Οι θυρεοειδικές ορμόνες (Τ3 και Τ4) είναι απαραίτητες στην ανάπτυξη, τη διαφοροποίηση και την ωρίμαση του νευρικού συστήματος. H δράση τους έχει συσχετιστεί με αλλαγές στη συμπεριφορά, ψυχικές και κινητικές δυσλειτουργίες.Η ντοπαμινεργική νεύρωση των βασικών γαγγλίων και κυρίως του ραβδωτού, είναι γνωστό ότι, παίζει κεντρικό ρόλο σ’ ένα ευρύ φάσμα κινητικών, γνωστικών και συναισθηματικών λειτουργιών.Ο υποθυρεοειδισμός προκαλεί μορφολογικές διαταραχές σε εγκέφαλο ενήλικα επίμυ, ακριβέστερα μείωση, αξονικής και δενδριτικής ανάπτυξης των νευρώνων του ραβδωτού, και τροποποιεί την ικανότητα δέσμευσης ανταγωνιστών της ντοπαμίνης. Όμως το κυτταρικό και μοριακό υπόβαθρο των ανωτέρω επιδράσεων παραμένει κατά ένα μεγάλο μέρος αδιευκρίνιστο. Κατά την διατριβή αυτή μελετήθηκε η επίδραση του υποθυρεοειδισμού στο ραβδωτό σώμα αρσενικών ενήλικων μυών στην κατάσταση του υποθυρεοειδισμού, προκειμένου να διευκρινισθεί περαιτέρω το υπόβαθρο των δράσεων των θυρεοειδικών ορμονών στο ντοπαμινεργικό σύστημα, στον ενήλικα εγκέφαλο.Με αυτοραδιογραφική μελέτη, δείχθηκε μειωμένη ποσοτική κατανομή των D2, όχι όμως και των D1,υποδοχέων ντοπαμίνης στα βασικά γάγγλια εγκεφάλου αρσενικών ενηλίκων υποθυρεοειδικών μυών συγκριτικά με τους ευθυρεοειδικούς. Με μελέτη κορεσμού και ανάλυση κατά Scatchard παρατηρήθηκε μη στατιστικά σημαντική διαφορά στη χημική συγγένεια του ανταγωνιστή των D2 υποδοχέων ντοπαμίνης [3H]-raclopride με τους υποδοχεις αυτούς. Παρατηρήθηκε επίσης στατιστικά σημαντική μείωση, 37%, στο ποσό δέσμευσης (Bmax) του ραδιενεργού προσδέτη στους D2 ντοπαμινεργικούς υποδοχείς των αρσενικών υποθυρεοειδικών μυών σε σχέση με τους ευθυρεοειδικούς. Διερευνώντας τα χαρακτηριστικά δέσμευσης των D2 ντοπαμινεργικών υποδοχέων, βρέθηκε στατιστικά σημαντικά αυξημένη η χημική συγγένεια της ντοπαμίνης σε σχέση με αυτή του ανταγωνιστή των D2 υποδοχέων ντοπαμίνης [3H]-raclopride για τη θέση υψηλής χημικής συγγένειας και μειωμένη η ποσοστιαία αναλογία των θέσεων δέσμευσης που αφορούν τη θέση υψηλής χημικής συγγένειας στο ραβδωτό σώμα υποθυρεοειδικών μυών συγκριτικά με τους ευθυρεοειδικούς. Αντίθετα στους υποθυρεοειδικούς μύες βρέθηκε μειωμένη η χημική συγγένεια στη θέση χαμηλής χημικής συγγένειας. Η ‘in vitro’ προσθήκη T3 σε ομογενοποίημα ραβδωτού σώματος εγκεφάλου αρσενικών ευθυρεοειδικών μυών προκάλεσε στατιστικά σημαντική μείωση της χημικής συγγένειας στη θέση υψηλής χημικής συγγένειας, συγκριτικά με το αντίστοιχο δείγμα ευθυρεοειδικών μυών. Επίσης, με ενεργοποίηση των Α2Α υποδοχέων αδενοσίνης μέσω του αγωνιστή των Α2Α υποδοχέων αδενοσίνης CGS 21680, παρατηρήθηκε πολλαπλάσια μείωση της χημικής συγγένειας στη θέση υψηλής χημικής συγγένειας των υποθυρεοειδικών δειγμάτων σε σχέση με τα αντίστοιχα των ευθυρεοειδικών, που σημαίνει ενισχυμένη αλληλεπίδραση των Α2Α /D2 υποδοχέων. Τέλος, τα αποτελέσματά μας έδειξαν ότι η επαγόμενη σύνθεση του cΑΜΡ από το SKF38393 (αγωνιστής των D1 υποδοχέων ντοπαμίνης) είναι στατιστικά σημαντικά μεγαλύτερη στο ραβδωτό των υποθυρεοειδικών μυών και ότι το σύστημα αλληλεπίδρασης D1/D2 υποδοχέων ντοπαμίνης στο ραβδωτό διαφέρει μεταξύ ευθυρεοειδικών και υποθυρεοειδικών μυών. Συγκεκριμένα η από το SKF38393 επαγόμενη σύνθεση του cΑΜΡ όταν αναστέλλεται υπό την παράλληλη δράση της κουινπιρόλης (αγωνιστής των D2 υποδοχέων ντοπαμίνης), παρουσιάζει στο ραβδωτό των ευθυρεοειδικών μυών μια δοσοεξαρτώμενη και αναλογική αναστολή της επαγόμενης σύνθεσης του cΑΜΡ και στο ραβδωτό των υποθυρεοειδικών μυών μια δοσοεξαρτώμενη αλλά όχι αναλογική αναστολή της επαγόμενης σύνθεσης του cΑΜΡ. Ενώ η επαγόμενη από το CGS21680 (αγωνιστής των Α2Α υποδοχέων δείχνει επίσης μεγαλύτερη επαγωγή σύνθεσης cAMP στα υποθυρεοειδικά ζώα αλλά και ενισχυμένη αλληλεπίδραση των Α2Α /D2 υποδοχέων στούς υποθυρεοειδικούς μύες, με στατιστικά σημαντικά μειωμένη σύνθεση του cΑΜΡ μόνο στους υποθυρεοειδικούς μύες. Τα αποτελέσματα της επαγόμενης σύνθεσης του cΑΜΡ πιθανόν παραπέμπουν σε τροποποιημένη δράση των G-πρωτεϊνών στους υποθυρεοειδικούς μύες. Τα αποτελέσματά μας δείχνουν επίδραση των θυρεοειδικών ορμονών στο ραβδωτό σώμα τόσο στον αριθμό των D2 ντοπαμινεργικών υποδοχέων όσο και στην μεταβίβαση σήματος μέσω των ντοπαμινεργικών υποδοχέων. Επίσης υποστηρίζουν την εμπλοκή των θυρεοειδικών ορμονών στην αλληλεπίδραση των ντοπαμινεργικών υποδοχέων με τους υποδοχείς αδενοσίνης σε μεμβρανικό επίπεδο καθώς και σε επίπεδο δευτερογενών μηνυμάτων, δείχνοντας ενισχυμένη αλληλεπίδραση των Α2Α /D2 υποδοχέων στους υποθυρεοειδικούς μύες. / Thyroid hormones (T3 and T4) are necessary in differentiation and development but also in the maturation of the central neural system. Their action has been connected with alterations in behavior, as well as with psychological and movement disorders. It is known that the dopaminergic (DA) innervation of the basal ganglia, and in particular of the striatum, plays a central role in most movement, cognitive and emotional functions. Hypothyroidism induces morphological alterations, and more precisely, reductions in the axonal and dendritic sprouting of striatal neurons of adult rat brain and also modifications in the ability of dopamine antagonists’ ligand-binding. However, the underling mechanisms involved at the cellular and molecular level remain unidentified. Aim: In the current dissertation, we studied the effect of hypothyroidism in the striatum of adult, male Balb-c mice, in order to get a better understanding on the underling mechanism(s) of the effect of thyroid hormones on the DAergic system in adult brain. Results: Autoradiography showed a quantitative reduction in the level of D2 receptors in the basal ganglia of adult, male, hypothyroid mice versus that in eythyroid mice. Saturation studies revealed a non- statistically significant alteration in the chemical affinity of D2 receptor antagonist [3H]-raclopride for these receptors. However, a statistically significant reduction (37 %) in Bmax of the radiolabeled ligand was observed in D2 dopaminergic receptors of the hypothyroid mice versus the euthyroid. Similar studies on the pharmacological profile of D2 DAergic receptor binding, showed a statistically significant increase in the binding affinity of dopamine versus [3H]-raclopride, at the high affinity site, and a reduction in the percentage of the binding sites in this site, in the striatum of male, adult hypothyroid mice versus eythyroid. The opposite effect was observed in the low affinity site, where we showed a reduction in the binding affinity. Furthermore, the “in vitro” addition of T3 in striatal homogenates of male, adult euthyroid brain resulted in a statistically significant reduction in the binding affinity, of the high affinity site, compared to euthyroid samples. Also, by activation of A2A adenosine receptors through application of the CGS21680 agonist, a statistically significant reduction was observed in the binding affinity, when at the high affinity site, of the hypothyroid compared to eythyroid samples. Finally the effect of hypothyroidism in the induction of cAMP synthesis was also examined. Our data showed that the SKF38393 (a D1 dopamine receptor agonist)-driven cAMP synthesis is statistically significant in the striatum of adult, male hypothyroid mice and that the D1/D2 interaction system of dopamine receptors is different between euthyroid and hypothyroid mice. This means that when SKF38393-driven cAMP synthesis is suppressed by quinpirole (a D2 dopamine receptor agonist), a dose dependent inhibition is observed in the striatum of euthyroid mice, which is similar, but not proportional to the inhibition observed in the striatum of hypothyroid mice. While the CGS21680 (a Α2Α adenosine receptror agonist)- driven cAMP synthesis is statistically significant in the striatum of adult, male hypothyroid mice versus to euthyroid and that the A2A/D2 interaction system of adenosine/dopamine receptors is different between euthyroid and hypothyroid mice. Only in hypothyroid mice the A2A-diven cAMP synthesis is statistically suppressed in a dose dependent manner, by costimulation of D2.receptors. Conclusions: Our results show the effect of thyroid hormones on the number of DAergic receptors level and on their signal transduction levels, after dopamine receptors activation in the striatum of adult, male mice. These observations mark the involvement of thyroid hormones in the interactions of the DAergic receptors with the adenosinergic receptors, both at the receptor-receptor and the signal transduction level.

Στην εποχή της συστημικής βιολογίας, οι υψηλής απόδοσης (-ομικές) τεχνικές βιομοριακής ανάλυσης επέτρεψαν την ολιστική ανάλυση των διαφόρων μοριακών επιπέδων κυτταρικής λειτουργίας μέσω της ταυτόχρονης μέτρησης εκατοντάδων έως χιλιάδων αντιπροσωπευτικών μοριακών ποσοτήτων. Η μεταβολομική αναφέρεται στην ποσοτικοποίηση του (σχετικού) προτύπου συγκέντρωσης των ελεύθερων μικρών μεταβολιτών. Λαμβάνοντας υπ’ όψιν, το ρόλο των μεταβολιτών ως, αντιδρώντα ή/και προϊόντα των μεταβολικών αντιδράσεων, το πρότυπο συγκέντρωσης τους επηρεάζει και επηρεάζεται από την κατανομή των μεταβολικών ροών, αποτελώντας επομένως ένα αποτύπωμα της μεταβολικής κατάστασης ενός βιολογικού συστήματος. Μεταξύ των πλεονεκτημάτων της μεταβολομικής ανάλυσης είναι ότι μπορεί να χρησιμοποιηθεί σε μεταβαλλόμενη κατάσταση φυσιολογίας, ενώ δεν απαιτεί ολοκληρωμένη γνώση του μεταβολικού δικτύου ενός οργανισμού. Αυτά τα χαρακτηριστικά είναι ιδιαίτερα πλεονεκτικά για τη μελέτη της μεταβολικής ενεργότητας του εγκεφάλου, λαμβάνοντας υπ’όψιν την ανατομική, μορφολογική και φαινοτυπική πολυπλοκότητα αυτού του οργάνου και την έως τώρα κατανόηση των μεταβολικών του μηχανισμών. Πιο συγκεκριμένα για την επίδραση του ενήλικου υποθυρεοειδισμού στον μεταβολισμό του εγκεφάλου, η μέχρι σήμερα γνώση παραμένει αποσπασματική, ενώ προέρχεται από διαφορετικά πειράματα και διάφορες εγκεφαλικές περιοχές. Μια ολιστική θεώρηση του μεταβολισμού σε συνθήκες υποθυρεοειδισμού σε συγκεκριμένες εγκεφαλικές περιοχές αναμένεται να αυξήσει σημαντικά τη γνώση μας για την ασθένεια αυτή. Σε μια πρόσφατη μελέτη της ερευνητικής μας ομάδας, που ήταν η πρώτη μεταβολική ανάλυση εγκεφαλικού ιστού σε ζωικό μοντέλο μακρόχρονου υποθυρεοειδισμού, η πολυπαραμετρική στατιστική ανάλυση των μεταβολικών προτύπων της παρεγκεφαλίδας μυός έδειξε διαφορές στη μεταβολική φυσιολογία του ιστού στα ευ- σε σχέση με τα υποθυρεοειδικά ζώα, παρέχοντας ισχυρές ενδείξεις ότι ο μεταβολισμός της παρεγκεφαλίδας θηλαστικών επηρρεάζεται από τον μακρόχρονο υποθυρεοειδισμό. Στην παρούσα εργασία, συγκρίθηκε η επίδραση του μακρόχρονου υποθυρεοειδισμού στη μεταβολική φυσιολογία της παρεγκεφαλίδας μεταξύ αρσενικών και θηλυκών Balb/cJ μυών, αφού επεκτάθηκε για επιπλέον μεταβολίτες η αυτοματοποιημένη μέθοδος προσδιορισμού κορυφών στο χρωματογράφημα. Ο μακρόχρονος υποθυρεοειδισμός επήχθη με χορήγηση 1% υπερχλωρικού καλλίου για 64 μέρες στο πόσιμο νερό των ζώων. Αυτή είναι και η πρώτη μελέτη της επίδρασης του ενήλικου υποθυρεοειδισμού στην μεταβολομική φυσιολογία του 4 εγκεφάλου των θηλυκών μυών. Τα μεταβολικά πρότυπα αναλύθηκαν με το λογισμικό ανοικτού κώδικα ΤΜ4/ MEV(www.tm4.org/MEV) για την πολυπαραμετρική στατιστική ανάλυση των -ομικών δεδομένων. Τα αποτελέσματα συζητήθηκαν στο πλαίσιο ενός κατάλληλα ανακατασκευασμένου μεταβολικού δικτύου για την παρεγκεφαλίδα μυός με βάση τις μεταβολικές βάσεις δεδομένων KEGG και EXPASY και δεδομένα από τη βιβλιογραφία. Η ανάλυση των προτύπων έδειξε ότι η επίδραση της δίμηνης χορήγησης υπερχλωρικού καλλίου στη μεταβολική φυσιολογία της παρεγκεφαλίδας ήταν πιο οξεία στα αρσενικά απ’ότι στα θηλυκά ζώα. Αυτή η παρατήρηση υποστηριζόταν και απο την σημαντικά μικρότερη μείωση του μέσου βάρους των υποθυρεοειδικών σε σχέση με αυτό των ευθυρεοειδικών ζώων στο τέλος της δίμηνης χορήγησης στα θηλυκά σε σχέση με τα αρσενικά. Τέος, σύγκριση των μεταβολικών προτύπων της παρεγκεφαλίδας των ευθυρεοειδικών αρσενικών και θηλυκών μυών έδειξε τους μισούς από τους μεταβολίτες στην παρεγκεφαλίδα των αρσενικών να έχουν σημαντικά μεγαλύτερη συγκέντρωση απ’ ότι στον ιστό των θηλυκών. Αυτή η παρατήρηση καταδεικνύει την ανάγκη της παρεγκεφαλίδας των θηλυκών σε μικρότερες συγκεντρώσεις ελεύθερων μικρών μεταβολιτών για την εύρυθμη λειτουργία της ως ένα πιθανό παράγοντα «προστασίας» του μεταβολισμού της από την επίδραση του μακρόχρονου ενήλικου υποθυρεοειδισμού. Καθώς η παρεγκεφαλίδα των αρσενικών χρειάζεται μεγαλύτερες ποσότητες ελεύθερων μικρών μεταβολιτών, η αναμενώμενη μείωση της συγκέντρωσης των μεταβολιτών που λαμβάνει ο εγκέφαλος μέσω του αιματοεγκεφαλικού φραγμού λόγω του υποθυρεοειδισμού θα την επηρεάσει πιο γρήγορα και πιο δραστικά από αυτή των θηλυκών. Αυτές οι σημαντικές παρατηρήσεις χρειάζονται περαιτέρω διερεύνηση μέσω κατάλληλα σχεδιασμένων αναλύσεων μεταβολομικής και φυσιολογίας και άλλων εγκεφαλικών περιοχών, συνδυάζοντας επίσης μετρήσεις των επιπέδων των θυρεοειδικών ορμονών με μεταβολομική ανάλυση του εγκεφαλικού ιστού με Υγρή Χρωματογραφία- Φασματομετρίας Μάζας, καθώς και μετρήσεις ομικών αναλύσεων από άλλα επίπεδα κυτταρικής λειτουργίας, κυρίως της πρωτεωμικής. / In the systems biology era, the high-throughput “omic” technologies have enabled the holistic analysis of the various molecular levels of cellular function through the simultaneous measurement of hundreds to thousands of relevant molecular quantities. Metabolomics refers to the quantification of the (relative) concentration profile of the free small metabolites. Taking into consideration the role of the metabolites as reactants and products of the metabolic reactions, their concentration profile affects and is affected by the metabolic pathway flux distribution. Thus, the metabolic profile provides a fingerprint of the metabolic state of a biological system. Among the advantages of the metabolomic analysis is that it can be easily used to monitor transient metabolic conditions without requiring extensive knowledge of the structure and regulation of the investigated metabolic networks. This characteristic is especially advantageous for the analysis of brain metabolism, considering the anatomical, morphological and phenotypic complexity of this organ and our current shortages in understanding its metabolic mechanisms. For the effect of adult onset hypothyroidism (AOH) on brain metabolism in particular, the current knowledge remains fragmented, concerning different experimental setups and recovered from various brain regions. A holistic view of metabolism under AOH in particular brain regions is expected to significantly enhance the current knowledge about the disease. In a recent study of our group, which was the first metabolomic analysis of brain tissue in a prolonged AOH mouse model, multivariate statistical analysis of the metabolic profiles of the mouse cerebella indicated differences in the metabolic physiology of the tissue in the eu- compared to the hypo- thyroid animals, providing strong evidence that the mammalian cerebellum is metabolically responsive to prolonged AOH. In the present work, we compared the effect of prolonged AOH on the cerebellar metabolic physiology between male and female Balb/cJ mice, after enhancing the metabolite peak identification method to include additional metabolites. The prolonged AOH was induced by a 64-day treatment with 1% potassium perchlorate in the drinking water of the animals. This is the first reported analysis of the effect of AOH on the brain metabolic physiology of female mice. The raw metabolic profiles were normalized and appropriately filtered. The normalized metabolic profiles were analyzed using the open-source TM4/MeV software (www.tm4.org/MeV) for the multivariate statistical analysis of “omic” data. The acquired results were interpreted in the context of an appropriately reconstructed metabolic network for the mouse cerebellum based on the metabolic databases, KEGG and Expasy, and a plethora of information mined from the literature. The analysis of the metabolic profiles 6 indicated that the effect of the 2-month potassium perchlorate treatment on the metabolic physiology of the cerebellum is more acute in the male with respect to the female mice. The time profile of the body weight of the female compared to the male mice indicated a significantly smaller decrease in the mean weight of the hypothyroid compared to the euthyroid mice in the female compared to the male population at the end of the KClO4 treatment, an observation that further supports the metabolic profiling results. Finally, comparison between the metabolic profiles of the euthyroid male and female cerebellum indicated a significantly higher concentration in half of the measured free metabolites in the male compared to the female animals. This indicates the “leanness” of the metabolic profile of the female cerebellum as a potential “protective” parameter to the effect of AOH on its metabolic physiology, in the sense that the expected due to AOH decrease in the concentrations of the metabolites that are transferred to the brain through the blood brain barrier may affect more the male cerebellum that requires higher levels of free metabolites for its regular activity. These significant observations are in need of further investigation through appropriately designed physiological and metabolomic studies, integrating also thyroid hormone measurements from Liquid Chromatography-MS metabolomic analysis of brain tissue as well as omic measurements from other molecular levels of cellular function, mainly from proteomics.