Ένας από τους πιο σημαντικούς στόχους της φαρμακευτικής θεραπείας είναι η ανάπτυξη φορέων φαρμάκου που θα μεταφέρουν και θα παραδίδουν εκλεκτικά το φάρμακο στις θέσεις φαρμακολογικής δράσης του αλλά και με έναν ελεγχόμενο ρυθμό χορήγησης κατάλληλα προσαρμοσμένο για την κάθε ασθένεια. Για την ελεγχόμενη χορήγηση και στόχευση βιοδραστικών ουσιών έχουν αναπτυχθεί πολλοί φορείς, όπως πολυμερικά νανοσωματίδια και λιποσώματα. Μεταξύ των πολυμερών που έχουν χρησιμοποιηθεί για την παρασκευή νανοσωματιδιακών φορέων φαρμάκων ιδιαίτερη προσοχή συγκεντρώνουν τα βιοδιασπώμενα και βιοσυμβατά πολυμερή του πολυ(γαλακτικού-γλυκολικού) οξέος (PLGA). Τα νανοσωματίδια που παρασκευάζονται από τα συμπολυμερή αυτά απομακρύνονται ταχύτατα από τη συστηματική κυκλοφορία μετά από ενδοφλέβια χορήγηση, κυρίως μέσω της πρόσληψης τους από το δικτυοενδοθηλιακό σύστημα. Όταν όμως επικαλυφθούν με υδρόφιλα, μη ιονικά πολυμερή, όπως η πολυ(αιθυλενογλυκόλη), έχουμε στερεοχημική σταθεροποίηση των νανοσωματιδίων και παράταση του χρόνου παραμονής τους στην συστηματική κυκλοφορία. Στην παρούσα εργασία μελετήθηκε η επίδραση της διαλυτότητας του φαρμάκου στην φόρτωση και αποδέσμευση του από PLGAmPEG νανοσωματίδια διαφορετικής πολυμερικής σύστασης (αναλογία PLGA/PEG). Ως πρότυπα φάρμακα χρησιμοποιήθηκαν τα μέλη της τάξης των μεθυλοξανθινών καφεΐνη, θεοφυλλίνη και θεοβρωμίνη. Οι μεθυλοξανθίνες αποτελούν ικανοποιητικά πρότυπα ώστε να μπορούν να χρησιμοποιηθούν στην μελέτη της επίδρασης της διαλυτότητας στις ιδιότητες φόρτωσης και απελευθέρωσης φαρμάκων από τα PLGAmPEG νανοσωματίδια, καθώς είναι μικρά μόρια με παραπλήσιο μοριακό βάρος και χημικές ιδιότητες ενώ η διαλυτότητα τους στο νερό είναι σημαντικά διαφορετική: καφεΐνη (1g/46 ml), θεοφυλλίνη (1 g/120 ml) και θεοβρωμίνη (1 g/2000 ml). Παρασκευάστηκαν έτσι τρεις διαφορετικές συνθέσεις νανοσωματιδίων με την μέθοδο του διπλού γαλακτώματος και χαρακτηρίστηκαν ως προς το μέγεθος και το ζ δυναμικό. Στην συνέχεια μελετήθηκαν οι ιδιότητες φόρτωσης των μεθυλοξανθινών καθώς και οι ιδιότητες απελευθέρωσής τους από τα νανοσωματίδια μέσα σε φυσιολογικό ορό ρυθμισμένο με φωσφορικά (PBS) και ανθρώπινο πλάσμα in vitro. Το μέσο μέγεθος των νανοσωματιδίων κυμαίνονταν από 130 έως 200 nm και το ζ δυναμικό από -7 έως -20 mV. Τα χαρακτηριστικά αυτά καθιστούν τα νανοσωματίδια κατάλληλα για εφαρμογές ελεγχόμενης αποδέσμευσης. Η φόρτωση και η ενκαψακίωση των PLGAmPEG νανοσωματιδίων βρέθηκε να εξαρτάται από την σχετική διαλυτότητα του φαρμάκου στην εξωτερική υδατική φάση και στην οργανική φάση που χρησιμοποιούνται κατά την παρασκευή των νανοσωματιδίων και όχι απλά από την υδατοδιαλυτότητά τους. Έτσι η φόρτωση των νανοσωματιδίων ήταν μεγαλύτερη στην περίπτωση της καφεΐνης απ’ ότι στην θεοβρωμίνη, και αυτής από την φόρτωση στην περίπτωση της θεοφυλλίνης. Η φόρτωση και η ενκαψακίωση των μεθυλοξανθινών σε PLGAmPEG νανοσωματίδια επηρεάζεται από την αρχική φόρτωση των νανοσωματιδίων σε φάρμακο (drug input). Για όλα τα φάρμακα που δοκιμάστηκαν, αύξηση της αρχικής ποσότητας του φαρμάκου είχε σαν αποτέλεσμα την αύξηση της φόρτωσης των νανοσωματιδίων με φάρμακο. Αντίθετα η επίδραση της αρχικής φόρτωσης στην ενκαψακίωση βρέθηκε να εξαρτάται από την υδατοδιαλυτότητα του φαρμάκου. Έτσι η αύξηση της αρχικής φόρτωσης είχε σαν αποτέλεσμα την ελάττωση της ενκαψακίωσης στην περίπτωση της καφεΐνης, δεν είχε κανένα αποτέλεσμα στην ενκαψακίωση της θεοφυλλίνης ενώ οδήγησε σε μικρή αύξηση της ενκαψακίωσης της θεοβρωμίνης. Η φόρτωση και η ενκαψακίωση των φαρμάκων που δοκιμάστηκαν δεν επηρεάστηκε σημαντικά από τη σύνθεση του PLGAmPEG συμπολυμερούς από το οποίο παρασκευάστηκαν τα νανοσωματίδια. Ανεξάρτητα από την πολυμερική σύνθεση των νανοσωματιδίων, ο ρυθμός απελευθέρωσης των εγκλωβισμένων στα νανοσωματίδια μεθυλοξανθινών ήταν, τόσο στο PBS όσο και στο ανθρώπινο πλάσμα in vitro, ανάλογος της υδατοδιαλυτότητας του φαρμάκου. Έτσι ο ρυθμός αποδέσμευσης ήταν μεγαλύτερος στην περίπτωση της καφεΐνης απ’ ότι στην θεοφυλλίνη, και αυτής από την θεοβρωμίνη. Με όλες τις πολυμερικές συνθέσεις που δοκιμάστηκαν, ο εγκλωβισμός των μεθυλοξανθινών στα νανοσωματίδια είχε ως αποτέλεσμα την ελάττωση του ρυθμού αποδέσμευσης των φαρμάκων in vitro, τόσο σε PBS όσο και σε ανθρώπινο πλάσμα. Η ελάττωση του ρυθμού αποδέσμευσης αυξάνονταν με ελάττωση της υδατοδιαλυτότητας του φαρμάκου. Ο ρυθμός απελευθέρωσης και των τριών μεθυλοξανθινών ήταν μεγαλύτερος στο PBS σε σύγκριση με το ανθρώπινο πλάσμα. Η απόδειξη της ελεγχόμενης αποδέσμευσης των φαρμάκων από τα νανοσωματίδια στο ανθρώπινο πλάσμα είναι σημαντική καθώς καταδεικνύει την καταλληλότητα των PLGAmPEG σωματιδίων για εφαρμογές ελεγχόμενης χορήγησης φαρμάκων. Πάντως η χρησιμότητα των PLGAmPEG νανοσωματιδίων σε ελεγχόμενη χορήγηση φαρμάκων φαίνεται να περιορίζεται στις περιπτώσεις των φαρμάκων με μικρή σχετικά υδατοδιαλυτότητα. / The rapid removal of conventional polymeric nanoparticles from the bloodstream limits their potentional in controlled drug delivery and targeting. Surface engineering, however, may lead to nanoparticles capable of evading their uptake from the mononuclear phagocyte system (MPS), which exhibit prolonged residence in blood. Thus, coating the nanoparticle surface with a hydrophilic polymer such as poly(ethylene glycol) (PEG) has been shown to confer long circulation properties to PLGA (poly(lactide-co-glycolide) nanoparticles. Although the basic physicochemical and biological properties of these nanoparticles have been studied, there is currently a luck of studies dealing in a systematic way with their drug incorporation and release properties. In this work the effect of three different PLGAmPEG copolymer composition on drug loading and release properties, was studied using the members of the methyl-xanthine class of drugs, i.e. caffeine, theophylline, theobromine, as model drugs. This way, the effect of drug solubility on drug loading and release from the nanoparticles can be evaluated in a more scientifically sound way than applying more common practices, such as the study of a drug and its salt. PLGAmPEG copolymers were synthesized from dl-lactide (LE), glycolide (GE) and mPEG(5000) by a melt polymerization process. The synthesized copolymers were identified by the moral ratio of (LE +GE)/mPEG determined by 1H-NMR. PLGAmPEG nanoparticles loaded with caffeine, theophylline and theobromine were prepared by a double emulsion (w1/o/w2) method, where w1: aqueous solution of drug, o: a dichloromethane (dcm) solution of the polymer and w2: an aqueous solution of sodium cholate (12mM). The size and æ potential of the nanoparticles, were determined by photon correlation spectroscopy and microelectrophoresis respectively. The size of the nanoparticles ranged approximately from 130 to 200nm depending on the type of PLGAmPEG copolymer used and the formulation. All nanoparticle formulations exhibited low negative æ potential in the range -7 to -20. Drug loading was determined using direct method in which the samples were dissolved in NaOH and the drug in the solution was assayed by a High Performance Liquid Chromatography method (HPLC). The release experiments were performed in phosphate buffered saline and in human plasma in vitro. The nanoparticles were enclosed in a dialysis bag and incubated in PBS (pH=7.4, 37oC) and in human plasma under mild agitation. At predetermined time intervals, samples were withdrawn and assayed for the drug by HPLC. The drug loading and encapsulation values increased and decreased respectively when the drug/polymer ratio increased, by increasing drug input (initially present drug) while keeping polymer input constant. Due to the relatively high aqueous solubility of the three methylxanthines low nanoparticle loadings were generally obtained. Caffeine, despite its higher aqueous solubility, exhibited a little higher encapsulation and loading than theophylline and theobromine. This may be attributed to the much higher partition coefficient K (dcm/water) of caffeine compared to theophylline and theobromine, which would decrease to a higher extend in the case of caffeine the tendency of the drug to pass from the dcm droplets, formed during the second emulsification step of nanoparticle preparation, to the surrounding aqueous phase. As a result, higher drug retention in the nanoparticles was observed in the case of caffeine. Drug release from the nanoparticles was sustained and depended on the aqueous solubility of the drugs. For instance, the more water-soluble caffeine was released relatively faster than the less water-soluble theophylline and the even less water-soluble theobromine, from all PLGAmPEG compositions both in PBS and in human plasma. Drug release from the nanoparticles did not appear to depend on the composition of the PLGAmPEG copolymer used to prepare the nanopaparticles. Drug release rate in plasma was lower than that in PBS, probably due to the binding of the drug molecules to plasma proteins. Drug encapsulation of methylxanthines in the PLGAmPEG nanoparticles depended on the solubility properties of the drugs. The organic/aqueous phase partition coefficient of the drug may be crucial with regard to the incorporation efficiency of the drug in these nanoparticles. Drug release from the nanoparticles was sustained in both PBS and human plasma, but only for the relatively hydrophobic theobromine in a satisfactory extent. The rate of drug release was affected by the aqueous solubility of the drug and the release medium. It appears that PLGAmPEG nanoparticles can be applied for controlled drug delivery applications only in the case of relatively water-insoluble drugs.

Η Πακλιταξέλη (PTX) αποτελεί ένα ευρέως διαδεδομένο αντινεοπλασματικό φάρμακο και ενδείκνυται σε μεταστατικό καρκίνο του μαστού, καρκίνο ωοθηκών, μη μικροκυτταρικό καρκίνο του πνεύμονα και σε σάρκωμα Kaposi ασθενών με AIDS. Παρ’ όλα αυτά, η σημαντική τοξικότητα που εμφανίζει (μυελοκαταστολή, νευροτοξικότητα, αντιδράσεις υπερευαισθησίας), υπογραμμίζει την αναγκαιότητα για μορφοποίησή της σε Συστήματα Ελεγχόμενης Χορήγησης Φαρμάκων (DDS), με σκοπό τη μείωση των ανεπιθύμητων ενεργειών και την αύξηση της βιοδιαθεσιμότητας του φαρμάκου. Τα πολυμερικά μικκύλια έχουν μελετεθεί εκτενώς τα τελευταία χρόνια ως Συστήματα Ελεγχόμενης Χορήγησης Φαρμάκων. Η ενσωμάτωση υπερπαραμαγνητικών νανοκρυσταλλιτών οξειδίου του σιδήρου (SPIONs) στον πυρήνα των PTX-μικκυλίων, παρέχει τη δυνατότητα μαγνητικής στόχευσης του φαρμάκου στην επιθυμητή περιοχή δράσης, καθώς και τη θεραπεία του καρκίνου μέσω επαγωγής μαγνητικής υπερθερμίας, με την εφαρμογή εναλλασσόμενου μαγνητικού πεδίου. Επιπλεόν, η χρήση των SPIONs ως σκιαγραφικά μέσα (Τ2-contrast enhancement) στη μαγνητική τομογραφία πυρηνικού συντονισμού (MRI), εξασφαλίζει το πλεονέκτημα ταυτόχρονης διάγνωσης και θεραπείας (Theranostics), αποκαλύπτοντας την πολυλειτουργικότητα των συστημάτων αυτών. Οι συγκεκριμένοι νανοφορείς, έχοντας μικρό μέγεθος (100-200nm), θεωρούνται κατάλληλοι για να αποφύγουν την οψωνινοποίηση απο τις λιποπρωτεϊνες του αίματος, την επίθεση απο τα φαγοκύτταρα του Δικτυοενδοθηλιακού συστήματος (RES) καθώς και την ταχεία νεφρική κάθαρση, με αποτέλεσμα την παρατεταμένη κυκλοφορία τους στο αίμα (stealth systems) και την εκλεκτική πρόσληψη τους απο τους συμπαγείς καρκινικούς όγκους, μέσω του φαινομένου της ενισχυμένης διαπερατότητας και κατακράτησης (EPR effect). Οι ιδιότητες αυτές, καθιστούν τα συγκεκριμένα συστήματα πολύτιμα εργαλεία στον τομέα της νανοϊατρικής. Η παρούσα μεταπτυχιακή διατριβή πραγματεύεται τη σύνθεση υδρόφοβων SPIONs μέσω της τεχνικής της θερμικής αποικοδόμησης. Μελετήθηκαν οι συνθετικές παράμετροι (πρόδρομη ένωση, ποσότητα ελαϊκού οξέος, θερμοκρασία και διάρκεια αντίδρασης, ρυθμός αύξησης της θερμοκρασίας κ.α) που επηρεάζουν το μέγεθος, το σχήμα και τη διασπορά του μεγέθους των σχηματιζομένων νανοκρυσταλλιτών (5-13nm, σ: 10-20%), καθώς διαδραματίζουν σημαντικό ρόλο στη μαγνητική συμπεριφορά των υβριδικών νανονοφορέων. Στη συνέχεια, πραγματοποιήθηκε σύνθεση υβριδικών νανοφορέων με εγκλωβισμό των SPIONs σε πολυμερικά μικκύλια. Η παρασκευή των υπερπαραμαγνητικών μικκυλίων επιτελέστηκε με την τεχνικη solvent diffusion and evaporation (nanoprecipitation), με χρήση του αμφίφιλου συμπολυμερούς πολυ(γαλακτικό οξύ)-πολυ(αιθυλενογλυκόλη) (PLA-PEG). Στον υδρόφοβο πυρήνα των μικκυλίων (PLA) δεσμεύονται υδρόφοβες ενώσεις (PTX, SPIONs), ενώ το υδρόφιλο κέλυφος (PEG) προσδίδει κολλοειδή σταθερότητα σε υδατικά μέσα (δομή πυρήνα-κελύφους). Διερευνήθηκαν διάφορες συνθετικές παράμετροι (μοριακό βάρος συμπολυμερούς, ποσότητα SPIONs, ρυθμός προσθήκης οργανικής φάσης κ.α) και προσδιορίστηκαν οι βέλτιστες συνθήκες για την παρασκευή υπερπαραμαγνητικών μικκυλίων μεγέθους <200nm, με αξιοσημείωτη κολλοειδή σταθερότητα (μέχρι και έξι μήνες), σε συνθήκες παρόμοιες με αυτές του ανθρώπινου πλάσματος (pH: 7.4, ιοντική ισχύς: 0.15Μ). Στο επόμενο στάδιο της παρούσας εργασίας, μελετήθηκαν οι παράγοντες που επηρεάζουν τη φόρτωση-ενκαψυλίωση της PTX και των SPIONs στα πολυμερικά μικκύλια (ποσότητα PTX, ποσότητα και μέγεθος SPIONs, μοριακό βάρος PLA-PEG, ρυθμός προσθήκης οργανικής φάσης κ.α), σε φυσιολογικές συνθήκες (pH:7.4, ιοντική ισχύς: 0.15Μ). Αναπτύχθηκε πρωτόκολλο μέσω του οποίου έγινε κατορθωτός ο διαχωρισμός των μαγνητικών νανοφορέων απο τους μη μαγνητικούς, καθώς και ο υπολογισμός της φόρτωσης-ενκαψυλίωσης PTX και SPIONs ξεχωριστά, τόσο στους μαγνητικούς και μη μαγνητικούς νανοφορείς, όσο και στο μέιγμα αυτών. Οι συγκεκριμένοι νανοφορείς χαρακτηρίζονται απο εξαιρετικά υψηλή απόδοση ενκαψυλίωσης φαρμάκου (93 %wt.) και φόρτωση φαρμάκου που ανέρχεται στο 4.8 %wt. Oι αμιγώς μαγνητικοί νανοφορείς επιδεικνύουν υψηλή απόδοση ενκαψυλίωσης νανοκρυσταλλιτών (70 %wt.), ενώ η φόρτωση σε φάρμακο και SPIONs ανέρχεται σε 5.2 και 20 %wt. αντίστοιχα. Σε αμφότερες τις περιπτώσεις οι νανοφορείς, μεγέθους (υδροδυναμική διάμετρος) 170nm, χαρακτηρίζονται απο ικανοποιητική μαγνητική συμπεριφορά. Εξετάστηκε η επίδραση του μεγέθους των νανοκρυσταλλιτών στη μαγνητική συμπεριφορά των νανοφορέων. Οι αμιγώς μαγνητικοί νανοφορείς με μεγαλύτερο μέγεθος SPIONs παρουσιάζουν καλύτερη μαγνητική συμπεριφορά. Τέλος, πραγματοποιήθηκαν μελέτες αποδέσμευσης του φαρμάκου σε PBS (0.14Μ, pH:7.4) στους 37oC και διερευνήθηκε η επίδραση της εφαρμογής εναλλασσόμενου μαγνητικού πεδίου στην αποδέσμευση της PTX απο τους μαγνητικούς νανοφορείς (Triggered Drug Release). Σε κάθε περίπτωση, παρατηρήθηκε ελεγχόμενη αποδέσμευση του φαρμάκου για 24 ώρες, σε συνθήκες που προσομοιάζουν με αυτές του πλάσματος. Ο φυσικοχημικός χαρακτηρισμός των νανοφορέων πραγματοποιήθηκε με HPLC, DLS, TGA, TEM και μαγνητοφόρηση. / Paclitaxel (PTX) is one of the most successful anticancer drugs against a broad range of solid tumors, such as metastatic breast cancer, ovarian cancer, non-small-cell lung cancer and AIDS-related Kaposi sarcoma. However, the serious systematic side effects of PTX (myelosuppression, neurotoxicity, hypersensitivity) underline the need for formulation of PTX in Drug Delivery Systems (DDS), in order to reduce the side effects and increase the bioavailability of the drug. Among DDS, polymeric micelles have drawn much attention due to their great flexibility in tuning drug solubility, micelle size, targeted drug delivery and stability. Incorporation of Superparamagnetic Iron Oxide Nanocrystals (SPIONs) inside the core of drug-loaded polymeric micelles, imparts to the final Drug Delivery System the prospect of physical (magnetic) targeting, intrinsic therapeutic function (hyperthermia-based cancer therapy under alternating external magnetic field), T2-based contrast enhancement in magnetic resonance imaging (MRI) and remotely triggered drug release. These core-shell polymeric micelles having small size (100-200nm), are considered appropriate for avoiding both opsonization, macrophages attack by ReticuloEndothelial System (RES) and rapid renal clearance, thus allowing micelles to be taken up preferably by solid tumors through Enhanced Permeability and Retention (EPR) effect. Therefore, such nanoassemblies encode high potential in nanomedicine, due to their dual nature (Therapeutic+Diagnostic = Theranostics). In particular, we have studied the synthesis of organophilic SPIONs through thermal decomposition. The synthetic parameters (precursor, precursor:oleic acid ratio, reaction temperature and duration, heat rate, etc.) affecting the size, shape and size distribution of the nanocrystals have also been examined thoroughly, since they play a key-role concerning the magnetic behavior of the final hybrid. Nanosized SPIONs with narrow size distribution were synthesized (5-13nm, σ: 10-20%). The preparation of poly(lactic acid)-block-poly(ethyleneglycol) (PLA-PEG) micelles encapsulating hydrophobic SPIONs, by varying the molecular weight of the polymers, the amount of SPIONs and the addition rate during micelle assembly, has also been investigated. The core-shell superparamagnetic micelles were prepared through solvent diffusion and evaporation technique (nanoprecipitation). PTX and SPIONs are being incorporated into the micelle’s hydrophobic core (PLA) through hydrophobic interactions, whereas the hydrophilic shell (PEG) stabilizes the micelles in aqueous dispersions, optimizing their colloidal stability and providing prolonged circulating time. The optimum parameters were determined, conferring to the micelles (Hydrodynamic Diameter < 200nm) high colloidal stability (up to six months) at biorelevant conditions (pH:7.4, ionic strenght: 0.15M). The next phase of the present master thesis focused on studying the factors (amount of PTX and SPIONs, molecular weight of PLA-PEG, addition rate, etc.) affecting the Loading of PTX and SPIONs into the polymeric micelles and how they can be fine-tuned towards high drug loading, while retaining their size at a scale where long circulation would not be precluded. Through protocol establishment, we have managed to separate the magnetic and non magnetic micelles, and to determine individually the loading of PTX and SPIONs for magnetic, non magnetic micelles, as well as for the mixture of them. The micelles’ mixture exhibits very high Drug Encapsulation Efficiency (93 %wt.) and 4.8 %wt. Drug Loading (D.L). Magnetic nanocarriers display high Magnetic Encapsulation Efficiency (70 %wt.), with D.L and Magnetic Loading of 5.2 and 20 %wt. respectively, In both cases, micelles demonstrate adequate magnetic behavior and small sizes (hydrodynamic diameter: 170nm), under conditions which simulate with human plasma (pH:7.4, ionic strenght: 0.15M). The effect of SPIONs’ size on the magnetic behavior of hybrid colloids, was also examined. Magnetic nanocarriers encapsulating SPIONs of greater size exhibit better magnetic behavior. Finally, we have conducted Drug release studies in PBS (0.14M, pH:7.4) at 37oC. The effect of SPIONs presence on the release profile of PTX, including triggered drug-release by application of AC magnetic field, has also been investigated. PTX-magnetic micelles exhibit Controlled Drug release for 24 hours. Several techniques have been used for the characterization of such nanoassemblies, like: HPLC, DLS, TGA, TEM, XRD, Magnetophoresis and Triggered Drug release by application of AC magnetic field.