Οι πρωτεογλυκάνες και οι αλυσίδες γλυκοζαμινογλυκανών τους αλληλεπιδρούν με αυξητικούς παράγοντες, διαμεμβρανικούς υποδοχείς όπως οι ιντεγκρίνες, ένζυμα, αναστολείς πρωτεασών και με άλλα μόρια της εξωκυττάριας ύλης όπως η ινονεκτίνη, η λαμινίνη και η tenascin. Στην παρούσα διατριβή μελετήσαμε τη χωροχρονική κατανομή των πρωτεογλυκανών versican και CD44 με τη μέθοδο της RT-PCR και του ανοσοφθορισμού από το στάδιο ΧΙ-ΧΙΙ (μορίδιο) έως το στάδιο ΗΗ16+ (28-29 ζεύγη σωμιτών) και τον ρόλο της versican και της CD44 με τη χρήση μονοκλωνικών αντισωμάτων έναντι αυτών κατά την ανάπτυξη του πρώιμου εμβρύου. Η versican είναι πρωτεογλυκάνη θειικής χονδροϊτίνης και αλληλεπιδρά με αυξητικούς παράγοντες, με διάφορες πρωτεΐνες της εξωκυττάριας ύλης και με διαμεμβρανικούς υποδοχείς όπως η CD44. Τα αποτελέσματα της RT-PCR έδειξαν ότι το mRNA της versican εκφράζεται σε όλα τα αναπτυξιακά στάδια που μελετήσαμε. Ενδιαφέρον παρουσιάζουν τα προϊόντα εναλλακτικής ωρίμανσης της versican που ανιχνεύσαμε ακόμα και στο στάδιο του μοριδίου και που η έκφρασή τους ρυθμίζεται αναπτυξιακά. Η παρουσία του mRNA της versican σε υψηλά επίπεδα στο στάδιο του μοριδίου (ΧΙ-ΧΙΙ) υποδεικνύει ότι το mRNA της versican είναι ωογενετικής προέλευσης στο στάδιο αυτό. Τα πειράματα μας του ανοσοφθορισμού έδειξαν ότι η versican πρωτεΐνη ανιχνεύεται στο στάδιο του μοριδίου και εκφράζεται έντονα στην επιβλάστη και στην υποβλάστη στο στάδιο του προχωρημένου βλαστιδίου (στάδιο ΧΙΙΙ). Στο στάδιο ΗΗ3+ (ενδιάμεσο γαστρίδιο / intermediate streak) παρατηρήσαμε μεγάλη ένταση φθορισμού στα κύτταρα που μεταναστεύουν μέσα από την πρωτογενή αύλακα και στα μεσεγχυματικά κύτταρα που θα σχηματίσουν το μεσόδερμα και το ενδόδερμα. Στο στάδιο ΗΗ4 (προχωρημένο γαστρίδιο / definitive streak) ένταση φθορισμού της versican ανιχνεύθηκε κύτταρα που μεταναστεύουν μέσα από την πρωτογενή αύλακα καθώς και στα κύτταρα που έχουν αρχίσει να σχηματίζουν το μεσόδερμα και το ενδόδερμα. Στο στάδιο που το έμβρυο έχει σχηματίσει 4 ζεύγη σωμιτών (στάδιο ΗΗ8), ανιχνεύσαμε υψηλή ένταση φθορισμού της versican στη νευρική πλάκα και στις νευρικές πτυχές καθώς ανασηκώνονται να σχηματίσουν το νευρικό σωλήνα. Στο στάδιο ΗΗ12 (16 ζεύγη σωμιτών), ισχυρή ένταση φθορισμού της versican ανιχνεύσαμε στο νευρικό σωλήνα, στο γειτονικό του εξώδερμα, στα κύτταρα της νευρικής ακρολοφίας (neural crest), στα κύτταρα του σωμίτη, στο μεσονέφρο και στο γειτονικό του πλάγιο μεσόδερμα που θα σχηματίσει τους μεσονεφρικούς σωληνίσκους. Αργότερα στην ανάπτυξη, ισχυρή ένταση φθορισμού της versican ανιχνεύσαμε επίσης στο διεγκέφαλο, στον οπτικό μίσχο, στο μεσεγκέφαλο, στο μυελεγκέφαλο, στα τοιχώματα του φάρυγγα και της ραχιαίας αορτής, στο ραχιαίο μεσοκάρδιο, στο μυοκάρδιο και στο ενδοκάρδιο, στο μυοτόμο και σκληροτόμο στους σωμίτες, στα τοιχώματα του εντέρου, καθώς και στην εξωκυττάρια ύλη των εμβρυϊκών κοιλοτήτων. Πειράματα σε έμβρυα που εκτέθηκαν στο αντίσωμα έναντι της versican σε διαφορετικά στάδια ανάπτυξης από το μορίδιο ως το προχωρημένο γαστρίδιο έδειξαν ότι η versican πιθανόν να συμμετέχει στα μονοπάτια σηματοδότησης που καθοδηγούν τη μετανάστευση των κυττάρων της νευρικής ακρολοφίας, στο μοριακό δίκτυο για το σχηματισμό του νευρικού σωλήνα, στον καθορισμό ή / και στη διαμερισματοποίηση των προκαρδιακών κυττάρων κατά το σχηματισμό της καρδιάς και στη διατήρηση της αρχιτεκτονικής των εμβρυϊκών κοιλοτήτων. Η CD44 είναι πρωτεογλυκάνη της κυτταρικής επιφάνειας και είναι ο κύριος υποδοχέας του υαλουρονικού. Ανιχνεύσαμε τη CD44 πρωτεΐνη ακόμα και στο στάδιο του μοριδίου. Η παρουσία του mRNA της CD44 σε υψηλά επίπεδα στο στάδιο του μοριδίου μπορεί να δείχνει ότι το mRNA είναι ωογενετικής προέλευσης. Με τη μέθοδο του ανοσοφθορισμού ανιχνεύσαμε έντονο φθορισμό της CD44 στα κύτταρα της επιβλάστης και ειδικότερα σε αυτά που γειτονεύουν με το βλαστόκοιλο και στην υποβλάστη στο στάδιο του προχωρημένου βλαστίδιου (ΧΙΙΙ), ενώ στο στάδιο ΗΗ3+ καθώς συνεχίζονται οι μορφογενετικές κινήσεις της γαστριδίωσης, η CD44 παρουσιάζει ισχυρή ένταση φθορισμού στα κύτταρα της επιβλάστης ,στα μεσεγχυματικά κύτταρα και στα κύτταρα του ενδοδέρματος. Στο στάδιο ΗΗ8 (4 ζεύγη σωμίτες), ανιχνεύσαμε ένταση φθορισμού της CD44 στη νευρική πλάκα και στις νευρικές πτυχές με πρότυπο έκφρασης παρόμοιο με αυτό της έκφρασης της versican. Αργότερα στην ανάπτυξη, στο στάδιο ΗΗ16+ (28-29 ζεύγη σωμιτών) ανιχνεύσαμε ισχυρή ένταση φθορισμού της CD44 ανιχνεύθηκε στα τοιχώματα του διεγκεφάλου, του μεσεγκεφάλου και του νευρικού σωλήνα, στα τοιχώματα του φάρυγγα, στις ραχιαίες και κοιλιακές αορτές, στα αορτικά τόξα, στη νωτοχορδή, στην εξωκυττάρια ύλη στην κοιλότητα του μεσεγκεφάλου και στην κοιλότητα του φάρυγγα, στο ακουστικό κυστίδιο και στην κοιλότητα του ακουστικού κυστιδίου και στα κύτταρα της νευρικής ακρολοφίας που μεταναστεύουν προς το ακουστικό κυστίδιο. Υψηλή ένταση φθορισμού της CD44 ανιχνεύσαμε επίσης στο σκληροτόμο και στο μυοτόμο στους σωμίτες, στα κύτταρα της νευρικής ακρολοφίας, στο ήπαρ, στο μυοκάρδιο, στο ενδοκάρδιο, στον αγωγό φλέβας και στο μεσονέφρο. Έμβρυα που εκτέθηκαν στο αντίσωμα έναντι της CD44 σε διαφορετικά στάδια ανάπτυξης από το μορίδιο ως το πρώιμο νευρίδιο έδειξαν το σημαντικό ρόλο της CD44 στην μορφογένεση του εγκεφάλου, στη διατήρηση της αρχιτεκτονικής της κοιλότητας του εγκεφάλου και των άλλων εμβρυϊκών κοιλοτήτων, στην μετανάστευση των κυττάρων της νευρικής ακρολοφίας, στον σχηματισμό της καρδιάς και του αγγειακού συστήματος και στη μορφογένεση των σωμιτών. Τα αποτελέσματα μας έδειξαν τη συνεργιστική δράση των CD44 και versican κατά την ανάπτυξη του πρώιμου εμβρύου. / Proteoglycans and their associated glycosaminoglycans can bind growth factors, integrin and non-integrin cell surface molecules, enzymes, protease inhibitors and other extracellular matrix components including fibronectin, laminin and tenascin. We studied the expression and spatiotemporal distribution of versican and CD44 by RT-PCR and immunofluorescence in the chick embryo from the morula stage (stage XI-XII) to early organogenesis (stage HH16+, 28-29 somites). We also studied the versican and CD44 role by using blocking antibodies in the early chick embryo. Versican is a chondroitin sulfate proteoglycan that binds growth factors and interacts with various extracellular matrix proteins and cell surface molecules including the CD44. Combined RT-PCR and immunohistochemistry demonstrated the expression of versican as early as the morula stage. Interestingly, we detected splice variants of versican at the morula stage, and their expression was developmentally regulated. The presence of versican mRNA at the morula stage may indicate that it is of oogenetic origin. Versican fluorescence was strong in the epiblast and the hypoblast at the late blastula stage (XIII). At stage HH3+ (intermediate streak), versican expression was intense in the cells ingressing through the primitive streak and the migrating mesenchymal cells which will form the mesoderm and endoderm. By the definitive streak stage (HH4), versican fluorescence was intense in the cells ingressing through the primitive streak and in the mesenchymal cells that have already started to form the mesoderm and endoderm. At stage HH8 (4 somite pairs), versican expression was strong in the neural plate, the elevated neural folds and the ectoderm neighboring the neural folds. At stage HH12 (16 somite pairs), versican fluorescence was intense in the neural tube and its adjacent ectoderm, the neural crest cells, the somite and in the mesonephros and in the adjacent lateral mesoderm that will form the mesonephric tubules. Later in development, versican fluorescence was intense in the diencephalon, the optic stalk, mesencephalon, myelencephalon. Versican fluorescence was also intense in the dorsal mesocardium, myocardium and endocardium, dorsal aorta and aortic arches, in the myotome and sclerotome in somites, gut and in the extracellular matrix of embryonic cavities. Inhibition of the function of versican by blocking antibodies showed that versican is crucial for the neural tube closure, neural crest migration, formation of the heart tube, for the architecture of embryonic cavities and consequently tissue and organ morphogenesis. CD44 is a transmembrane part-time proteoglycan and the main receptor for hyaluronan. We detected CD44 protein even at the morula stage. The presence of high levels of CD44 mRNA at the morula stage indicated that this is an oogenetic mRNA. CD44 fluorescence was strong in the epiblast cells, especially those neighboring the blastocoele, and in the hypoblast at the late blastula stage (XIII). At stage HH3+, during gastrulation, CD44 was expressed strongly in the epiblast cells, in mesenchymal cells and in endoderm cells. At stage HH8 (4 somite pairs), strong CD44 expression was detected in the neural plate and neural folds and their adjacent ectoderm and this expression pattern was similar to that of versican. Later in development, CD44 expression was intense in the diencephalon, optic stalks, mesencephalon, myelencephalon, metencephalon, auditory vesicles and the neural crest cells migrating towards the auditory vesicle and the neural tube. CD44 fluorescence was also intense in the dorsal mesocardium, myocardium, endocardium, aortae and aortic arches, sclerotome and myotome in somites, mesonephros, liver, gut and in the migrating neural crest cells that will form the sympathetic and enteric ganglia. Inhibition of CD44 function by blocking antibodies showed that CD44 is crucial for the architecture of the embryonic cavities such as the brain lumen, neural tube closure, neural crest cell migration, cardiac and cardiovascular formation and somite morphogenesis. Our results showed a synergistic role of CD44 and versican during the development of the early embryo.

Οι καρκίνοι του γαστρεντερικού συστήματος είναι από τους πιο συνηθισμένους τύπους καρκίνου στον αναπτυγμένο κόσμο. Ο καρκίνος του παχέος εντέρου είναι εκείνος με τη μεγαλύτερη συχνότητα εμφάνισης, αλλά αντιμετωπίζεται με αρκετά καλή πρόγνωση. Αντίθετα, ο καρκίνος του παγκρέατος είναι εκείνος με τη χειρότερη πρόγνωση και πολλές φορές δεν αντιμετωπίζεται. Τα τελευταία χρόνια αναπτύσσεται εκτεταμένη έρευνα στα εξωκυττάρια μακρομόρια των καρκινικών ιστών και στο ρόλο τους στην ανάπτυξη και εξέλιξη του καρκίνου, όπως επίσης και στις δυνατότητες επηρεασμού των παραγόντων αυτών φαρμακευτικά. Η παρούσα Διατριβή έχει δύο στόχους, ο πρώτος σχετίζεται με τη μελέτη των εξωκυττάριων πρωτεογλυκανών στον καρκίνο του παγκρέατος και ο δεύτερος με τη μελέτη του μεταβολισμού του υαλουρονικού οξέος στον καρκίνο του παχέος εντέρου μέσω της μελέτης των βιοσυνθετικών και καταβολικών του ενζύμων. Ο πρώτος στόχος διερευνήθηκε με συνδυασμό βιοχημικών και ανοσοϊστοχημικών τεχνικών, από τα αποτελέσματα των οποίων διαπιστώθηκε ότι μόνο δύο πρωτεογλυκανικά μόρια ανευρίσκονται στο παγκρεατικό καρκίνωμα, η versican και η decorin. Και οι δύο πρωτεογλυκάνες εντοπίστηκαν στο στρώμα και απουσίαζαν πλήρως από τα καρκινικά κύτταρα, γεγονός που υποστηρίζει ότι παράγονται από τις ινοβλάστες του στρώματος. Ήταν σημαντική η αύξηση των ποσοτήτων των δύο πρωτεογλυκανών στο παγκρεατικό καρκίνωμα, σε σχέση με το φυσιολογικό πάγκρεας και μεγάλη η διαφορά που εμφάνιζαν μεταξύ τους. Η versican αυξήθηκε 27 φορές και η decorin 7 φορές, σε σχέση με το φυσιολογικό πάγκρεας. Η μεγαλύτερη αύξηση της versican σχετίζεται με τις ιδιότητες της πρωτεογλυκάνης, τόσο δομικές, ενυδατικές, χωροπληρωτικές, όσο και λειτουργικές, εφ’ όσον πρόκειται για πολυλειτουργικό μόριο. Επί πλέον, η versican συμβάλλει στην κατακόρυφη αύξηση του κυτταρικού πολλαπλασιασμού, ενώ παράλληλα συμβάλλει και στις αντι-προσκολλητικές ιδιότητες των κυττάρων, παρέχοντας τη δυνατότητα για υπέρμετρη, και πολλές φορές ανεξέλεκτη, κυτταρική ανάπτυξη σε τοπικό επίπεδο. Το γεγονός της χαμηλότερης αύξησης της συγκέντρωσης της decorin, σε σχέση με εκείνη της versican, θα μπορούσε να αποτελεί ένα μέτρο της επιθετικότητας του καρκίνου ή ακόμα, ένα μέτρο της κακοήθειας. Η αύξηση των πρωτεογλυκανών συνοδευόταν από σημαντικότατες αλλαγές στη βιοχημική δομή τους σε επίπεδο υδροδυναμικού μεγέθους, βαθμού και προτύπου θείωσης, όπως επίσης και επιμερίωσης του γλυκουρονικού σε ιδουρονικό. Οι αλλαγές αυτές θα μπορούσε να οφείλονται σε πολλαπλές αλλοιώσεις των βιοσυνθετικών μονοπατιών τους. Ο δεύτερος στόχος διερευνήθηκε με συνδυασμό ενζυμολογικών, ανοσοενζυμικών και μοριακών τεχνικών, από τα αποτελέσματα των οποίων διαπιστώθηκε σε όλα τα δείγματα η παρουσία των ισομορφών υαλουρονιδάσης Hyal1 και ΡΗ20, και σε πολλαπλές μορφές, αλλά και των Hyal2 και Hyal3, όμως μόνο σε προχωρημένο στάδιο, ως επίσης και η παρουσία των τριών συνθασών του υαλουρονικού. Παρατηρήθηκε σημαντική μεταβολή της έκφρασης με το καρκινικό στάδιο. Η Hyal1 εκφραζόταν σε πολύ χαμηλά επίπεδα σε μακροσκοπικώς φυσιολογικά δείγματα παχέος εντέρου με καρκίνο σταδίου Α, όμως η έκφρασή της ήταν πάνω από δέκα φορές μεγαλύτερη στα αντίστοιχα καρκινικά, υποστηρίζοντας ότι η Hyal1 παράγεται από τα καρκινικά κύτταρα. Το γεγονός ότι η έκφραση της Hyal1 στα καρκινικά δείγματα εμφάνιζε σταδιο-εξαρτώμενη μείωση, σε συνδυασμό με το δεδομένο ότι η δράση της οδηγεί στην παραγωγή αγγειογενετικών θραυσμάτων υαλουρονικού, έρχεται σε συμφωνία με το δεδομένο ότι η διαδικασία της αγγειογένεσης απαιτείται κυρίως στα αρχικά στάδια της καρκινικής εξαλλαγής. Από την άλλη πλευρά, η ΡΗ20 εμφάνιζε υψηλότερη έκφραση, σε σχέση με την Hyal1, στα μακροσκοπικώς φυσιολογικά δείγματα σταδίου Α, η οποία όμως αυξανόταν τέσσερις φορές στα αντίστοιχα καρκινικά, υποδεικνύοντας και τη δική της συμμετοχή στη 10 διαδικασία της αγγειογένεσης. Στα επόμενα στάδια υπήρχε μεν αύξηση στην έκφραση της ΡΗ20, αυτή όμως ήταν μικρή, και πιθανόν να λειτουργεί με σκοπό την ακόμα μεγαλύτερη αποικοδόμηση του υαλουρονικού ώστε να χαλαρώσει η δομή του εξωκυττάριου χώρου και να δοθεί η δυνατότητα ανάπτυξης του καρκίνου ή μετάστασης των καρκινικών κυττάρων. Παράλληλα, διαπιστώθηκε μικρή αύξηση της έκφρασης της ΡΗ20 στα μακροσκοπικώς φυσιολογικά δείγματα σταδίου Β και πολύ μεγαλύτερη σε εκείνα σταδίου C. Από τον έλεγχο της έκφρασης των συνθασών του υαλουρονικού διαπιστώθηκε ότι υπάρχει σημαντική σταδιο-εξαρτώμενη αύξηση της HAS1, η οποία οδηγεί στη βιοσύνθεση υαλουρονικού μεγάλου μοριακού μεγέθους, υποστηρίζοντας ότι ο καρκίνος συντονίζει την παραγωγή υαλουρονικού με μέγεθος τέτοιο που, σύμφωνα με τις χωροπληρωτικές και ενυδατικές του ιδιότητες, μπορεί να βοηθήσει την ενυδάτωση του εξωκυττάριου χώρου και την κυτταρική ανάπτυξη. Από την άλλη πλευρά, η HAS2 εμφάνιζε μικρή σταδιο-εξαρτώμενη αύξηση, μόνο στα καρκινικά δείγματα, η οποία μπορεί να οδηγήσει στη βιοσύνθεση μεγαλομοριακού υαλουρονικού, που απαιτείται για τη σωστή και οργανωμένη ανάπτυξη του καρκινικού όγκου. Τέλος, η HAS3 εμφάνιζε μικρή σταδιο-εξαρτώμενη μείωση, υποδηλώνοντας ότι η παρουσία της είναι απαραίτητη σε σχεδόν σταθερό βαθμό για την ανάπτυξη και εξέλιξη του καρκίνου και τούτο γιατί το προϊόν της είναι μικρότερου μοριακού μεγέθους σε σχέση με τις υπόλοιπες συνθάσες. Αυτό εξ άλλου υποστηρίζεται και από το γεγονός ότι η HAS3 εμφανίζει τη μεγαλύτερη έκφραση σε σχέση με τις άλλες συνθάσες σε δείγματα σταδίου Α, στάδιο που είναι κρίσιμο για την αγγειογένεση και την υποβοήθηση της διατροφής των καρκινικών κυττάρων. Συμπερασματικά, γίνεται φανερό ότι τα καρκινικά κύτταρα συνδυάζουν πολλούς μηχανισμούς για την ανάπτυξη, τη διήθηση και την επέκταση του καρκίνου και τα εξωκυττάρια μακρομόρια μπορεί να έχουν κομβικό ρόλο σ’ αυτούς. Οι μηχανισμοί αυτοί, όπως μελετήθηκαν στην παρούσα διατριβή, είναι: ελεγχόμενη αύξηση της συγκέντρωσης των πρωτεογλυκανών versican και decorin, εξειδικευμένες τροποποιήσεις στη βιοχημική δομή των γλυκοζαμινογλυκανών, ελεγχόμενη έκφραση των βιοσυνθετικών και καταβολικών ενζύμων του υαλουρονικού. Όλες αυτές οι μεταβολές συντονίζονται κατά τέτοιο τρόπο ώστε να εξυπηρετήσουν τις απαιτήσεις του καρκίνου είτε στο επίπεδο της αγγειογένεσης είτε στο επίπεδο της οργάνωσης του εξωκυττάριου χώρου. Οι μελλοντικές μελέτες θα πρέπει να προσανατολιστούν ακόμα περισσότερο στη συσχέτιση χημικής δομής και λειτουργικότητας των αλυσίδων θειικής χονδροϊτίνης/δερματάνης, ώστε να γίνουν πλήρως αντιληπτοί οι ρόλοι αυτών των μακρομορίων, όπως επίσης στους ρυθμιστικούς μηχανισμούς που ελέγχουν την έκφραση των ενζύμων του μεταβολισμού του υαλουρονικού, με απώτερο στόχο την ειδικότερη και πληρέστερη φαρμακευτική αντιμετώπιση του καρκίνου. / Cancers of gastrointestinal tract are the most common type of cancers in developed world. Colorectal cancer has the highest incidence, however it is treated with rather good prognosis. On the other hand, pancreatic cancer has very bad prognosis and in most cases it cannot be treated. The last years extended research focused to the extracellular macromolecules of cancer, their role in cancer progression and their possible use as drug targets. The present Thesis aimed to study the extracellular proteoglycans structure in pancreatic cancer and the hyaluronan metabolism in colorectal cancer. The first was investigated by using a combination of biochemical and immunohistochemical techniques, and from their results it was found that two extracellular proteoglycans were present in pancreatic carcinoma, versican and decorin. Both proteoglycans were detected in the stroma and were absent from cancer cells, suggesting their biosynthesis from normal fibroblasts. In addition, their amounts were highly increased in pancreatic carcinoma, as compared with normal pancreas. Their increase in cancer was disproportional. Versican was increased 27 times and decorin 7 times, as compared with normal pancreas. Versican increase is related to its structural, hydration and space-filling properties, as well as to its function, since it is a multifunctional macromolecule. Versican enhances cell proliferation, and together with its anti-adhesive properties, allows mainly uncontrolled cellular growth locally. The lower increase of decorin, as compared with that of versican, could explain aggressiveness and malignancy of pancreatic cancer. Proteoglycans increase was followed by extensive alterations in their biochemical structure, namely, hydrodynamic size, sulphation pattern, and epimerization of glucuronate to iduronate. These should be attributed to multiple alterations of their biosynthetic pathways. The second was investigated by using a combination of enzymatic, immunoenzymatic and molecular techniques, and from their results it was found that multiple forms of Hyal1 and PH20 were present in all samples, as well as all hyaluronan synthases (HASs). Hyal2 and Hyal3 were present in some samples of advanced stage of cancer. Changes in expression with cancer stage were observed. Hyal1 expressed in low levels in apparently macroscopically normal parts of stage A samples, and its expression was 10 times greater in the respective cancerous. This finding suggested that Hyal1 is produced from cancer cells. Hyal1 expresssion showed a stage-related decrease and since its activity results to hyaluronan fragments of angiogenetic size, it could be concluded that Hyal1 is required at early stage of cancer. PH20 expressed in a higher rate than Hyal1 in apparently macroscopically normal parts of stage A samples, and its expression was 4 times greater in the respective cancerous, suggesting its participation in angiogenesis. In advanced stages, PH20 expression was slightly increased, suggesting its participation in extracellular matrix disorganization to permit cancer growth and progression, as well as metastasis. This was also observed in apparently macroscopically normal parts of samples of advanced stages. From the examination of the expression of the various HASs, a great and stage-related increase of HAS1 was found. This enzyme is responsible for the biosynthesis of hyaluronan of very high molecular size and thus it could be suggested that cancer regulates hyaluronan biosynthesis in such a way to fulfill cancer requirements in matrix hydration. HAS2 expression was also increased in a stage-related order only in cancerous samples, but the increase was lower than that of HAS1. This enzyme is responsible for the biosynthesis of hyaluronan of high molecular size which might be required for well-organized cancer growth. HAS3 expression was slightly decreased in a stage-related order, suggesting that its presence is stably required for the correct cancer growth and progression, since its biosynthetic product is of lower hydrodynamic size, as compared with that of HAS1 and 12 HAS2. Moreover, HAS3 expression was higher than that of both other HASs in samples of stage A, a stage very critical for angiogenesis. From the results obtained, it could be concluded that cancer cells combine a variety of multiple mechanisms for cancer growth, progression and invasion, and that extracellular macromolecules might play a very critical role. The mechanisms, as studied in the present Thesis, are: selective and highly regulated increase of the proteoglycans versican and decorin, selective modifications of glycosaminoglycans biochemical structure, selective and highly regulated expression of biosynthetic and catabolic enzymes related to hyaluronan. All these changes coordinate to fulfill cancer requirements for either angiogenesis or extracellular matrix organization, depending on its stage. Future studies will be oriented to chondroitin/dermatan sulphate structure/function relationship for better understanding of the role of these macromolecules in cancer, and of the regulatory mechanisms implicated in the expression of the enzymes involved in hyaluronan metabolism, aiming at the cancer treatment.

Η νεοπλασία των όρχεων, αν και σχετικά αποτελεί μια σπάνια μορφή νεοπλασίας (1- 2% όλων των νεοπλασμάτων του άνδρα), είναι ο πιο συχνός όγκος στις ηλικίες 20-40 ετών, αποτελώντας την τρίτη κατά σειρά αιτία θανάτου στις ηλικίες αυτές. Περίπου το 95% των όγκων όρχεων προέρχεται από τα βλαστικά κύτταρα. Η αλληλεπίδραση των κυττάρων με άλλα κύτταρα ή με συστατικά του εξωκυττάριου χώρου, καθώς και η μετακίνηση στο ενδοθήλιο των αρτηριών και στο εξωφλεβικό ιστό, είναι εξαρτημένη από την ενεργότητα των μορίων προσκόλλησης όπως οι ιντεγκρίνες, οι σελεκτίνες και μέλη της υπεροικογένειας των ανοσοσφαιρινών, καντχερίνες και ο CD44. Ο CD44 είναι μια γλυκοπρωτεΐνη και αποτελεί τον κύριο υποδοχέα του ΗA. Η ισομορφή που δεν περιέχει ενδιάμεσα εξώνια ονομάζεται CD44s, ενώ όλες οι υπόλοιπες ισομορφές προκύπτουν με εναλλακτικό μάτισμα δέκα διαφορετικών εξωνίων, παράγοντας πληθώρα διαφορετικών μορίων του CD44. Πληθώρα μελετών υποστηρίζει ότι ο μεμβρανικός υποδοχέας CD44 και το ΗΑ υπερεκφράζονται σε πολλές κακοήθειες και η αλληλεπίδρασή τους διεγείρει σειρά λειτουργιών στα κύτταρα του όγκου που συντελούν στην πρόοδο της νόσου. Η κύρια ισομορφή CD44s εκφράζεται ευρέως στους ιστούς και υπερεκφράζεται σε διάφορους τύπους καρκίνου όπου και συνυπάρχει με το ΗΑ, ενώ κάποιες ισομορφές όπως η CD44v5, CD44v6, παίζουν σημαντικό ρόλο στην επιθετικότητα μερικών τύπων καρκίνου. Η έκφραση του CD44 έχει μελετηθεί μερικώς στους όγκους όρχεων και έχουν δημοσιευθεί αντικρουόμενα ευρήματα, ενώ δεν υπάρχουν διαθέσιμα στοιχεία για την έκφραση των ενζύμων που συνθέτουν το ΗΑ. Στόχος της μεταπτυχιακής εργασίας ήταν να διερευνηθεί η έκφραση των ισομορφών του CD44 και των συνθασών του ΗΑ σε τρεις κυτταρικές σειρές όγκων όρχεων (Σεμίνωμα, Εμβρυϊκό καρκίνωμα, Τερατοκαρκίνωμα). Η μελέτη του υποδοχέα CD44 πραγματοποιήθηκε με RT-PCR και ανοσοαποτύπωση. Σε επίπεδο mRNA βρέθηκε πως η κύρια ισομορφή του CD44 που εκφράζεται στο σεμίνωμα καθώς και σε μη- σεμινωματώδεις όγκους είναι η ισομορφή CD44s. Ακόμη στην κυτταρική σειρά σεμινώματος όρχεων εκφράζονται και άλλες ισομορφές, κυρίως όμως εκφράζονται οι ισομορφές CD44v7-v10, CD44v8-v10, CD44v9-v10 και CD44v10. Στις κυτταρικές σειρές μη σεμινωματωδών όγκων (εμβρυϊκό καρκίνωμα και τερατοκαρκίνωμα) εκτός της CD44s ισομορφής που είναι η κυρίαρχη ισομορφή εκφράζονται και κάποιες άλλες ισομορφές του CD44. Στο εμβρυϊκό καρκίνωμα εκφράζονται οι ισομορφές CD44v5,v8, CD44v9-v10 και CD44v10, ενώ στο τερατοκαρκίνωμα παρατηρείται η έκφραση κυρίως της CD44v5,v8, ενώ εκφράζονται και οι CD44v5,v9, CD44v5, CD44v8-v10, CD44v9-v10 και η CD44v10. Η μελέτη του CD44 σε επίπεδο πρωτεΐνης με το αντίσωμα Hermes-3 κατέδειξε πως η κύρια ισομορφή που εκφράζεται στην κυτταρική σειρά σεμινώματος είναι η CD44s με μοριακό βάρος~90kDa. Ακόμα φάνηκε πως υπάρχει έκφραση και κάποιων ισομορφών και θραυσμάτων του CD44 με μικρότερο μοριακό μέγεθος. Αντίθετα στις κυτταρικές σειρές εμβρυϊκού καρκίνωματος και τερατοκαρκινώματος παρατηρήθηκε η έκφραση μόνο της CD44s ισομορφής. Αντίθετα με την υψηλή έκφραση του CD44s στην κυτταρική σειρά σεμινώματος, παρατηρήθηκε μικρή έκφραση του CD44s στην κυτταρική σειρά εμβρυϊκού καρκινώματος και μια ελάχιστη έκφραση στην κυτταρική σειρά του τερατοκαρκινώματος. Η μελέτη του υποδοχέα CD44 σε επίπεδο ιστού έδειξε ότι η πρωτεΐνη του CD44 εκφράζεται στα κύτταρα του όγκου. Η σηματοδοτική δράση του ΗΑ στα καρκινικά κύτταρα μέσω του υποδοχέα CD44 έχει προταθεί ως βασικό βήμα για την ανάπτυξη και πρόοδο της νόσου. Οι συνθάσες του HA είναι τα ένζυμα που βιοσυνθέτουν το ΗΑ και διακρίνονται σε τρεις ισομορφές τις HAS- 1, HAS-2, HAS-3α, και HAS-3β. Στα πλαίσια της μεταπτυχιακής διατριβής βρέθηκε πως η κυτταρική σειρά σεμινώματος εκφράζει μόνο την ισομορφή HAS-3α, ενώ οι κυτταρικές σειρές εμβρυϊκού καρκινώματος και τερατοκαρκινώματος εμφανίζουν ισχυρή έκφραση της ισομορφής HAS-3α και μικρή έκφραση της HAS-2. / Testicular tumors are present in men aged 15-35 years with increasing incidence in the last 40 years. Approximately 95% of these tumors arise from germ cells. The interaction of cells with other cells or with components of the extracellular matrix (ECM), as well as their locomotion on blood vessel endothelium and extravascular tissue, are substantially dependent on the activity of adhesion molecules such as integrins, selectins, members of the immunoglobulin superfamily, addressins, cadherins, and CD44. CD44 is a glycoprotein and represents the major receptor for HA. The isoform with no variant exons is named CD44s, whereas the other isoforms arise from alternative splicing of the 10 variant exons of the CD44 mRNA, producing a huge variety of diverse CD44 molecules. A lot of studies supports that the membrane receptor CD44 and HA are overexpressed in several malignancies and their interaction trigger fuctions in tumour cells, which conduce to the disease progression. The major isoform is the CD44s which is expressed widely in tissues, whereas is overexpressed in several types of tumours ,coexisting with HA. The expression of CD44 has been partly studied in testicular tumours but controversial findings have been published, whereas no data about the enzymes which synthesize HA are available. The aim of this thesis was to examine the expression of CD44 isoforms and HA synthases in three cell lines (seminoma, embryonic carcinoma, teratocarcinoma). The study of CD44 was conducted by RT-PCR analysis and western blotting. It was found that in mRNA level, the major isoform that is expressed in seminoma and nonseminomas is the CD44s isoform. Moreover, in seminoma cell line, other isoforms are also expressed, namely CD44v7-v10, CD44v8-v10, CD44v9-v10 and CD44v10 isoforms. In nonseminomas cell lines CD44s is expressed as the major isoform , but also other isoforms are expressed. CD44v5,v8, CD44v9-v10 and CD44v10 isoforms are expressed in embryonic carcinoma , whereas in teratocarcinoma the expression mainly of the CD44v5,v8 isoform is observed, together with CD44v5,v9, CD44v5, CD44v8-v10, CD44v9-v10 and CD44v10 isoforms. The study of CD44 in protein level conducted by western blotting using the monoclonal antibody Hermes-3. It was shown that the major isoform expressed in seminoma cell line is CD44s with a molecular mass approximately 90kDa. Moreover it was shown that other CD44 isoforms and CD44 fragments with smaller molecular mass are expressed. On the other hand, in embryonic carcinoma and teratocarcinoma cell lines, the expression only of CD44s isoform was observed. The study of CD44 in tissue level revealed that CD44protein is expressed in tumour cells. The signaling effect of HA in tumor cells through CD44 has been stated to be a crucial step in the development and progression of the disease. The synthases of HA are the enzymes that produce HA and represent three distinct isoforms HAS-1, HAS-2, HAS-3a, and HAS-3b. The findings of this study revealed that seminoma cell line express only HAS-3a isoform, whereas embryonic carcinoma and teratocarcinoma cell lines showed high expression of HAS-3a isoform and low expression of HAS-2 isoform.