Η Νευροτενσίνη (pGlu-Leu-Tyr-Glu-Asn-Lys-Pro-Arg-Arg-Pro-Tyr-Ile-Leu) [NT] είναι ένα πεπτίδιο δεκατριών αμινοξέων, το οποίο απομονώθηκε για πρώτη φορά από τον υποθάλαμο βοοειδούς και αργότερα από τα έντερα. Η ΝΤ έχει ευρύ φάσμα βιολογικών δράσεων τόσο στο κεντρικό όσο και στο περιφερικό νευρικό σύστημα. Από τις δράσεις αυτές συμπεραίνεται ο διπλός ρόλος της ως νευροδιαβιβαστή/νευρορυθμιστή στον εγκέφαλο και ως ορμόνη/κυτταρικός μεσολαβητής σε περιφερικούς ιστούς. Οι φυσιολογικές και βιοχημικές δράσεις της ΝΤ εκδηλώνονται μέσω της αλληλεπίδρασής της με τους υποδοχείς της. Μέχρι σήμερα τρεις υπότυποι του υποδοχέα (NTS1, NTS2 & NTS3) έχουν κλωνοποιηθεί. Και οι τρεις υπότυποι αναγνωρίζουν και δεσμεύουν το C-τελικό εξαπεπτίδιο της Νευροτενσίνης [NT(8-13)], το οποίο αποτελεί το μικρότερο τμήμα της πεπτιδικής αλληλουχίας με πλήρη βιολογική δράση. Η γρήγορη όμως αποικοδόμηση της NT(8-13) από την δράση των πρωτεολυτικών ενζύμων οδηγεί στην αναγκαιότητα σύνθεσης αναλόγων τα οποία θα διατηρούν υψηλή ικανότητα σύνδεσης με τους υποδοχείς και παράλληλα να παρουσιάζουν ενζυμική σταθερότητα. Στην παρούσα μελέτη παρουσιάζεται η σύνθεση νέων αναλόγων της NT(8-13) με τη χρήση της Fmoc/But μεθοδολογίας επί στερεάς φάσεως χρησιμοποιώντας ως στερεό υπόστρωμα την 2-χλωροτριτυλο ρητίνη. Επίσης, πραγματοποιήθηκαν πειράματα δέσμευσης σε HT-29 κυτταρική σειρά, η οποία εκφράζει ενδογενώς τους υποδοχείς της ΝΤ. Τέλος πραγματοποιήθηκε η σύγκριση των διαμορφώσεων δύο κυκλικών αναλόγων με την χρήση της φασματοσκοπίας NMR και Μοριακής Δυναμικής. / Neurotensin (pGlu-Leu-Tyr-Glu-Asn-Lys-Pro-Arg-Arg-Pro-Tyr-Ile-Leu) [NT] is a tridecapeptide originally isolated from bovine hypothalamus and later from intestines. NT displays a wide spectrum of biological actions both in the central and peripheral nervous systems of different mammalian species. These actions have led to the proposal that this peptide fulfills a dual function as a neurotransmitter/neuromodulator in the brain and as a hormone/cellular mediator in peripheral tissues. The physiological and biochemical actions of NT are mediated through binding to NT receptors (NTRs). Up to now, three subtypes of neurotensin receptors (NTS1, NTS2 & NTS3) have been cloned. All three receptors recognize the same C-terminal hexapeptide fragment of NT [NT(8-13)], which corresponds to the shorter fragment of NT that maintains full biological activities. Although NT(8-13) possesses high receptor binding affinity, it is rapidly degraded by peptidase action. Therefore, it is important to synthesize analogues with stabilized bonds against metabolic deactivation which do not lose binding affinity. Based on these findings, we herein report the synthesis of new analogues of NT(8-13) with modifications in the basic structure needed for high affinity binding in order to improve the metabolic stability. The analogues were synthesized by the Fmoc/But solid phase methodology utilizing 2-chlorotrityl chloride resin. Electrospray MS was in agreement with the expected results. Competition radioligand binding studies were performed in membrane homogenates from HT-29 cells endogenously expressing NTRs. A series of NMR spectra including 1H, 2D TOCSY and 2D NOESY were recorded on a Varian 600MHz spectrometer for two cyclic analogues in order to elucidate their structure. The conformation properties of the two peptides, as well as similarities and differences between them are currently studied using NMR spectroscopy and Molecular Dynamics simulations.

Τα MHC τάξης I πεπτίδια περιορισμένα μόνο σε καρκινικό ιστό, τα οποία παράγονται από πρωτεΐνες του ίδιου του οργανισμού υπερεκφραζόμενες από μία μεγάλη ποικιλία ανθρώπινων κυττάρων νεοπλασιών, είναι δυνητικοί στόχοι για CTL (κυτταροτοξικά Τ λεμφοκύτταρα - Cytotoxic T lymphocyte), στα οποία βασίζεται η ανοσοθεραπεία πολλών ειδών καρκίνου. Ωστόσο, δεδομένου ότι παρουσιάζονται και από τα φυσιολογικά κύτταρα μπορεί να αναπτυχθεί επίσης θυμική και / ή περιφερική ανεκτικότητα. Η αυτό-ανοχή αφορά Τ λεμφοκύτταρα ειδικά για πεπτίδια υψηλής συγγένειας προς το MHC. Αντίθετα, τα Τ κύτταρα που αντιδρούν με όγκους, κατευθύνεται εναντίον πεπτιδίων όγκων με χαμηλή συγγένεια προς το MHC. Το μεγαλύτερο εμπόδιο για τη χρήση τέτοιων πεπτιδίων για ανοσο¬θεραπεία, είναι ότι αυτά είναι ασθενώς ή καθόλου ανοσογόνα. Αυτό οφείλεται στην αδυναμία τους να σχηματίζουν μεγάλο αριθμό σταθερών συμπλοκών MHC/πεπτιδίων στην επιφάνεια των ACP (κύτταρα που παρουσιάζουν αντιγόνα, Antigen Presenting Cells). Στην παρούσα ερ¬γασία περιγράφουμε μία προσέγγιση η οποία επιτρέπει την επαγωγή CTL απόκρισης έναντι χαμηλής συγγένειας HLA Α2.1 περιορισμένων πεπτιδίων. Αυτή συνίσταται στην τροποποίηση της πεπτιδικής αλληλουχίας με την εισαγωγή στη θέση 1 μίας Tyr, η οποία ευνοεί την αλληλεπίδρα¬ση πεπτιδίου/HLA Α2.1. Χρησιμοποιήθηκαν 25 πεπτίδια με διάφορες συγγένειες και ικανότητες σταθεροποίησης με το HLA Α2.1. Η αξιολόγηση της ικανότητα τους να επάγουν CTL απόκριση έδειξε μία αυστηρή συσχέτιση μεταξύ της συγγένειας σύζευξης/ικανότητας σταθεροποίησης και της ανοσογονικότητας. Τα ανάλογά τους με Ρ1Tyr παρουσίασαν υψηλότερη συγγένεια 1,5 έως 55,5 φορές και σταθεροποίησαν το HLA Α2.1 για τουλάχιστον 2 ώρες περισσότερο από τα α¬ντίστοιχα φυσικά πεπτίδια. Επιπλέον, η Ρ1Tyr τροποποίηση δεν μετέβαλε την αντιγονική ειδικό¬τητα των πεπτιδίων, αφού τα ανάλογα με Ρ1Tyr πάντα αναγνωρίζονταν από ειδικά CTL για τα φυσικά πεπτίδια και αντιστρόφως, ειδικά CTL για τα Ρ1Tyr ανάλογα αναγνώρισαν τα φυσικά πεπτίδια. Τελικά, όπως ήταν αναμενόμενο, τα Ρ1Tyr ανάλογα των χαμηλής συγγένειας με το HLA Α2.1 πεπτιδίων νεοπλασιών ενεργοποίησαν αποτελεσματικά in vivo απόκριση ειδικών CTL για τα φυσικά πεπτίδια. / Induction of CTL response to HLA A2.1 restricted tumor peptides exhibiting a low MHC binding affinity and a weak immunogenicity. MHC class I restricted peptides derived from self-proteins overexpressed by a wide variety of human tumor cells are potential targets for a broad spectrum CTL based immunotherapy in cancer. However, since they are presented by normal cells they may also represent thymic and/or peripheral tolerogens. Self-tolerance principally concerns high MHC/affinity peptide specific T cells and the tumor reactive T cells repertoire that is available to be mobilized by peptide based tumor vaccination protocols is directed against low MHC/affinity tumor peptides. A major barrier to the use of low MHC/affinity tumor peptide for immunotherapy is that they are weakly or even not immunogenic. This is due to their inability to form a high number of stable MHC /peptide complexes on the surface of antigen presenting cells. In the present work we describe an approach that allows the induction of a CTL response against low affinity HLA A2.1 restricted tumor peptides. It consisted in modifying the peptide sequence by introducing a Y in the first position known to have a favorable effect in the peptide/HLA A2.1 interaction. Twenty five peptides with variable HLA A2.1 stabilization capacity are included in this study and the evaluation of their capacity to induce a CTL response in a HLA A2.1 transgenic, Db-/-, mb2m-/- mouse showed a strict correlation between MHC binding affinity/MHC stabilization capacity and immunogenicity. Their P1Y variants exhibited a 1.5 to > 55 fold higher affinity and stabilized the HLA A2.1 for at least 2 hrs more than the corresponding native peptides. These effects were more pronounced for the low affinity native peptides. Moreover, P1Y modification did not alter the antigenic specificity of peptides since P1Y variants were always recognized by the native peptide specific CTL and, inversely P1Y specific CTL recognized native peptides. Finally, as expected, P1Y variants of low HLA A2.1 affinity tumor peptides efficiently triggered in vivo a native peptide specific CTL response.

Η Σωματοστατίνη (SRIF) είναι μια ορμόνη του υποθαλάμου. Ραδιοεπισημασμένα ανάλογα της χρησιμοποιούνται στη σπινθηρογραφική απεικόνιση όγκων που υπερεκφράζουν υποδοχείς της (στοχευμένη διάγνωση). Μειονεκτήματα της στοχευμένης διάγνωσης είναι η υψηλή και παρατεταμένη εντόπιση της ακτινοβολίας στους νεφρούς και η πρόσληψη των ραδιοπεπτιδίων από όργανα μη στόχους. Στόχος της παρούσας διατριβής είναι η ανάπτυξη νέων αναλόγων της SRIF τα οποία να πληρούν τις απαραίτητες προϋποθέσεις ώστε να καταστούν νέα διαγνωστικά μέσα. Αναπτύχθηκαν 33 νέα συνθετικά παράγωγα της SRIF. Σε πρώτη φάση συνετέθησαν απλά ανάλογα της SRIF. Ακολούθησε αξιολόγηση και σε αυτά τα οποία παρουσίαζαν ικανοποιητική συμπεριφορά σε σχέση με την συγγένεια τους με τον υποδοχέα και την πολικότητα τους συζεύχθηκε τετρααμινικός υποκαταστάτης για σύμπλεξη ραδιομετάλλου. Συνετέθησαν επίσης διμερή ανάλογα της SRIF και γλυκοπεπτιδικά ανάλογα. Τα πεπτίδια συντέθηκαν εφαρμόζοντας τεχνικές της Fmoc/tBu μεθοδολογίας. Ο συνδυασμός των μεθόδων που εφαρμόστηκαν οδήγησε στη λήψη των επιθυμητών δομών σε υψηλές αποδόσεις και καθαρότητα. Από τα αποτελέσματα των μελετών ανταγωνιστικής δέσμευσης τα οποία έγιναν σε μεμβράνες κυττάρων AR4-2J, αποδείχτηκε ότι όλα τα ανάλογα διαθέτουν πολύ υψηλές τιμές IC50. Ικανοποιήθηκε επίσης η απαίτηση για αύξηση της πολικότητας τους. Τα νέα ανάλογα πληρούν καταρχήν τις απαραίτητες προϋποθέσεις ώστε να καταστούν υποψήφια νέα διαγνωστικά μέσα και να βρουν κλινική εφαρμογή. Αναμένεται τα τελικά ραδιοπεπτίδια να οδηγούν σε μειωμένη πρόσληψη της ακτινοβολίας από τα όργανα μη στόχους και να εμφανίζουν αυξημένη απέκκριση από τους νεφρούς. Από προκαταρτικά πειράματα βρέθηκε ότι τα πιο πάνω επετεύχθησαν. / Somatostatin is a hyrothalamic regulatory peptide hormone with a pan-antisecretory profile. A large variety of human tumors are expressing multple somatostatin receptors. Synthetic somatostatin analogues radiolabelled with a variety of metallic radionuclide’s are used for the diagnosis and staging of sstr positive tumors but there is the main problem of high accumulation of the radiopeptides on non target organs and the high renal uptake of the radioactivity which leads to nephrotoxicity. Aim of this study was the development of new SRIF analogues as candidate useful clinical tools for the diagnosis and staging of sstr positive tumors. There have been developed thirty three new SRIF analogues and a glycoaminoacid suitable for use in SPPS. First, new analogues of [Tyr3]Octreotate were developed and the best of them, these that satisfied the relation between polarity and binding affinity to the sstr2, were coupled with a tetraaminic chelator ligand for the future complexation of a radionuclide. In other approach peptide dimers were developed. New glycopeptides were also developed. All analogues were synthesized on the solid phase applying several techniques of Fmoc/tBu strategy in high yield and purity. The binding affinity of the new SRIF analogs was checked with experiments of competitive binding with membranic preparations of AR42J cells, positive on SRIF receptors. All the new analogues are able to bind the sstr2 with high affinities. The new analogues accomplish the pre-condition to become new and useful clinical tools after their radiolabelling in the field of peptide-receptor imaging. It is expected that the new molecules will be able to have increased renal excretion via the kidneys and low non target accumulation. From preliminary experiments was shown that the above were succeeded.