- / -

- / -

- / -

Σκοπός της παρούσας διπλωματικής εργασίας είναι η εύρεση γεωμετρικών χαρακτηριστικών των αιμοσφαιρίων με ψηφιακή επεξεργασία της σκεδασμένης μονοχρωματικής ακτινοβολίας. Αποτελείται από 5 κεφάλαια. Σε αυτά περιλαμβάνεται η ανάπτυξη, η υλοποίηση και τα αποτελέσματα τεχνικών για την ψηφιακή ανάλυση κι επεξεργασία ιατρικών εικόνων κάτι που παρουσιάζει ιδιαίτερο επιστημονικό ενδιαφέρον. Oι αλγόριθμοι που αναπτύχθηκαν υλοποιήθηκαν με τη βοήθεια του MATLAB 7.1. O κώδικας προγραμματίστηκε από τον Κύριο Aποστολόπουλο και τα αποτελέσματα της εξομοίωσής τους αξιολογήθηκαν σε συνεργασία με τον καθηγητή Κύριο Δερματά. Στο κεφάλαιο 1 επιχειρείται μια εμπεριστατωμένη ανασκόπηση της διεθνούς βιβλιογραφίας πάνω στα ερευνητικά θέματα που άπτονται του “ευθέως προβλήματος” ως θεωρητικό μοντέλο. Αποτελείται από έξι υποκεφάλαια με το πρώτο να αφιερώνεται στη θεωρητική ανάλυση της σκέδασης της ηλεκτρομαγνητικής ακτινοβολίας (ΗΜ). Στο δεύτερο υποκεφάλαιο γίνεται βιβλιογραφική ανασκόπηση εργασιών που ασχολούνται με τη φυσιολογία και τα γεωμετρικά χαρακτηριστικά των ερυθροκυττάρων, ενώ στο τρίτο υποκεφάλαιο αναλύεται το “ευθύ πρόβλημα σκέδασης”. Στη συνέχεια αναλύεται η σκέδαση ανθρώπινου αιμοσφαιρίου από Ηe-Νe laser και από ηλεκτρομαγνητική ακτινοβολία. Τέλος παρατίθενται εικόνες από laser, οι οποίες προέκυψαν από πειράματα του Κυρίου Τσινόπουλου. Στο κεφάλαιο 2, αναφέρονται βασικές έννοιες ηλεκτρομαγνητισμού και σκέδασης ηλεκτρομαγνητικών κυμάτων. Αρχικά ορίζεται το ηλεκτρομαγνητικό φάσμα και η οπτική Η/Μ ακτινοβολία, η δομή της ύλης και των ατόμων και η απορρόφηση του φωτός από ερυθρά αιμοσφαίρια. Στο τέταρτο υποκεφάλαιο γίνεται μια εκτενής αναφορά στη θεωρία του ηλεκτρομαγνητισμού, τις εξισώσεις Maxwell και τις μακροσκοπικές ιδιότητες του μέσου, για κενό χώρο, ισότροπο και ανισότροπο μέσο καθώς επίσης και οι συνοριακές συνθήκες. Τέλος διατυπώνεται η κυματική μορφή των εξισώσεων Maxwell. Στο κεφάλαιο 3 παρουσιάζονται εφαρμογές παρόμοιων πειραμάτων με το “ευθύ πρόβλημα” σκέδασης ηλεκτρομαγνητικής ακτινοβολίας σχετικά με τη σκέδαση μικροσωματιδίων. Αρχικά αναλύονται εκτενώς τεχνικές της βιοτεχνολογίας και ιατρικής, όπως η ακτινοδιαγνωστική, η αθηροσκλήρωση και η βρογχοσκόπηση. Στη συνέχεια παρατίθενται εφαρμογές πέραν της ιατρικής οι οποίες παρουσιάζουν ιδιαίτερο ενδιαφέρον στη βελτίωση του βιοτικού επιπέδου. Ανάμεσα σ’ αυτές είναι ο προσδιορισμός του μεγέθους βακτηριδίων και η χρήση του Radar. Στο κεφάλαιο 4 περιγράφεται η γενική μορφή του “αντίστροφου προβλήματος” ηλεκτρομαγνητικής σκέδασης. Αρχικά παρατίθενται ο ορισμός του προβλήματος, τα πλεονεκτήματα και τα μειονεκτήματα. Στη συνέχεια παρουσιάζεται εκτενώς η επαναληπτική μέθοδος του “αντίστροφου προβλήματος” ηλεκτρομαγνητικής σκέδασης. Τέλος μοντελοποιούμε το παραπάνω πρόβλημα και αναλύονται τα προβλήματα που προκύπτουν ως αποτέλεσμα ενός παραδείγματος αναδημιουργίας αεροσκάφους με “αντίστροφη σκέδαση”. Στο κεφάλαιο 5 παρουσιάζονται εφαρμογές “αντίστροφων προβλημάτων” ηλεκτρομαγνητικής σκέδασης, καθώς και τα πλεονεκτήματα και μειονεκτήματά τους. Μερικές από αυτές τις εφαρμογές αναλύονται εκτενώς, όπως η εκτίμηση μεγέθους κοπαδιού ψαριών με αεροφωτογραφία, η επισκόπηση αρχαιολογικής γεωφυσικής και η σκέδαση φωτός δισδιάστατης γωνίας για το χαρακτηρισμό των μικροσωματιδίων αεροσκάφους. Στο κεφάλαιο 6 αναλύεται πειραματικά το “αντίστροφο πρόβλημα” σκέδασης με αναφορές σε βασικές έννοιες που χρησιμοποιούνται στο παρόν πείραμα, όπως η κανονικοποίηση εικόνας, ο DCT (Discrete Cosine Transform) και το νευρωνικό Δίκτυο. Εν συνεχεία εκτιμάται το μέγεθος και η μορφή του RBC με το “αντίστροφο πρόβλημα” σκέδασης. Τα προκύπτοντα μεγέθη μετασχηματίζουμε με Discrete Cosine Transform (DCT) κι εξάγουμε χαρακτηριστικά γνωρίσματα. Στη συνέχεια κανονικοποιούμε τα χαρακτηριστικά γνωρίσματα και προβλέπουμε τα νευρωνικά δίκτυα για το μέγεθος και τη μορφή των RBC. Τέλος εξάγονται πειραματικά αποτελέσματα και συμπεράσματα. Στο τελευταίο κεφάλαιο δίνονται οι μετρήσεις των ερυθροκυττάρων. Γίνεται μια γενική αναφορά στις εικόνες και την ψηφιακή επεξεργασία τους με τη βοήθεια του MATLAB 7.1. Αναφέρονται οι τύποι των εικόνων και η δομή τους καθώς και τα χρήσιμα Φίλτρα Εξάλειψης Θορύβου Εικόνας. Τέλος παρατίθενται οι γραφικές παραστάσεις που προκύπτουν από το Μatlab 7.1 του μέσου απόλυτου σφάλματος (Regression Error) και της επιτυχίας αναγνώρισης σχετικά με τον αριθμό των νευρώνων και σχολιάζονται αναλυτικά. / -

Η διατριβή αναφέρεται στην μελέτη της σκέδασης κατά την διάδοση των υπερήχων μέσα σε σπογγώδες βόειο οστούν, και την μοντελοποίηση της έτσι ώστε να μας επιτρέπει να εκτιμήσουμε το πάχος των δοκίδων του σπογγώδους οστού. Αναπτύσσεται ένα πειραματικό μοντέλο οστεοπόρωσης, και μελετάται η επίδραση των μεταβολών της μικροδομής στην σκέδαση των υπερήχων. Oι υπέρηχοι αποτελούν μία διαφορετική μέθοδο εκτίμησης της ποιότητας του οστού δίνοντας πληροφορίες για την δομή του, επιπρόσθετα με την πυκνότητα. Η διάγνωση της οστεοπόρωσης στηρίζεται μέχρι σήμερα κυρίως στην εκτίμηση της πυκνότητας του οστού, με μετρήσεις της εξασθένισης και της ταχύτητας του υπερήχου. Μια άλλη προσέγγιση της εκτίμησης της ποιότητας του οστού γίνεται με την μελέτη της σκέδασης, η οποία μπορεί να δώσει πληροφορία για την ποιότητα και την αρχιτεκτονική δομή του σπογγώδους οστού. Η σκέδαση που υφίσταται ο υπέρηχος κατά την διάδοσή του στo σπογγώδες οστούν άρχισε να μελετάται το 2000 και έχει προσεγγισθεί με δύο μοντέλα. Το πρώτο θεωρεί διακριτές ανομοιογένειες του μέσου, και χρησιμοποιεί τις αναλυτικές λύσεις του Faran2 της διαφορικής διατομής σκέδασης από σφαιρικό η κυλινδρικό ελαστικό στερεό σώμα, γιά να περιγράψει την αλληλεπίδραση του υπέρηχου με το οστούν. To δεύτερο μοντέλο θεωρεί την διάδοση των υπερήχων σε τυχαία ανομοιογενές συνεχές μέσο και βασίζεται στην απόδειξη του Chernov, ότι η σκέδαση είναι ανάλογη του γινομένου της μέσης διακύμανσης της συμπιεστότητας και της συνάρτησης αυτοσυσχέτισης του μέσου. Στην παρούσα διδακτορική διατριβή για την μοντελοποίηση της σκέδασης κατά την διάδοση των υπερήχων στο βόειο σπογγώδες οστούν, χρησιμοποιήθηκε ένας συνδυασμός των δύο προσεγγίσεων. Οι σπουδαιότερες παραδοχές του μοντέλου είναι οι κάτωθι : • Υποθέτουμε ασθενή σκέδαση. • Υποθέτουμε ότι το δείγμα είναι στατιστικά ομογενές και ισότροπο. • Αγνοούνται τα φαινόμενα πολλαπλής σκέδασης, και • Δεν λαμβάνεται υπ’ όψιν η μετατροπή των διαμήκων κυμάτων σε διατμητικά. Οι παραδοχές του μοντέλου ικανοποιούνται από τα πειραματικά αποτελέσματα. Για την περιγραφή της μικροδομής του σπογγώδους οστού, χρησιμοποιήθηκαν δύο συναρτήσεις αυτοσυσχέτισης: μία τροποποιημένη Gaussian συνάρτηση πυκνού πληθυσμού για να ερμηνεύσει τις αρνητικές τιμές αυτοσυσχέτισης που παρατηρούνται μεταξύ δύο σημείων μέσα και έξω από μία ανομοιογένεια και αφορούν την πυκνότητα και την συμπιεστότητα, καθώς και το μεγάλο ποσοστό δοκίδων στην μονάδα του όγκου, και η συνάρτηση κατανομής μικρής συγκέντρωσης σφαιρών, για να εξηγήσει την ύπαρξη μεγάλων στο πλάτος δοκίδων με ελλειπτική ή σφαιρική τραχεία μορφή που συνεισφέρουν ένα ποσοστό στη σκέδαση. Για τα περισσότερα όμως δείγματα κανένα από τα δύο μοντέλα δεν ήταν επαρκές για να προσεγγίσει επ’ ακριβώς την συμπεριφορά του σπογγώδους οστού. Γι’ αυτόν τον λόγο προτάθηκε ένας συνδυασμός των δύο μοντέλων για να περιγράψει τα πειραματικά δεδομένα. Το αντίστροφο πρόβλημα της εκτίμησης του πάχους των δοκίδων του οστού αντιμετωπίσθηκε στην παρούσα διατριβή. Λόγω του εύρους της διακύμανσης του πάχους των δοκίδων στο βόειο σπογγώδες οστό, έγιναν διαγράμματα κατανομής του πάχους για κάθε δοκίμιο οστού και προσδιορίσθηκε το κυρίαρχο αντί για το μέσο πάχος δοκίδων, που έχει χρησιμοποιηθεί σε άλλες εργασίες. Η σύγκριση των πειραματικών μετρήσεων της διαφορικής διατομής σκέδασης 1800 με την θεωρητική πρόβλεψη, έδειξε ότι περισσότερες της μίας κυρίαρχες διαστάσεις δοκίδων συνεισφέρουν στην σκέδαση σε κάθε δοκίμιο. Σημαντική γραμμική συσχέτιση (R2=0.8558) βρέθηκε μεταξύ εκτιμώμενου και μετρηθέντος πάχους δοκίδων. Η εξασθένιση των υπερήχων κατά την διέλευσή τους μέσα από βιολογικούς ιστούς, έχει δύο συνιστώσες: την απορρόφηση και τη σκέδαση. Η προβλεπόμενη από την συνάρτηση αυτοσυσχέτισης του πυκνού πληθυσμού εξασθένιση λόγω σκέδασης, παρουσιάζει μία ευρεία γραμμική περιοχή από 0.3 έως 0.9 MHz για συνεχή κατανομή σκεδαστών (100 έως 600 μm), που επαληθεύεται από τα πειραματικά δεδομένα, υποδεικνύοντας ότι η εξασθένιση που υφίσταται ο υπέρηχος κατά την διάδοσή του στο σπογγώδες οστούν, οφείλεται σε μεγαλύτερο βαθμό στην σκέδαση απ’ ότι στην απορρόφηση. Στο δεύτερο μέρος της διατριβής αναπτύσσεται ένα πειραματικό μοντέλο προσομοίωσης της οστεοπόρωσης. Η οστεοπόρωση είναι μία σοβαρή νόσος των οστών, που χαρακτηρίζεται από χαμηλή οστική μάζα και πυκνότητα, μεταβολή της μικροδομής του οστού με μείωση του πάχους των δοκίδων και αυξημένο κίνδυνο κατάγματος. Στόχος είναι η εκτίμηση της επίδρασης των μεταβολών της μικροδομής, και της πυκνότητας του σπογγώδους οστού στις ιδιότητες των υπερήχων κατά την διάδοση τους μέσω του οστού, για την κατασκευή “εργαλείων” διάγνωσης της οστεοπόρωσης. H προσομοίωση της οστεοπόρωσης επιτυγχάνεται με σταδιακή αφαίρεση των ανόργανων συστατικών (απασβεστοποίηση) με εμβάπτιση σε υδροχλωρικό οξύ. Η ηλεκτρονική μικροσκοπία και η ιστολογική χρώση δείχνουν ότι, σε κάθε στάδιο απασβεστοποίησης, οι δοκίδες του οστού αποτελούνται από ένα πυρήνα άθικτο και ένα εξωτερικό στρώμα πλήρως απασβεστοποιημένο, το πάχος του οποίου εξαρτάται από τον χρόνο εμβάπτισης. Mε την διαδικασία αυτή επιτυγχάνεται η σταδιακή μείωση του πάχους των δοκίδων και επομένως η μείωση της πυκνότητας. Το μοντέλο ασθενούς σκέδασης με συνδυασμό δύο συναρτήσεων αυτό-συσχέτισης (του πυκνού πληθυσμού και της σφαιρικής κατανομής) που αναπτύχθηκε στο πρώτο τμήμα της διατριβής, χρησιμοποιήθηκε γιά την εκτίμηση του πάχους των δοκίδων στα διαδοχικά στάδια απασβεστοποίησης. Η ακρίβεια της εκτίμησης βρέθηκε ότι αυξάνεται με το πάχος των δοκίδων. / Ultrasound is currently being assessed as an alternative method of evaluating bone quality, and provides information about structure in addition to density. Ultrasound velocity and broadband ultrasound attenuation (BUA) determination has been explorer as an alternative method for estimating bone density and osteopososis. An other approach is the ultrasound scattering which inform us for the quality and architecture of the bone. Two different approaches have been proposed to model backscattering from cancellous bone. A first approach with discrete homogeneites use the analytical model of Faran which provides an exact solution of the backscatter cross section by a spherical or a cylindrical solid elastic object, to describe the interaction of trabecular bone with the ultrasonic wave. The second approach is based on Cernov’s proof that scattering is proportional to the product of the mean compressibility fluctuation and the autocorrelation function integrated over volume. A combination of the two autocorrelation functions was required to closely approximate the backscatter from bovine cancellous bone. The main limitations of the model are the following : • Weak scattering • The assumption of statistical homogeneity over one sample • First order multiple scattering • They do not account for shear waves in the scatterers The main limitations are satisfied from the experimental data Two simple scattering autocorrelation functions have been utilized to describe the microscopic structure of the random inhomogeneous medium: A modified Gaussian model has been considered to account for a large volume fraction of scatterers in the medium, the fluctuation in density and compressibility about the mean value, and the spherical distribution model because a number of larger plate-like scatterers with ellipsoid or roughly spherical shape may contribute to a portion of the scattering. The frequency dependence of the backscatter coefficient from bovine trabecular bone could not be discribed accurately either by scattering from a collection of randomly distributed identical scatterers or by a continuous model with a single dominant correlation length. This could be due to the tremendous variation in microarchitecture encountered in bovine trabecular bone. A combination of models was required to approximate the experimental data. The inverse problem to estimate the trabecular thickness of bone tissues has been addressed in this thesis. The estimates of correlation lengths from the combination of the two models were compared to trabecular thickness. Mean values of trabecular thickness display very large variation at both intraspecimen and interspecimen levels and cannot be used as estimates of the correlation length α. A significant contribution of this work is that interpretation of the correlation length was the dominant trabecular thickness, obtained from distribution graphs for each specimen. Significant linear correlation was found between predicted correlation length and measured trabecular thickness (R2=0.8558). In this study, it was found that the total attenuation by tissues is largely due to scattering processes than the attenuation due to absorption and the frequency dependence of attenuation due to scattering is linear for a densely populated distribution of scatterers from 100 to 600 μm, which have been measured in bovine cancellous bone, and in the range of frequencies 0.3-0.9 MHz. In the second part of this study a new experimental model was developed in order to simulate osteoporosis. Osteoporosis is a condition of reduced mass and density, change of bone 3D structure and increased fragility with a more pronounced effect on cancellous bone. Our purpose is the study of the ultrasonic frequency-depedent backscatter in dense bovine trabecular bone and the determination of a weak scattering model for the trabecular thickness which is relative to osteoporosis. The simulation of osteoporosis was developed in order to evaluate the effects of change of mineral content and microstructure on ultrasonic properties of cancellous bone with immersion in hydrocloric acid. Timed immersion in hydrochloric acid was used to selectively alter the mineral content. Scanning electron microscopy and histological staining of the acid-treated trabecular demonstrated a heterogeneous structure consisting of a mineralized core and a demineralized layer. Τhe accuracy of estimation was found to increase with trabcular thickness. A two-component model of weak scattering utilizing a combination of two autocorrelation functions (a densely populated model and a spherical distribution) to evaluate the trabecular thickness in various stages of decalcification. Τhe accuracy of estimation was found to increase with trabcular thickness.

Η παρουσία σκόνης στο πλάσμα απασχόλησε ιδιαίτερα τους μελετητές στην εκτέλεση εφαρμογών υψηλής τεχνολογίας και κατασκευής. Η εμφάνιση των σωματιδίων μέσα σε αντιδραστήρες πλάσματος, μόλυνε τα υποστρώματα, μείωνοντας κατά αυτό το τρόπο την παραγωγική διαδικασία και διαταράσοντας με απρόβλεπτους τρόπους το πλάσμα. Ο σχηματισμός και η πυρήνωση των σωματιδίων μέσα στο πλάσμα είχε τεράστιες επιπτώσεις στις βιομηχανίες (οικονομικές κτλ.). Βέβαια με την πάροδο των χρόνων και τις αλλεπάληλες μελέτες που έγιναν οι επιστήμονες κατάφεραν να ελέγξουν αυτό το συνεχή σχηματισμό σωματιδίων. Με τον καιρό, κάποιοι μελετητές εκμεταλεύτηκαν την παρουσία σκόνης και οδηγήθηκαν στην ανάπτηξη νέων προϊόντων. Αυτή είναι η περίπτωση των πολυμορφικών ηλιακών κυττάρων (δηλ. αμορφα υδρογονωμενα ηλιακά κύτταρα με ενσωματωμένους νανοκρυσταλλίτες). Η κατασκευή αυτή έγινε απο την ομάδα του Roca i Cabarrocas του Πολυτεχνείου Ecole στην Γαλλία. Στην παρούσα εργασία θα γίνει η μελέτη σχηματισμού και ανάπτυξης των σωματιδίων στα διάφορα στάδιά τους και θα παρουσιαστούν διάφοροι τρόποι ανίχνευσης αυτών. Σκοπός μας είναι να βρούμε την ακριβή χρονική στιγμή σχηματισμού της σκόνης και να επεμβαίνουμε ώστε να σταματάμε την περαιτέρω ανάπτυξή της. / -

Στόχος της παρούσας διπλωματικής εργασίας είναι η μελέτη μέτρησης της διασποράς μεγέθους λιποσωμάτων με την τεχνική της συντονιζόμενης ανίχνευσης παλμών ωμικού ρεύματος, σε σύγκριση με την μέθοδο της δυναμικής σκέδασης φωτός, που χρησιμοποιείται συνήθως. Για τον σκοπό αυτό, μελετήθηκε η διασπορά μεγέθους διαφόρων λιποσωμικών διασπορών, σε διάφορους χρόνους μετά την παρασκευή τους, πριν και μετά από λυοφιλοποίηση, καθώς και όταν επωάστηκαν (για διάφορες χρονικές περιόδους) παρουσία πρωτεϊνών. Όλοι οι τύποι λιποσωμάτων χαρακτηρίστηκαν ως προς το μέγεθος και τον δείκτη πολυδιασποράς και με τις δύο τεχνικές: Δυναμική σκέδαση φωτός (DLS) και την τεχνική συντονισμένης ανίχνευσης παλμών ωμικού ρεύματος (TRPS). Από την μελέτη σταθερότητας μεγέθους των λιποσωμάτων μετά από λυοφιλοποίηση (freeze-drying), φαίνεται ότι η σταθερότητα του μεγέθους, εξαρτάται από το υδατικό μέσο στο οποίο βρίσκονται και από την λιπιδική συγκέντρωση του δείγματος. Ακόμα, έγινε προσπάθεια να διερευνηθεί αν το ποσοστό του φορτίου που φέρουν τα λιποσώματα, επηρεάζει την σταθερότητα του μεγέθους, και παρασκευάστηκαν SUV λιποσώματα με διαφορετικό φορτίο. Σύμφωνα με τα αποτελέσματα, η σταθερότητα μεγέθους των λιποσωμάτων με την πάροδο του χρόνου, δεν εξαρτάται από τη συγκέντρωση της διασποράς (τουλάχιστον στην περιοχή συγκεντρώσεων που μελετήθηκαν), αλλά από το φορτίο που φέρουν. Πιο συγκεκριμένα, στα λιποσώματα με 20% PG, το μέγεθος αυξήθηκε κατά 5-22%, σε αντίθεση με τα λιποσώματα που φέρουν 10% PG, στα οποία το μέγεθος αυξήθηκε κατά 2,5-10%. Τέλος, η επώαση παρουσία πρωτεϊνών, φάνηκε να επηρεάζει σημαντικά το μέγεθος των λιποσωμάτων (με και χωρίς φορτίο) μετά από 48 ώρες. / The aim of this study is to investigate the results of a TRPS technique to measure the size distribution of various types of liposomes in comparison with those obtained by the classically used DLS methodology. For this, the size stability of liposomes was studied (using both techniques) before and after a freeze drying cycle, and also before and after their incubation (for various time periods) in presence of proteins. All types of liposomes were characterized for their size and polydispersity index, by using the two techniques: Dynamic light scattering (DLS) and Tunable Resistive Pulse Sensing (TRPS). The size stability study of liposomes, after freeze-drying, was found to depend on the aqueous medium in which they are dispersed (buffer or glucose) and (more) on the lipid concentration of the dispersions. The effect of adding a charged lipid in the liposome bilayer on their size stability was additionally investigated. For this, charged and non-charged SUV liposomes were prepared. According to the results the size stability of liposomes is affected by their charge. Specifically, liposomes with 20% PG, size increased by 5-22 % and liposomes with 10% PG, size increased by 2,5-10 %. Finally, the size stability of liposomes in the presence of proteins was studied, by using two different liposome types, with or without charge. The results showed that the size distribution remained stable during the first 48 hours of incubation but after that, liposome size was significantly increased.

Στη διδακτορική αυτή διατριβή πραγματοποιείται η μελέτη των δυναμικών ιδιοτήτων των πρωτεϊνών του βοδινού φακού με τη μέθοδο της Δυναμικής Σκέδασης Φωτός και επιχειρείται ο συσχετισμός των ιδιοτήτων αυτών με το φαινόμενο του καταρράκτη. Μελετήθηκαν δυο μοντέλα καταρράκτη, ο «ψυχρός» καταρράκτης, που προκύπτει με ψύξη του φακού κάτω από τους 17 οC και ο «θερμός» καταρράκτης που προκύπτει με θέρμανση του φακού πάνω από τους 50 οC. Οι μετρήσεις στις διάφορες θερμοκρασίες πραγματοποιήθηκαν σε όλο το φάσμα συγκεντρώσεων, από πολύ αραιά μέχρι πολύ πυκνά αιωρήματα των πρωτεϊνών του φακού. Επιπλέον, μελετήθηκαν τρία ξεχωριστά συστήματα: ομογενή αιωρήματα α) από ολόκληρους φακούς νεαρών βοδιών, β) από τους πυρήνες των φακών νεαρών βοδιών και γ) α-κρυσταλλινών, οι οποίες αποτελούν το είδος των πρωτεϊνών με το μεγαλύτερο ποσοστό στο φακό (45 %) και επιπλέον έχουν το μεγαλύτερο μοριακό βάρος (800 kDa). Για τη μελέτη των α-κρυσταλλινών, προηγήθηκε απομόνωση και διαχωρισμός των διάφορων ειδών πρωτεϊνών του φακού με χρωματογραφία πηκτής. Από την ανάλυση των αποτελεσμάτων προέκυψε ότι: Τα αιωρήματα των πρωτεϊνών του φακού περιγράφονται από τέσσερις μηχανισμούς διάχυσης: τη συλλογική διάχυση, η οποία εμφανίζεται σε ενδιάμεσες συγκεντρώσεις (c>75 mg/ml) και γίνεται βαθμιαία πιο γρήγορη όταν αυξάνει η συγκέντρωση και την αυτοδιάχυση των α-κρυσταλλινών, των HMα-κρυσταλλινών και των συσσωματωμάτων των κρυσταλλινών (c>200 mg/ml), η οποία γίνεται βαθμιαία πιο αργή με αύξηση της συγκέντρωσης. Όλοι οι μηχανισμοί διάχυσης γίνονται βαθμιαία πιο αργοί κατά την ψύξη των αιωρημάτων. Το ίδιο ισχύει και κατά τη θέρμανση σε μια σταθερή θερμοκρασία (Τ>50 οC) με την αύξηση του χρόνου θέρμανσης. Όσο αυξάνεται η συγκέντρωση σε μια δεδομένη υψηλή θερμοκρασία (Τ>50 οC) αυξάνεται και ο αριθμός ή/και το μοριακό βάρος των συσσωματωμάτων των κρυσταλλινών. Όσο αφορά τον ψυχρό καταρράκτη, η σκεδαζόμενη ένταση αυξάνεται απότομα, ενώ εμφανίζονται «περιοχές» υψηλής συγκέντρωσης για T<TC, όπου TC η κρίσιμη θερμοκρασία σχηματισμού του ψυχρού καταρράκτη. Τα συμπεράσματα που προέκυψαν από τη διδακτορική αυτή διατριβή είναι σημαντικά για την κατανόηση των βασικών μηχανισμών των αλληλεπιδράσεων των πρωτεϊνών του φακού τόσο σε φυσιολογικές όσο και σε παθολογικές συνθήκες, καθώς επίσης για την έγκαιρη διάγνωση των πρώιμων σταδίων του γεροντικού καταρράκτη. / Protein condensation is the molecular basis for many neurodegenerative diseases such as Alzheimer’s disease and lens cataract. The cause of protein condensation (aggregation and/or phase separation) and the route to the condensed state are still a matter of debate, despite the intense research efforts on the subject. The present dissertation aims at studying the molecular basis of lens cataract in mammal lenses. The fact that the lens is a complex, dense dispersion of proteins (called crystallines) in water is an important obstacle that makes the understanding of the cataract onset in the lens a tough problem if not an impossible task. A strategy to overcome this obstacle is to study the cataract onset in simpler systems, e.g. dispersions of the various crystalline species at various protein concentrations ranging from very dilute dispersions to dense ones such as the intact lens. In this work we investigate the dynamics of bovine lens proteins dispersions by means of Dynamic Light Scattering, in an effort to reveal possible correlations of their behavior with the cataract effect. Two models of cataract were studied; the “cold” cataract, that is caused by cooling lens proteins below 17 οC and the “heat-induced” cataract, caused by heating lens proteins above ~45-50 οC. The temperature dependence of the diffusion coefficient was studied over a wide range of concentrations, from the very dilute limit up to the dense regime approaching lens concentration. The studies were carried out for three different young bovine lens protein dispersions. (a) Lens homogenates consist of the total lens content, (b) homogenate dispersions of the nucleus content, and (c) dispersions of isolated α-crystallins, i.e. the species that dominate in DLS among lens proteins. α-crystallins were separated from the mixture of lens proteins by using gel-filtration chromatography. The main conclusions of the present work are the following. The dynamics of lens protein dispersions are described by four diffusion mechanisms: one collective diffusion process that appears at moderate concentrations, c>75 mg/ml, and becomes faster with increasing concentration and three self-diffusion processes of α-crystallins, HMα-crystallins and large aggregates of crystallins (c>200 mg/ml). Self-diffusion becomes slower with increasing concentration. All diffusion mechanisms become slower by lowering the temperature of the dispersions. The same holds when the dispersions are heated at a constant temperature above 50 οC by increasing the heating time. Concerning “cold” cataract, it was observed that the scattered intensity grows rapidly, while “domains” of very high concentration appear for T<TC, where TC denotes the critical temperature for “cold” cataract formation.

Λόγω της διαφάνειας των οφθαλμικών ιστών η σκέδαση φωτός αποτελεί ιδανικό εργαλείο για την ανίχνευση των αρχικών σταδίων ορισμένων παθολογικών τους καταστάσεων. Για παράδειγμα, η θόλωση του φακού των θηλαστικών λόγω ηλικίας ή/και άλλων εξωγενών αιτίων καλείται καταρράκτης. Ο καταρράκτης δεν μπορεί να διαγνωστεί κλινικά σε πρώιμο στάδιο με αποτέλεσμα την δημιουργία σοβαρών προβλημάτων στην όραση. Το γεγονός ότι το φως έχει την ικανότητα να ανιχνεύει τις μοριακές αλλαγές οι οποίες είναι πρόδρομα συμπτώματα του καταρράκτη αναδεικνύει την σημασία της έγκαιρης διάγνωσης στην αντιμετώπιση διάφορων οφθαλμικών παθήσεων. Ο φακός θεωρείται ως ένα πυκνό διάλυμα πρωτεϊνών (κρυσταλλίνες, ~40 % wt) σε νερό και η αδιαφάνεια η οποία αποτελεί την εκδήλωση του καταρράκτη προκαλείται ουσιαστικά από την συσσωμάτωση των πρωτεϊνών. Στόχος αυτής της διατριβής είναι η διερεύνηση των μοριακών μεταβολών οι οποίες λαμβάνουν χώρα κατά την ανάπτυξη του καταρράκτη. Ιδιαίτερη σημασία δίνεται επίσης στην ανάπτυξη μιας μη-επεμβατικής μεθοδολογίας για έγκαιρη διάγνωση οφθαλμικών παθήσεων με τη βοήθεια της δυναμικής σκέδασης φωτός. Με την βοήθεια της τεχνικής αυτής, κατάλληλα τροποποιημένης για την μελέτη οφθαλμικών ιστών, μελετήθηκαν οι δυναμικές ιδιότητες των πρωτεϊνών χοίρειων φακών (π.χ. οι συντελεστές διάχυσης, η θερμοκρασιακή τους εξάρτηση σε διάφορα μέρη του φακού, κλπ.) χρησιμοποιώντας το πειραματικό μοντέλο του “ψυχρού” καταρράκτη. Στο μοντέλο αυτό η ελεγχόμενη ψύξη φακών επιφέρει βαθμιαία καταρρακτογένεση. Ιδιαίτερη έμφαση δόθηκε σε τέσσερα κυρίως είδη περαμάτων. (α) Μελέτη της εμφάνισης του ψυχρού καταρράκτη στον πυρήνα του φακού. (β) Μελέτη της επίδρασης του μήκους κύματος της ακτινοβολίας στην εμφάνιση και στην έκταση του φαινομένου του ψυχρού καταρράκτη. (γ) Μελέτη του φαινομένου του ψυχρού καταρράκτη κατά μήκος μιας διαμέτρου του φακού, δεδομένης της βαθμίδας συγκέντρωσης των πρωτεϊνών του φακού (μεγάλη συγκέντρωση στον πυρήνα και μικρή συγκέντρωση στην περιφέρεια του φακού). (δ) Μελέτη του επίδρασης της προθέρμανσης του φακού σε θερμοκρασίες υψηλότερες της φυσιολογικής στο φαινόμενο του ψυχρού καταρράκτη. Τα βασικά συμπεράσματα της παρούσας διατριβής συνοψίζονται ως εξής. Υπάρχουν σαφείς συσχετισμοί μεταξύ των φασματικών χαρακτηριστικών (συναρτήσεις αυτοσυσχέτισης) και των ιεραρχικών σταδίων ανάπτυξης του καταρράκτη. Ποιοτικές και ποσοτικές αλλαγές στην θερμοκρασιακή εξάρτηση διαφόρων παραμέτρων, οι οποίες σχετίζονται με τις μοριακές διαμορφώσεις των αρχικών σταδίων του καταρράκτη, εμφανίζονται ήδη από τους 17 oC όπου ο πυρήνας του φακού είναι ακόμα διαυγής. Η χρήση ακτινοβολίας κοντά στο υπεριώδες μέρος τους φάσματος ενισχύει την ανάπτυξη του ψυχρού καταρράκτη στον πυρήνα του φακού. Ο ψυχρός καταρράκτης δεν αναπτύσσεται στην περιφέρεια του φακού. Η προθέρμανση του φακού σε συγκεκριμένη θερμοκρασία καθώς και ο χρόνος παραμονής σε αυτήν επηρεάζει σημαντικά την ανάπτυξη του ψυχρού καταρράκτη στον πυρήνα αλλά όχι στην περιφέρεια του φακού. Όλα τα παραπάνω δείχνουν πως η δυναμική σκέδαση φωτός μπορεί να παρέχει παραμέτρους οι οποίες μπορούν να χρησιμοποιηθούν με επιτυχία ως ευαίσθητοι και αξιόπιστοι δείκτες της έγκαιρης, μη-επεμβατικής, και in vivo διάγνωσης του καταρράκτη. / On account of the transparency of ophthalmic tissues, light scattering is an ideal tool for detecting the early stages of some of their pathological conditions. For example, the opacity of the mammalian lens due to age or other external causes is called cataract. Cataract cannot be detected clinically at early stages and as a result serious vision problems appear. The fact that, light has the ability to detect molecular changes that are related to the mechanism of cataract formation draws attention to the importance of early diagnosis in ophthalmic disorders. The lens can be considered as a dense colloidal protein dispersion (crystallins, ~ 40% wt) in water where the opacity that leads to cataract formation how its basis to the aggregation of proteins. This dissertation is aimed at studying the molecular changes that take place upon cataract development. Particular emphasis is paid to the development of a non-invasive methodology for early diagnosis of ocular diseases with the aid of dynamic light scattering. By means of this technique, suitably modified for the study of ophthalmic tissues, the dynamic properties of the proteins of porcine lenses (e.g. diffusion coefficients and their temperature dependence at various parts inside the lens, etc.) were studied by using the experimental model of ‘cold’ cataract. In cold cataract the controlled cooling of the lens at temperatures below the physiological one induces gradual cataractogenesis. In particular, we focused on four kinds of experiments. (a) Detailed study on the cold cataract onset in the lens nucleus. (b) Study on the effect of the laser light wavelength in the onset and the extent development of cold cataract. (c) Study of the cold cataract effect along an equatorial diameter of the lens, considering the gradual concentration of the lens proteins (high protein concentration in the nucleus and low concentration in the cortex). (d) Study on the effect of thermal history, i.e. by warming up the lens at temperatures higher than the physiological one on the cold cataract effect. The basic conclusions of the present dissertation are summarized as follows: There are clear correlations between the spectral characteristics (autocorrelation functions) and the hierarchical stages of the onset of cataract. Qualitative and quantitative changes in the temperature dependence of several parameters, which are related with the diffusive motions of proteins at the early stages of cataract, appear already at 17 oC while the nucleus is still clear and highly transparent. The use of laser radiation close to the ultraviolet part of the spectrum seems to enhance the formation of cold cataract in the lens nucleus. Cold cataract does not develop at the cortex of the lens, in view of the low protein concentration. The lens pre-heating at a certain temperature for various time periods affects significantly cold cataract formation in the lens nucleus but not in lens cortex. The above mentioned make clear that dynamic light scattering can indeed provide useful parameters that can be successfully used as sensitive and reliable indicators for the early, non-invasive diagnosis of cataract in mammalian lenses and in vivo.

Στην παρούσα διδακτορική διατριβή έγινε μελέτη πολυμερικών βουρτσών που διαμορφώνονται από συμπολυμερή πολυστυρενίου-πολυβουταδιενίου που φέρουν στην άκρη τους ομάδες ικανές να προσροφηθούν (PS-PB-Zw) Η μελέτη έγινε κυρίως με την τεχνικής της μέτρησης δυνάμεων (SFA) και της ανάκλασης νετρονίων. Ιδιαίτερο ενδιαφέρον παρουσιάζουν οι γραμμικές πολυμερικές αλυσίδες όπου ένα μεγάλου μοριακού βάρους πολυμερές φέρει στην άκρη του μια μόνο ακραία ομάδα. Τα γραμμικά αυτά συμπολυμερή είχαν μελετηθεί και στο παρελθόν. Το ζητούμενο όμως ήταν να μεταβάλλουμε την αρχιτεκτονική αυτή και να παρατηρήσουμε τις πιθανές μεταβολές στα ποιοτικά χαρακτηριστικά των προσροφημένων πολυμερικών στρωμάτων που διαμορφώνουν. Ως μέτρο σύγκρισης μελετήσαμε αρχικά τις ήδη μελετημένες γραμμικές αλυσίδες και στη συνέχεια προχωρήσαμε στη μελέτη των νέων δειγμάτων. Προσθέσαμε δύο και τρεις ακραίες ομάδες στο άκρο της πολυμερικής αλυσίδας μεγάλου μοριακού βάρους και αναμέναμε σύμφωνα με θεωρητικές προβλέψεις αύξηση στο προσροφημένο ποσό. Η αύξηση αυτή θα ήταν εμφανής μέσω της αύξησης του πάχους του πολυμερικού στρώματος που εύκολα μπορεί να μετρηθεί με την τεχνική της μέτρησης των δυνάμεων αλληλεπίδρασης. Επίσης μετρήσαμε άμεσα το προσροφημένο ποσό και με την τεχνική της ανάκλασης νετρονίων για πολυμερή τριών διαφορετικών μοριακών βαρών (25000, 70000 και 150000). Το σημαντικότερο αποτέλεσμά μας είναι ότι δεν παρατηρήσαμε αύξηση στο προσροφημένο ποσό σε σχέση με τις γραμμικές αλυσίδες και σε χρόνους ενός τυπικού πειράματος. Υπήρχε ωστόσο η υποψία ότι σε βάθος χρόνου μπορεί να αυξάνεται το προσροφημένο ποσό. Για το λόγο αυτό διεξαγάγαμε μια σειρά από μετρήσεις «κινητικής» με την τεχνική της ανάκλασης νετρονίων, αλλά και με συμπληρωματικές τεχνικές (διέγερση επιφανειακών πλασμονίων). Καμία μεταβολή δεν παρατηρήσαμε στο προσροφημένο ποσό, ούτε σε βάθος χρόνου αλλά ούτε και με την προσθήκη επιπλέον ακραίων ομάδων ικανών να προσροφώνται σε επιφάνειες. Στη συνέχεια επεκτείναμε τη μελέτη μας στην «αντίστροφη» αρχιτεκτονική. Διατηρήσαμε μια ακραία ομάδα και προσθέσαμε δύο και τρεις πολυμερικές αλυσίδες μεγάλου μοριακού βάρους (Μr=70000). Η αρχιτεκτονική που διαμορφώσαμε με τον τρόπο αυτό ήταν ουσιαστικά αρχιτεκτονική αστεροειδών πολυμερών με μικρό αριθμό πλοκαμιών. Στη περίπτωση αυτή παρατηρήσαμε μια σταδιακή μείωση του προσροφημένου ποσού με την προσθήκη επιπλέον βραχιόνων στο αστέρι. Η μείωση αύτη έχει παρατηρηθεί τόσο από μετρήσεις δυνάμεων, όσο και από μετρήσεις με ανάκλαση νετρονίων. Στα προφίλ δυνάμεων παρατηρούμε διαφοροποιήσεις σε σχέση με την γενική εικόνα που εμφανίζουν οι πολυμερικές βούρτσες. Αυτές οι διαφοροποιήσεις μπορούν να ερμηνευτούν με τη βοήθεια θεωρητικών προβλέψεων για τη συμπεριφορά των αστεροειδών πολυμερών. Η μείωση του προσροφημένου ποσού με αύξηση του αριθμού των πλοκαμιών μπορεί να αποδοθεί είτε σε λόγους κινητικής, είτε σε λόγους αλληλεπίδρασης μεταξύ των πολυμερικών αλυσίδων και μεταξύ των πλοκαμιών ενός μακρομορίου. Επίσης στη παρούσα διδακτορική διατριβή μελετήσαμε τη συμπεριφορά προσροφημένων ασθενών πολυ-ηλεκτρολυτών. Οι πολυ-ηλεκτρολύτες συγκεντρώνουν σταδιακά την προσοχή όλο και περισσότερων ερευνητών καθώς εμφανίζουν αρκετές σημαντικές εφαρμογές και είναι συμβατοί με βιολογικά συστήματα. Μέχρι πριν λίγο καιρό οι ασθενείς πολυ-ηλεκτρολύτες, όπως είναι το πολυακρυλικό οξύ που μελετούμε στη παρούσα εργασία, δεν είχαν μελετηθεί εκτενώς. Η μελέτη τους παρουσιάζει δυσκολίες, λόγω της πολυπλοκότητας στη συμπεριφορά τους. Αυτή εξαρτάται τόσο από τη συγκέντρωση άλατος του διαλύματος, όσο και από το pH. Μεταβάλλαμε τόσο τη συγκέντρωση άλατος του διαλύματος, όσο και το pH του διαλύματος εξετάζοντας πως αυτά επηρεάζουν το πάχος του προσροφημένου στρώματος και τα ποιοτικά χαρακτηριστικά των πολυ-ηλεκτρολυτικών προσροφημένων στρωμάτων. Παρατηρήσαμε λοιπόν μείωση του πάχους της πολυ-ηλεκτρολυτικής βούρτσας με αύξηση της συγκέντρωσης άλατος. Το αποτέλεσμα αυτό είναι πλήρως συμβατό με θεωρητικές προβλέψεις. Στη συνέχεια εξετάσαμε τη συμπεριφορά των ασθενών πολυ-ηλεκτρολυτών μεταβάλλοντας το pH του διαλύματος. Παρατηρήσαμε ότι με αύξηση του pH οι πολυμερικές αλυσίδες εκτείνονταν αυξάνοντας το πάχος της πολυμερικής βούρτσας. Αυτή η συμπεριφορά είναι άμεσο αποτέλεσμα της αύξησης του βαθμού διάστασης των πολυμερικών αλυσίδων. Αυξάνοντας το pH περισσότερα φορτία αποσπώνται από την πολυμερική αλυσίδα φορτίζοντάς την έτσι ισχυρότερα. Οι απωστικές ηλεκτροστατικές αλληλεπιδράσεις μεταξύ των φορτίων εξαναγκάζουν την αλυσίδα σε έκταση επιμηκύνοντας την πολυμερική βούρτσα. Τα αποτελέσματα αυτά είναι επίσης σε πλήρη συμφωνία με θεωρητικές προβλέψεις. / Flexible polymer chains end-tethered to a surface in good solvent tend to extend away from the surface due to excluded volume interactions. At sufficiently high grafting densities the chains become elongated normal to the surface, this extension being opposed by an elastic restoring force of entropic origin to form a layer of stretched chains referred to as a “polymer brush”. These systems have been studied extensively in recent years by numerous experimental techniques and theoretical methods. In the present investigation we have studied asymmetric star-shaped polymers whereby the different arms are either non-adsorbing PS chains or short PB chains terminating in a zwitterionic end-group known to adsorb strongly on surfaces such as mica or quartz. In this manner, it is possible on the one hand to form brushes with a single PS chain, but multiple zwitterionic stickers, and on the other to study the reverse case of multiple non-adsorbing arms attached to a surface via a single zwitterions. We have used the surface force balance technique to determine the interaction between such brush-layers formed on mica and neutron scattering to determine the absorbed amount and interanchor distance. Interactions between polymer brushes formed by highly asymmetric star-like polymers with a long PS arm and one, two or three short PB arms each terminating in a zwitterionic end-group were studied in order to explore the effect of the sticking energy on the brush structure. Polystyrene stars with two and three tails bearing a single end group were also studied to investigate how the height of the adsorbed layer and the grafting density are affected. Our measurements show no significant differences between PS with 1, 2 and 3 end groups. This may be due to kinetic reasons since additional polymer chains are hindered from attaching to a brush-bearing surface. The behavior of two PS chains with one end-group ((PS)2-PB-X) seems not to differ appreciably from that of PS-PB-X copolymer. On the other hand three PS chains with one end-group ((PS)3-PB-X) appeared to form layers with smaller brush height and greater interanchoring distance, relative to PS-PB-X layers. We can attribute this to the extra stretching that the three-chain architecture imposes on the adsorbed brush. In the present investigation we have also studied weak polyelectrolytes. Polyelectrolytes (charged polymer chains) remain among the least understood materials despite their importance in biology (proteins, DNA) and materials science. Their behavior and characteristics are not yet fully understood because of complicated correlations due to their charged nature that gives rise to long-range interactions. The counterplay of their properties as polymers and electrolytes with counterions around polyelectrolyte chains imposes additional difficulties on explaining their behavior. The association of counterions around polyelectrolytes and the pH of the solution are two parameters than can affect the properties of such systems. Especially weak polyelectrolytes (like poly-acrylic acid) are even sensitive to pH changes because of the alterable degree of dissociation. We measured forces between two charged polymer layers of Poly (isoprene-acrylic acid) diblock copolymers adsorbed on mica surfaces. Poly (isoprene-acrylic acid) diblock copolymers can be adsorbed from one end (poly-isoprene) which is sorter than the poly-(acrylic acid) part. The properties of the polymer layer at various salt concentrations and different pH of the solutions were measured by Surface Forces Apparatus. Information about the height of the polymer layer, and the adsorbed amount were extrapolated. The extracted results were compared with theoretical predictions showing well fit.