Η Σωματοστατίνη (SRIF) είναι μια ορμόνη του υποθαλάμου. Ραδιοεπισημασμένα ανάλογα της χρησιμοποιούνται στη σπινθηρογραφική απεικόνιση όγκων που υπερεκφράζουν υποδοχείς της (στοχευμένη διάγνωση). Μειονεκτήματα της στοχευμένης διάγνωσης είναι η υψηλή και παρατεταμένη εντόπιση της ακτινοβολίας στους νεφρούς και η πρόσληψη των ραδιοπεπτιδίων από όργανα μη στόχους. Στόχος της παρούσας διατριβής είναι η ανάπτυξη νέων αναλόγων της SRIF τα οποία να πληρούν τις απαραίτητες προϋποθέσεις ώστε να καταστούν νέα διαγνωστικά μέσα. Αναπτύχθηκαν 33 νέα συνθετικά παράγωγα της SRIF. Σε πρώτη φάση συνετέθησαν απλά ανάλογα της SRIF. Ακολούθησε αξιολόγηση και σε αυτά τα οποία παρουσίαζαν ικανοποιητική συμπεριφορά σε σχέση με την συγγένεια τους με τον υποδοχέα και την πολικότητα τους συζεύχθηκε τετρααμινικός υποκαταστάτης για σύμπλεξη ραδιομετάλλου. Συνετέθησαν επίσης διμερή ανάλογα της SRIF και γλυκοπεπτιδικά ανάλογα. Τα πεπτίδια συντέθηκαν εφαρμόζοντας τεχνικές της Fmoc/tBu μεθοδολογίας. Ο συνδυασμός των μεθόδων που εφαρμόστηκαν οδήγησε στη λήψη των επιθυμητών δομών σε υψηλές αποδόσεις και καθαρότητα. Από τα αποτελέσματα των μελετών ανταγωνιστικής δέσμευσης τα οποία έγιναν σε μεμβράνες κυττάρων AR4-2J, αποδείχτηκε ότι όλα τα ανάλογα διαθέτουν πολύ υψηλές τιμές IC50. Ικανοποιήθηκε επίσης η απαίτηση για αύξηση της πολικότητας τους. Τα νέα ανάλογα πληρούν καταρχήν τις απαραίτητες προϋποθέσεις ώστε να καταστούν υποψήφια νέα διαγνωστικά μέσα και να βρουν κλινική εφαρμογή. Αναμένεται τα τελικά ραδιοπεπτίδια να οδηγούν σε μειωμένη πρόσληψη της ακτινοβολίας από τα όργανα μη στόχους και να εμφανίζουν αυξημένη απέκκριση από τους νεφρούς. Από προκαταρτικά πειράματα βρέθηκε ότι τα πιο πάνω επετεύχθησαν. / Somatostatin is a hyrothalamic regulatory peptide hormone with a pan-antisecretory profile. A large variety of human tumors are expressing multple somatostatin receptors. Synthetic somatostatin analogues radiolabelled with a variety of metallic radionuclide’s are used for the diagnosis and staging of sstr positive tumors but there is the main problem of high accumulation of the radiopeptides on non target organs and the high renal uptake of the radioactivity which leads to nephrotoxicity. Aim of this study was the development of new SRIF analogues as candidate useful clinical tools for the diagnosis and staging of sstr positive tumors. There have been developed thirty three new SRIF analogues and a glycoaminoacid suitable for use in SPPS. First, new analogues of [Tyr3]Octreotate were developed and the best of them, these that satisfied the relation between polarity and binding affinity to the sstr2, were coupled with a tetraaminic chelator ligand for the future complexation of a radionuclide. In other approach peptide dimers were developed. New glycopeptides were also developed. All analogues were synthesized on the solid phase applying several techniques of Fmoc/tBu strategy in high yield and purity. The binding affinity of the new SRIF analogs was checked with experiments of competitive binding with membranic preparations of AR42J cells, positive on SRIF receptors. All the new analogues are able to bind the sstr2 with high affinities. The new analogues accomplish the pre-condition to become new and useful clinical tools after their radiolabelling in the field of peptide-receptor imaging. It is expected that the new molecules will be able to have increased renal excretion via the kidneys and low non target accumulation. From preliminary experiments was shown that the above were succeeded.

Τα ραδιοπεπτίδια γνώρισαν μεγάλη εξέλιξη τα τελευταία 30 χρόνια και συνέβαλαν σημαντικά στην πειραματική και κλινική ογκολογία. Η στοχευμένη απεικονιστική διάγνωση και ραδιονουκλιδική θεραπεία του καρκίνου με διαμεσολάβηση υποδοχέων πεπτιδίων (Peptide Receptor Imaging and Radionuclide Therapy, PRΙ και PRRT) βρίσκει ολοένα μεγαλύτερη εφαρμογή. Βασική προϋπόθεση για την αποτελεσματικότητα της στρατηγικής αυτής είναι η υπερέκφραση των αντίστοιχων υποδοχέων στα καρκινικά κύτταρα-στόχους, σε σχέση με τους παρακείμενους υγιείς ιστούς. Η φυσική πεπτιδορμόνη σωματοστατίνη (SS14) ασκεί τη βιολογική της δράση μετά από αλληλεπίδραση με πέντε υποδοχείς, sst1-5. Λόγω ταχείας αποικοδόμησης της SS14 στο πλάσμα του αίματος, έχουν αναπτυχθεί μεταβολικά σταθεροποιημένα ανάλογα με στόχο την εφαρμογή στην κλινική πράξη. Το OctreoScan® είναι ένα μεταβολικά σταθεροποιημένο ραδιοπεπτίδιο της SS με υψηλή συγγένεια δέσμευσης για τον sst2, διαμέσου του οποίου και εσωτερικεύεται. Σήμερα αποτελεί το ραδιοφάρμακο επιλογής στη διάγνωση των NETs, οι οποίοι εκφράζουν τον sst2 σε υψηλή πυκνότητα. Όμως, δεδομένου ότι οι sst1-5 εκφράζονται συχνά μαζί και σε διάφορους συνδυασμούς σε πολλούς ανθρώπινους όγκους, αναμένεται ότι σταθεροποιημένα ανάλογα με ιδιότητες πανσωματοστατίνης (μιμητές σωματοστατίνης) θα απεικονίζουν ή θα θεραπεύουν μεγαλύτερο φάσμα ανθρώπινων όγκων. Επιπλέον, λόγω αλληλεπίδρασης με πολλαπλούς υποδοχείς (συνέκφραση των sst) θα επιτυγχάνεται αύξηση του διαγνωστικού σήματος και του θεραπευτικού αποτελέσματος. Σκοπός της παρούσας διατριβής ήταν η ανάπτυξη ραδιοπεπτιδίων SS με υψηλή συγγένεια δέσμευσης για τους sst1-5 και υψηλή ικανότητα εσωτερίκευσης διαμέσου των υποτύπων αυτών, ώστε να στοχεύουν αποτελεσματικότερα διευρυμένο φάσμα όγκων με πολλαπλή έκφραση sst. Για το σκοπό αυτό αναπτύξαμε δώδεκα νέα πεπτιδικά ανάλογα (ΑΤΧΣ) στα οποία διατηρήθηκε ο αριθμός των αμινοξέων της SS14. Επιπλέον, σε όλα τα πεπτιδικά ανάλογα έχει προσδεθεί ομοιοπολικά στο Ν-τελικό άκρο ο καθολικός υποκαταστάτης DOTA για τη δέσμευση του 111In και άλλων δισθενών ή τρισθενών μεταλλικών ραδιονουκλιδίων με κλινική εφαρμογή, ενώ παράλληλα επιτυγχάνεται προστασία του Ν-τελικού άκρου. Για την αύξηση της μεταβολικής σταθερότητας των νέων αναλόγων πραγματοποιήθηκαν επιπλέον τροποποιήσεις, όπως σταδιακή μείωση του αριθμού αμινοξέων στο δακτύλιο, αντικατάσταση L-αμινοξέων από D- ή μη φυσικά αμινοξέα ή από κατάλοιπα PEGΧ και τέλος εισαγωγή δεύτερης δισουλφιδικής γέφυρας. Η σύνθεση των πεπτιδικών αναλόγων (ΑΤΧΣ) σε στερεή φάση ήταν επιτυχής καθώς παραλήφθηκαν υψηλής καθαρότητας (92-99%) τελικά προϊόντα με την αναμενόμενη δομή. Η ικανότητα δέσμευσης στους sst1-5 διατηρείται στα ανάλογα με δωδεκαμελή δακτύλιο. Όμως, όσο μειώνεται ο αριθμός των αμινοξέων του δακτυλίου (από δώδεκα σε έξι) μειώνεται και η συγγένεια δέσμευσης των αναλόγων στους περισσότερους sst1-5. Παρατηρείται ακόμα και πλήρης απώλεια δέσμευσης σε συγκεκριμένους υπότυπους και ιδιαίτερα στον sst1. Η επισήμανση των ATΧΣ με 111In πραγματοποιήθηκε με δέσμευση του στον υποκαταστάτη DOTA. Τα ραδιοπεπτίδια [111In]ΑΤΧΣ παρελήφθησαν με ειδική ραδιενέργεια 0.1-0.2 mCi/nmol (επαρκή για in vivo στόχευση υποδοχέων), με υψηλή απόδοση (> 94%) και ραδιοχημική καθαρότητα (> 95%), όπως καταδεικνύεται με ανάλυση RP-HPLC. Η ικανότητα των αναλόγων [111In]ΑΤΧΣ να εσωτερικεύονται διαμέσου του sst2 μειώνεται όσο μειώνεται και ο αριθμός των αμινοξέων στο δακτύλιο. Επιπλέον, τα [111In]ΑΤ1Σ και [111In]ΑΤ2Σ (δωδεκαμελής δακτύλιος) εσωτερικεύονται διαμέσου του sst3 και λιγότερο διαμέσου του sst5. Το δικυκλικό [111In]ΑΤ6Σ παρουσίασε υψηλότερη ικανότητα εσωτερίκευσης διαμέσου του sst3 σε σύγκριση με τον sst2. Η μελέτη της in vivo σταθερότητας των [111In]ΑΤΧΣ καταδεικνύει ότι η σταδιακή μείωση του αριθμού αμινοξέων από δώδεκα σε έξι στο δακτύλιο έχει σαν αποτέλεσμα την προστιθέμενη αύξηση της μεταβολικής σταθερότητας των νέων αναλόγων. Μερική αύξηση της μεταβολικής σταθερότητας των αναλόγων παρατηρήθηκε με αντικατάσταση επιλεγμένων L-αμινοξέων από D- αμινοξέα. Η εισαγωγή δεύτερης δισουλφιδικής γέφυρας στο [111In]ΑΤ6Σ προκάλεσε την πλήρη σταθεροποίηση του. Η φαρμακοκινητική συμπεριφορά των [111In]ΑΤΧΣ αξιολογήθηκε με μελέτες βιοκατανομής σε υγιή και παθολογικά πρότυπα πειραματοζώων. Η πρόσληψη των [111In]ΑΤΧΣ σε πειραματικούς όγκους AR4-2J ή/και HEK293-hsst2/ -hsst3/ -hsst5 αξιολογήθηκε με πειράματα βιοκατανομής σε ποντίκια SCID. Το μεταβολικά σταθερό δικυκλικό [111In]AT6Σ είχε την υψηλότερη πρόσληψη (1.9% ID/g) στους πειραματικούς όγκους AR4-2J, ενώ παρόμοια πρόσληψη (1.8% ID/g) είχε και το [111In]AT2Σ (δωδεκαμελής δακτύλιος). Για τα υπόλοιπα ανάλογα παρατηρήθηκε μείωση της πρόσληψης στους πειραματικούς όγκους AR4-2J με τη μείωση του αριθμού αμινοξέων στο δακτύλιο. Όπως αναλύθηκε πριν, η μείωση του δακτυλίου είχε σαν αποτέλεσμα την μειωμένη ικανότητα δέσμευσης των αναλόγων στους sst1-5 και στην μειωμένη ικανότητα εσωτερίκευσης διαμέσου του sst2 με την παρατηρούμενη άμεση επίπτωση στην πρόσληψη στους πειραματικούς όγκους AR4-2J. Βιοκατανομή των [111In]AT1Σ και [111In]AT2Σ σε ποντίκια με πειραματικούς όγκους HEK293-hsst2/ -hsst3/ -hsst5 έδειξε ότι το πιο σταθερό [111In]AT2Σ είχε υψηλότερη πρόσληψη στους όγκους απότι το [111In]AT1Σ. Το δικυκλικό [111In]AT6Σ έδειξε πολύ μεγαλύτερη πρόσληψη (3.7 % ID/g) στους πειραματικούς όγκους HEK293-hsst3 σε σχέση με το [111In]AT2Σ (1.2 % ID/g). Φαίνεται ότι στo [111In]AT6Σ η πρόσληψη στους πειραματικούς όγκους sst2+ και sst3+ ευνοείται λόγω της υψηλής μεταβολικής του σταθερότητας, ενώ στο [111In]AT2Σ, το οποίο έχει υψηλότερη συγγένεια δέσμευσης για τους sst1-5 και μεγαλύτερη ικανότητα εσωτερίκευσης διαμέσου των sst2 και sst3, η ικανότητα στόχευσης των πειραματικών όγκων sst2+ και sst3+ μετριάζεται λόγω της χαμηλής μεταβολικής σταθερότητας. Συμπερασματικά, για τη διατήρηση της συγγένειας δέσμευσης για τους πέντε sst1-5 αλλά και της πλήρους φαρμακολογικής δράσης της ενδογενούς SS14 σε ένα ανάλογο (ιδιαίτερα τη διατήρηση της εσωτερίκευσης διαμέσου του sst2) αναδεικνύεται ουσιαστική η ύπαρξη του δωδεκαμελή δακτυλίου της SS14. Δεδομένης όμως της χαμηλής μεταβολικής σταθερότητας των αναλόγων SS14 με δωδεκαμελή δακτύλιο συνεχίζονται οι προσπάθειες για περαιτέρω σταθεροποίηση τους. Η μελέτη αυτή κατέστησε επιπλέον σαφές ότι τα εξωκυκλικά αμινοξέα των αναλόγων και ιδιαίτερα αυτών με εξαμελή δακτύλιο επιδρούν δραματικά στην συγγένεια για τους sst1-5. Επομένως, καθίσταται σημαντική περαιτέρω αξιολόγηση τους με διαμορφωσιακές μελέτες, η οποία θα ενισχυθεί με τη σύνθεση και αξιολόγηση αναλόγων με σταδιακά μειούμενο αριθμό εξωκυκλικών αμινοξέων. / Over the past 30 years great progress has been made in the field of radiopeptides, with major impact in experimental and clinical oncology. Peptide receptor imaging and radionuclide therapy is a promising new approach in nuclear medicine. An essential prerequisite for the effectiveness of this strategy is the overexpression of the corresponding peptide receptors on tumor cells, as opposed to their minimal or lack of expression in healthy surrounding tissues. Native somatostatin (SS14) exerts its inhibitory actions after binding to five receptor subtypes, sst1-5, on target cells. Due to the rapid in vivo degradation of SS14, metabolically stabilized analogs have been developed for clinical application. Octreoscan® is a metabolically stabilized radiopeptide with high affinity to sst2 and high sst2-mediated internalization into target-cells. Today this radiopharmaceutical is the agent of choice for the diagnostic imaging of NETs expressing the sst2 in high density. The above five sst1-5 are expressed concomitantly and in various combinations in several human tumors. Consequently, radiolabeled stabilized analogs with pansomatostatin-like properties are expected to detect or treat a wider range of human tumors. Furthermore, due to their multiple-receptor interaction on tumors, an increased diagnostic sensitivity and a higher therapeutic efficacy are expected by their use. The aim of the present Thesis was to develop radiopeptides which are true mimics of native SS14. In else, they will preserve a high affinity to all five sst1-5 and the pharmacological traits of SS14, especially its sst-mediated internalization capacity which will eventually lead to effective targeting of multi-sst expressing tumors. For this purpose, twelve new cyclic peptide analogs (ATXS) were developed, all containing 14 amino acids similarly to SS14. Furthermore, the universal DOTA chelator was attached to their N-terminus for stable binding of 111In and several other divalent or trivalent radionumetals used in clinical oncology. This modification has advertently led to N-terminal capping. Furthermore, ATXS underwent additional modifications to increase metabolic stability, such as progressive reduction of ring-size (from 12 to 6 amino acids), replacement of L- by D- or by unnatural amino acids or PEGx residues and eventually, introduction of a second disulfide bridge in the peptide backbone. The synthesis ATXS conducted on the solid support was successful and the final products were obtained in high purity (92-99%), as verified by analytical methods. All analogs containing a 12 amino acid ring displayed high binding affinity to all sst1-5. However, reducing the number of amino acids in the ring (from twelve to six) caused reduction of affinity to most sst1-5 subtypes. Some analogs even lost their affinity to certain subtypes, particularly to the sst1. Labeling of ATXS with 111In was mediated by the chelator DOTA attached to their N-terminus according to published protocols. The resulting radiopeptides, [111In]ATXS, were obtained at a typical specific activity of 0.1-0.2 mCi/nmol (sufficient for receptor targeting purposes) and in high yield (>94%) and radiochemical purity (>95%), as verified by RP-HPLC analysis. Internalization of [111In]ΑΤΧS into sst2-expressing cells declined as the size of the ring decreased. Furthermore, [111In]ΑΤ1S and [111In]ΑΤ2S (12-member ring) showed higher sst3- than sst5-mediated internalization in transfected HEK293 cells. On the other hand, [111In]ΑΤ6S (bi-cyclic 8,12-ring) showed higher sst3- than sst2-mediated internalization. The in vivo stability of [111In]ATXS progressively increased as the number of amino acids in the ring decreased from twelve to six. Additional increase of metabolic stability was observed in analogs undergone replacement of selected L-amino acids by D-amino acids. The most striking effect on metabolic stability was observed by the introduction of a second disulfide bridge in [111In]AT6S. The pharmacokinetic behavior of [111In]ΑΤΧS was evaluated by biodistribution studies in healthy and SCID mice. The uptake of [111In]ΑΤΧS in the AR4-2J or HEK293-hsst2 / -hsst3 / -hsst5 / experimental tumors was determined during biodistribution experiments in SCID mice. The metabolically stable bicyclic [111In]AT6S showed the highest uptake (1.9%ID/g) in the AR4-2J tumors, while [111In]AT2S displayed similar uptake (1.8%ID/g). For the other analogs the decrease of ring-size resulted in reduced uptake in the AR4-2J tumors. This effect may be assigned to the lower binding affinity to hsst1-5 and the lower sst2-mediated internalization observed in these analogs. The more stable [111In]AT2S showed higher uptake in all HEK293-hsst2 / -hsst3 / -hsst5 experimental tumors as compared to [111In]AT1S. On the other hand, the bicyclic [111In]AT6S showed much higher uptake (3.7%ID/g) in the HEK293-hsst3 tumors as compared to [111In]AT2S (1.2%ID/g). It can be assumed, that due to its higher metabolic stability, [111In]AT6S targets more effectively both the sst2+ and the sst3+ tumors in comparison to [111In]AT2S, although the latter displayed a higher affinity to sst1-5 and a faster sst2- and sst3-mediated internalization. It can be concluded, that the twelve-member ring of SS14 seems to be essential for maintaining the affinity to all five sst1-5 and the pharmacological profile of the mother hormone, especially in regards to the sst2-mediated internalization, to eventually make available clinically useful pansomatostatin-like radiopeptides. The sub-optimal metabolic stability displayed by the 12-member ring ATXS analogs of the present study indicate the need for further stabilization by innovative structural interventions. Another conclusion of this study, is the negative effect of the exo-cyclic amino acids of the 6-member ring analogs leading to dramatic loss of affinity to all sst1-5. This finding warrants further investigation with conformational studies and will be greatly assisted by the availability and evaluation of analogs with gradually declining number of exo-cyclic amino acid residues.