολτό (ΜΠΧ1). Τέλος, θα πρέπει να σημειωθεί ότι η παρούσα μελέτη είναι η πρώτη μελέτη εκτίμησης της τοξικότητας με βιοδείκτες των αποβλήτων μονάδων παραγωγής χάρτου που γίνεται στη χώρα μας, παρ’ ότι αυτά συμμετέχουν στην επιβάρυνση του περιβάλλοντος. Εκτιμάται ότι τα στοιχεία τοξικότητας που παρατίθενται στη παρούσα εργασία θα είναι χρήσιμα τόσο για την εκπόνηση διαχειριστικών μοντέλων, όσο και μοντέλων εκτίμησης της επικινδυνότητάς τους (risk assessment). / In Greece in general and subsequently in the Achaias Prefecture, several units of paper production exist. Many of them are not located in Industrial Areas and so they contribute significantly to the environmental pollution. The most adverse environmental problem caused by these manufacturing units, is considered to be the release of large quantities of raw liquid effluents, mainly into the aquatic ecosystems. These wastes contain a high organic load, chlorinated compounds (AOCl), high levels of suspended solids, as well as phenols and lignins resulting in hazardous effects on aquatic receivers, like toxicity and eutrophication. In this study, the toxicity of the wastewaters from two paper mills (PM1 and PM2) located in Achaias prefecture is estimated, firstly by using macroinvertebrates (Daphnia pulex και Thamnocephalus platyurus) in the form of microbiotests Thamnotoxkit F and Daphtoxkit FTM pulex, and secondly by using the trout (Onchorynchus mykiss) as a test organism. Sixteen samples were collected from both units overall (four duplicated samples from each mill). In the toxicity tests Thamnotoxkit F, Daphtoxkit FTM pulex and trout, the L(E)C50 in 24, 48 and 96 hours respectively were calculated according to the protocols. Thamnotoxkit F showed no sensitivity for the wastewaters from both mills. After the transformation of these values in toxic units, for Daphtoxkit FTM pulex ranged from 0,79 - 1,12 for PM1 and 1,21 - 1,38 for PM2. In the trout bioassay they varied from 2,92 - 4,85 for PM2, while the values for PM1 were zero. These values classify the tested paper mill effluents as “toxic”, except sample B from PM1 which was classified as “slightly toxic”. Therefore, it is shown that the paper mill which uses recycled paper as primary raw material (PM2) has more toxic waste for the environment than the paper mill which uses pre-treated paper pulp (PM1). Finally, it must be noted that the present study is the first toxicity evaluation study with bioindicators for paper mill wastewaters in our country, even though they contribute significantly to the environmental pollution. It is estimated that the measured toxicity parameters in the present study will be very useful for the designing of management plans, as well as for risk assessment models.

Το σύστημα του Συμπληρώματος απαρτίζεται από μια ομάδα πρωτεϊνών του πλάσματος και κυτταρικών υποδοχέων που παίζουν σημαντικό ρόλο στην άμυνα του ξενιστή μέσω της αλληλεπίδρασής τους τόσο με συστατικά της φυσικής, όσο και της προσαρμοστικής ανοσίας. Παράλληλα, μια ομάδα από ρυθμιστικές πρωτεΐνες του πλάσματος και της κυτταρικής μεμβράνης προστατεύει τα κύτταρα του ξενιστή από την αυτόλογη δράση του Συμπληρώματος. Η σύνθεση του τελικού λυτικού συμπλόκου MAC, που οδηγεί σε κυτταρόλυση, ρυθμίζεται από τις ρυθμιστικές πρωτεΐνες : CD59, vitronectin και clusterin. Μέχρι σήμερα οι ρυθμιστικές πρωτεΐνες της λυτικής οδού του Συμλπηρώματος έχουν ελάχιστα χαρακτηριστεί σε σπονδυλωτά πέραν των θηλαστικών. Οι οστεϊχθύες αποτελούν ένα σημαντικό μοντέλο, καθώς είναι οι μόνοι οργανισμοί που εμφανίζουν ένα πλήρως αναπτυγμένο και διευρυμένο σύστημα συμπληρώματος, μέσω διπλασιασμού πολλών γονιδίων του Συμπληρώματος. Προκειμένου να μελετηθεί η παρουσία και η φυλογενετική εξέλιξη του ρυθμιστικού μορίου της clusterin, το οποίο παρεμποδίζει την πρόσδεση του συμπλόκου C5b-7 στην μεμβράνη του κυττάρου-στόχου, με αποτέλεσμα την αναστολή της κυτταρόλυσης, έγινε κλωνοποίηση και χαρακτηρισμός του γονιδίου της clusterin στην ιριδίζουσα πέστροφα (Oncorhynchus mykiss irideus). Απομονώθηκαν δύο ισομορφές του γονιδίου της clusterin, clusterin-1 (TCLU-1) και clusterin-2 (TCLU-2) από cDNA βιβλιοθήκη ήπατος πέστροφας, με χρήση ειδικών ολιγονουκλεοτιδίων. Οι προκύπτουσες αμινοξικές αλληλουχίες των ισομορφών clusterin-1 και clusterin-2 παρουσιάζουν 89% ταυτοσημία μεταξύ τους, καθώς και 40 και 38% ταυτοσημία με την clusterin του ανθρώπου, αντίστοιχα. Η μοριακή δομή των συναγομένων πρωτεϊνών αντιστοιχεί στην α΄ αλυσίδα της clusterin και ομοιάζει με εκείνη των θηλαστικών. Γονιδιωματικοί κλώνοι απομονώθηκαν και για τις δύο ισομορφές και μελετήθηκε η οργάνωση εξωνίων-εσωνίων των αντίστοιχων γονιδίων. Η οργάνωση των γονιδίων clusterin-1 και clusterin-2, με τα μέχρι στιγμής δεδομένα, δείχνει αντιστοιχία εξωνίων - εσωνίων με το γονίδιο της clusterin του ανθρώπου, στην περιοχή ομολογίας τους. Ως προς το μέγεθος, τα αντίστοιχα εξώνια φαίνονται συντηρημένα, ενώ τα εσώνια ποικίλουν, εμφανίζοντας μικρότερο μέγεθος συγκριτικά με εκείνα της clusterin του ανθρώπου. Ανάλυση κατά Southern έδειξε ότι η clusterin απαντάται σε δύο τουλάχιστον αντίγραφα στο γονιδίωμα της πέστροφας. Τα γονίδια clusterin-1 και clusterin-2 εμφανίζουν διαφορική έκφραση στο επίπεδο του mRNA σε διάφορους ιστούς πέστροφας, όπως διαπιστώθηκε με RT-PCR. Παρατηρήθηκαν υψηλά επίπεδα mRNA του γονιδίου TCLU-1 στο ήπαρ και στο σπλήνα, ενώ η έκφραση του γονιδίου TCLU-2 παρατηρήθηκε αυξημένη στην καρδιά και στο έντερο, χαμηλή στο ήπαρ και στο σπλήνα δεν ανιχνεύτηκε. Τέλος, η φυλογενετική ανάλυση των πρωτεϊνών της clusterin από διάφορους οργανισμούς εμφάνισε την TCLU-1 να ομαδοποιείται με την TCLU-2, ενώ η όλη υποομάδα προηγείται φυλογενετικά των ορθόλογων πρωτεϊνών του pufferfish και του zebrafish και αυτές των ορθόλογων των άλλων οργανισμών που αναλύθηκαν. Συμπερασματικά, το γονίδιο της clusterin ανιχνεύεται στην ιριδίζουσα πέστροφα, σε δύο τουλάχιστον ισομορφές και παρουσιάζει ομολογία με την clusterin του ανθρώπου, τόσο στο επίπεδο οργάνωσης του γονιδίου, όσο και στο επίπεδο της αμινοξικής αλληλουχίας και της προκύπτουσας δομής. Η παρουσία ισομορφών από εναλλακτικό μάτισμα που ισχύει στην clusterin του άνθρωπου δεν έγινε δυνατόν να πιστοποιηθεί. / The complement system consists of a group of plasma proteins and cell receptors that play a critical role in host defense, by interacting with components of both innate and adaptive immunity. Α group of plasma and cell membrane regulatory proteins protects the host cells from the autologous complement activation. The conformation of the lytic complex MAC, which results to the cytolysis, is regulated by the regulatory proteins: CD59, clusterin και vitronectin. Up to date, the regulatory proteins of MAC complex are not well characterized in low vertebrates. Bony fish represent an attractive model for studies on complement system, as they are, the only organisms that reveal a completely developed and extended system, via duplication and functional differentiation of many genes of the complement system. In order to elucidate the presence and the evolution of the clusterin regulatory molecule, which impedes the binding of C5b-7 complex to the membrane of the target cell, inhibiting cytolysis, we report here the cloning and characterization of the clusterin gene in rainbow trout (Oncorhynchus mykiss irideus). Two isoforms of clusterin gene, clusterin-1 (TCLU-1) and clusterin-2 (TCLU-2) were isolated from a trout liver cDNA library, by PCR using specific oligonoucleotides. The deduced amino-acid sequences of the isoforms TCLU-1 and TCLU-2 show 89% identity to each other, as well as 40 and 38% identity to human clusterin, respectively. The domain structure of the deduced proteins corresponds to the α΄ chain of clusterin and resembles to that of mammalian. Genomic clones were isolated for the two isoforms and intron-exon organization of corresponding genes was clarified. The organization of the clusterin genes TCLU-1 and TCLU-2, as the partial data have shown, is in line with the intron-exon organization of the human clusterin gene, at their homology region. Regarding the length, the corresponding exons seem to be conserved, but the introns in trout clusterin genes are shorter than human clusterin. Southern blot analysis has shown that clusterin can be found as two copies at least, in the trout genome. Also, the genes TCLU-1 and TCLU-2 reveal differential expression, at mRNA level, among several trout tissues, as it was found out by RT-PCR analysis. High levels of TCLU-1 mRNA are detected in liver and spleen. On the other hand, TCLU-2 is expressed mainly in heart and intestine, while is not detected any expression in spleen. Finally, the phylogenetic analysis of the clusterin proteins from various organisms, showed grouping of TCLU-1 and TCLU-2, while this subgroup precedes evolutionary the clusterin orthologs of pufferfish, zebrafish and the other examined organisms, afterwards. Conclusively, the clusterin gene in rainbow trout is detected as two isoforms and shows homology with human clusterin, not only at the level of gene organization, but also at the level of amino-acid sequence and domain architecture. The alternative splicing of human clusterin was not able to be certified in trout.