Η αντιγραφή του DNA αποτελεί μια θεμελιώδη διαδικασία για κάθε μορφή ζωής. Στους ευκαρυωτικούς οργανισμούς, εξαιτίας του μεγάλου μεγέθους του γονιδιώματός τους, η αντιγραφή του DNA εκκινά από πολλαπλά σημεία προκειμένου να ολοκληρωθεί σε εύλογο χρονικό διάστημα. Οι περιοχές αυτές ονομάζονται αφετηρίες αντιγραφής και η μελέτη τους είναι σημαντική αφού είναι άρρηκτα συνδεδεμένες με την ακριβή ολοκλήρωση της αντιγραφής του DNA, διαδικασία ζωτικής σημασίας για το κύτταρο. Ενώ η λειτουργία των αφετηριών αντιγραφής είναι λίγο πολύ γνωστή, οι ακριβείς γονιδιωματικές δομές που συντελούν στο μηχανισμό επιλογής τους παραμένουν άγνωστες. Σκοπός αυτής της διπλωματικής εργασίας είναι η μελέτη, σε επίπεδο ολόκληρου του γονιδιώματος, των γονιδιωματικών περιοχών που αποτελούν αφετηρίες αντιγραφής του DNA και η εξαγωγή των χαρακτηριστικών που καθορίζουν την ιδιότητά τους να λειτουργούν ως αφετηρίες αντιγραφής του DNA. Ο ζυμομύκητας Schizosachharomyces pombe αποτελεί ιδανικό οργανισμό για τη μελέτη της διαδικασίας αντιγραφής του DNA, κυρίως εξαιτίας της ομοιότητας που διαθέτει με τους ανώτερους ευκαρυωτικούς οργανισμούς. Η παρούσα βιοπληροφορική ανάλυση εκτελεί επεξεργασία ολόκληρου του γονιδιώματος του S. pombe. Βασίζεται σε δύο πολύ πρόσφατα, αλλά διαφορετικών ερευνητικών ομάδων, πειράματα μικροσυστοιχειών στα οποία αναγνωρίστηκαν οι αφετηρίες αντιγραφής σε όλο το γονιδίωμα του ζυμομύκητα (Heichinger et al, 2006 και Hayashi et al, 2007). Συνδυάζοντας τα πειράματα αυτά, καταφέραμε να διαχωρίσουμε το σύνολο των διαγονιδιακών περιοχών του S. pombe σε κατηγορίες ανάλογα με την ικανότητα τους να εκκινούν την αντιγραφή του DNA. Έπειτα, ορίσαμε 3 νέα γονιδιωματικά παραμετρικά χαρακτηριστικά και μαζί με τη δημιουργία ενός συστήματος βελτιστοποίησης παραμέτρων, εξετάσαμε πώς πρέπει να διαμορφωθούν οι διάφορες παράμετροί τους ώστε να δημιουργούνται δομές που παρατηρούνται μονάχα στις αφετηρίες αντιγραφής. Για συγκεκριμένους συνδυασμούς παραμέτρων, η ταξινόμηση των διαγονιδιακών περιοχών με βάση τα καινούρια χαρακτηριστικά αγγίζει το 90% σε ευαισθησία, και το 77% σε θετικό προγνωστικό δείκτη. Επομένως, τα νέα γονιδιωματικά χαρακτηριστικά αφορούν δομές που παρατηρούνται σχεδόν εξολοκλήρου στις αφετηρίες αντιγραφής και σπάνια στις υπόλοιπες διαγονιδιακές περιοχές, παρέχοντας έτσι τον κύριο μηχανισμό επιλογής των αφετηριών αντιγραφής του DNA στο γονιδίωμα του S. pombe. / DNA replication constitutes an essential process for every life form. In eukaryotic organisms which are characterized by large genome size, DNA replication initiates from multiple points along the genome, so that it is completed within the allocated time. These genomic sites are called replication origins and their study is important as their selection and timely activation is pivotal for the maintenance of genomic integrity. Despite extensive studies from several laboratories, the features that specify an origin remain elusive, especially in higher eukaryotes. The purpose of this thesis is a genome-wide study of the genomic areas that function as replication origins and the extraction of the genomic features that determine this activity. Schizosachharomyces pombe (S. pombe, fission yeast) is an ideal organism for the study of the DNA replication procedure as it shares several common features with higher eukaryotic organisms. In this bioinformatics study, a genome-wide analysis of the S. pombe genome is performed. It is based on two very recent reports from different teams using microarray experiments, in which genome-wide identification of the S. pombe replication origins took place (Heichinger et al, 2006 and Hayashi et al, 2007). Combining these two experiments we managed to separate the fission yeast inter-genic regions in categories depending on their ability to function as replication origins. We then defined 3 new parametric genomic features, created a framework for solving the parameter estimation problem and analyzed how these parameters should be defined so that the specified structures are solely observed in genomic sites that function as replication origins. We observed that for certain parametric combinations, the classification of the intergenic regions as replication origins and as intergenic regions showing no origin activity reached 90% in sensitivity and 77% in positive predictive value. Therefore, the new genomic features identified through this study represent structures that are almost always and solely observed in intergenic regions showing replication activity, and are likely to provide the main genomic mechanism of origin selection in the fission yeast genome.

Η χρήση της βιοπληροφορικής σε βιολογικά δεδομένα υψηλής απόδοσης είναι μια πολλά υποσχόμενη προσέγγιση για τη δημιουργία νέα γνώσης. Στην παρούσα εργασία αναλύεται ένα σύνολο δεδομένων που αφορά στα σημεία έναρξης της αντιγραφής (αφετηρίες) στο ζυμομύκητα Schizosaccharomyces pombe, όπως αναγνωρίστηκαν από πειράματα μικροσυστοιχιών που κάλυπταν όλο το μήκος του γονιδιώματος του οργανισμού (full genome). Οι αντιγραφή ξεκινάει από μεγάλο αριθμό αφετηριών οι οποίες βρίσκονται διάσπαρτες σε όλο το γονιδίωμα και μέχρι τώρα οι περισσότερες μελέτες των χαρακτηριστικών των αφετηρίων είχαν πραγματοποιηθεί για περιορισμένο αριθμό αυτών. Στην εργασία αυτή αναλύονται για πρώτη φορά τα χαρακτηριστικά του συνόλου των αφετηριών του S. pombe με σκοπό να διαπιστωθεί ποια χαρακτηριστικά καθορίζουν πότε μια περιοχή του γονιδιώματος μπορεί να δράσει ως αφετηρία αντιγραφής. Από την ανάλυση αυτή προκύπτει ότι: 1. Οι αφετηρίες έχουν υψηλότερο μέγιστο περιεχόμενο ΑΤ από άλλες γονιδιωματικές περιοχές. 2. Οι αφετηρίες εντοπίζονται κατά προτίμηση σε μεγάλες διαγονιδιακές περιοχές ανάμεσα σε αποκλίνουσες μεταγραφικές μονάδες. 3. Η ασυμμετρία κατανομής Α και Τ ενδέχεται να αποτελεί δείκτη των αφετηριών. 4. Η απόδοση έχει συσχέτιση με το περιεχόμενο ΑΤ. / Use of Bioinformatics in high-throughput biological data is a promising approach for creation of new knowledge. In this work we analyze a dataset that concerns origins of DNA replication initiation in the yeast Schizosaccharomyces pombe, that were identified through full genome microarray experiments. DNA replication starts from a large number of origins that span the entire genome and until recently most studies of origins of replication have been carried out only for a limited number of them. Here we analyze for the first time the properties of the entire dataset of origins of replication in S. pombe in order to find out which specific properties define which genomic location can function as an origin of replication. From this analysis we found that: 1. Origins of replication have higher maximum AT (adenine-thymine) content than other genomic locations. 2. Origins of replication are found preferentially in large genomic locations between divergent transcriptional units. 3. AT asymmetry might be a marker of origins of replication. 4. The origin of replication firing efficiency is correlated with AT content.

Η αδειοδότηση της αντιγραφή του DNA συνίσταται στη συγκρότηση προαντιγραφικών συμπλόκων στη χρωματίνη, στα οποία μετέχουν οι πρωτεΐνες ORC, Cdt1, Cdc6 και MCM2-7. Η πρωτεΐνη Cdt1 αποικοδομείται μετά από βλάβη στο DNA και ενδέχεται να συνδέει το σύστημα αδειοδότησης και το σύστημα απόκρισης σε βλάβη στο DNA. Στη διδακτορική αυτή διατριβή μελετήθηκε η αλληλεπίδραση των συστημάτων αδειοδότησης και απόκρισης σε βλάβη στο DNA με μεθόδους λειτουργικής μικροσκοπίας σε ανθρώπινα κύτταρα, εστιάζοντας στους παράγοντες αδειοδότησης Cdt1 και MCM4. Ο παράγοντας Cdt1 μελετήθηκε μετά από καθολική και εντοπισμένη έκθεση ανθρώπινων κυττάρων σε υπεριώδη ακτινοβολία (UV). Δείχθηκε ότι ακτινοβόληση με UV οδηγεί στην αποικοδόμηση του παράγοντα Cdt1 σε διαφορετικές κυτταρικές σειρές. Ο χρόνος αποικοδόμησης της πρωτεΐνης Cdt1 όμως διαφοροποιείται σημαντικά ανάλογα με τον κυτταρικό τύπο και συγκεκριμένα παρουσιάζει καθυστέρηση στην κυτταρική σειρά καρκινώματος μαστού MCF7 σε σχέση με άλλες καρκινικές σειρές (HeLa, U2OS) και φυσιολογικούς ανθρώπινους ινοβλάστες. Μελέτη της πρωτεΐνης Cdt1 στο χώρο μετά από εντοπισμένη ακτινοβόληση μιας μικρής υποπεριοχής του πυρήνα έδειξε ότι η πρωτεΐνη Cdt1 συσσωρεύεται στην περιοχή της βλάβης από υπεριώδη ακτινοβολία πριν από την αποικοδόμηση της. Παράλληλα, παρατηρήθηκε συσσώρευση στην περιοχή της βλάβης από UV των πρωτεϊνών PCNA, Cdt2 (συστατικό του Cul4-DDB1Cdt2 συστήματος ουβικουιτίνωσης, που είναι υπεύθυνο για την αποικοδόμηση του παράγοντα Cdt1), καθώς και της πρωτεΐνης p21 που στοχεύεται από το ίδιο σύστημα. Πειράματα επαναφοράς φθορισμού σε ζωντανά κύτταρα (Fluorescence Recovery After Photobleaching, FRAP) έδειξαν ότι στις περιοχές εντοπισμένης ακτινοβόλησης με UV οι πρωτεΐνες Cdt1, Cdt2, PCNA και p21 εμφανίζουν τροποποιημένη κινητική συμπεριφορά. Πειράματα αποσιώπησης της έκφρασης της πρωτεΐνης Cdt1 ανέδειξαν έναν ανασταλτικό ρόλο για το Cdt1 στο μονοπάτι επιδιόρθωσης διπλών θραύσεων με ομόλογο ανασυνδυασμό κατά τη διάρκεια της G1 φάσης. Στο δεύτερο μέρος αυτής της εργασίας, εισάγαμε μια νέα in vivo μέθοδο μελέτης της αδειοδότησης που στηρίζεται στην εφαρμογή της FRAP τεχνικής σε MCF7 κύτταρα σταθερά διαμολυσμένα με την πρωτεΐνη MCM4 σημασμένη με την πράσινη φθορίζουσα πρωτεΐνη GFP (GFP-MCM4). Η μέθοδος αυτή επιτρέπει τη μελέτη της κινητικής συμπεριφοράς της πρωτεΐνης MCM4 σε ζωντανά κύτταρα και σε πραγματικό χρόνο. Δείχθηκε ότι το σύστημα αναπαράγει τη λειτουργία της ενδογενούς MCM4 πρωτεΐνης και μπορεί να διακρίνει επιτυχώς μεταξύ αδειοδοτημένης και μη κατάστασης. Ακολούθως, το σύστημα χρησιμοποιήθηκε για να μελετηθεί η επίδραση της υπεριώδους ακτινοβολίας στην αδειοδότηση της χρωματίνης για αντιγραφή. Διαπιστώθηκε ότι επίδραση με υπεριώδη ακτινοβολία οδηγεί σε μείωση του κλάσματος της MCM4 που είναι προσδεδεμένο στη χρωματίνη. Περαιτέρω μέλετη έδειξε ότι η μείωση αυτή παρουσιάζεται στη φάση G1 του κυτταρικού κύκλου και περιορίζεται στην περιοχή της βλάβης, δείχνοντας ότι αποτελεί εντοπισμένη απόκριση του κυττάρου στην ύπαρξη βλάβης. Συμπερασματικά, η συγκεκριμένη διδακτορική διατριβή ανέδειξε την αλληλεπίδραση των συστημάτων αδειοδότησης της αντιγραφής του DNA και της κυτταρικής απόκρισης σε βλάβη στο DNA και εισήγαγε μια νέα μέθοδο μελέτης της αδειοδότησης της αντιγραφής του DNA. Μελετήθηκαν οι παράγοντες του συστήματος αδειοδότησης Cdt1 και MCM4, οι οποίοι αποκρίνονται στη βλάβη στο DNA, με το Cdt1 να παίζει ρόλο στην επιλογή επιδιορθωτικού μηχανισμού μετά από πρόκληση βλάβης διπλών θραύσεων του DNA και την πρωτεΐνη MCM4 να εμφανίζει μειωμένη πρόσδεση στη χρωματίνη στην περιοχή της βλάβης μετά από ακτινοβόληση με UV. / Licensing DNA for replication involves the formation of pre-replicative complexes on chromatin, consisting of the proteins ORC, Cdt1, Cdc6 and MCM2-7. Cdt1 is degraded following DNA damage and this suggests a regulatory crosstalk between DNA licensing and DNA damage response (DDR) systems. Here the molecular interplay between these two systems was studied in human cell cultures. The kinetics of Cdt1 degradation in response to UV irradiation was shown to differ in different human cell lines, exhibiting a delay in MCF7 cells in comparison to HeLa, U2OS and human fibroblasts, which implies a difference in the DDR sensitivity of these cells. By studying the spatial regulation of Cdt1 in response to localized DNA damage, the accumulation of Cdt1 in UV irradiated sites prior to its degradation was recorded. Proteins participating in the degradation of Cdt1 through ubiquitin dependent proteolysis (PCNA and Cdt2), as well as protein p21 which is targeted by the same ubiquitin ligase following DNA damage, were also shown to accumulate at UV irradiated sites. Fluorescence Recovery After Photobleaching (FRAP) experiments showed that Cdt1, Cdt2, PCNA and p21 exhibit altered kinetics at UV irradiated sites. Silencing of Cdt1 expression revealed an inhibitory role of Cdt1 in the repair of double strand breaks through homologous recombination during the G1 phase of the cell cycle. In the second part of this thesis, we introduced an in vivo licensing assay based on FRAP in MCF7 cells stably expressing MCM4 tagged with the Green Fluorescent Protein (GFP). This assay allows the study of the kinetic behaviour of MCM4 in live cells and in real time. A plasmid expressing GFP-MCM4 was constructed and MCF7 cells stably expressing this plasmid were produced. The GFP-MCM4 cell line was further characterized to ensure a correct cell cycle profile, GFP-MCM4 levels, subcellular localization, interactions with other MCM proteins and binding to chromatin. FRAP experiments on the stable GFP-MCM4 cells verified that the assay could successfully distinguish between licensed and unlicensed state. Using this assay, the effect of UV irradiation on MCM4 kinetics was studied. UV irradiation led to a decrease in the fraction of MCM4 binding to chromatin. This effect was more profound in middle G1 phase and was restricted to the site of UV irradiation. In conclusion, this thesis addressed the interaction of DNA licensing and DNA damage response systems and introduced an in vivo DNA licensing assay. Licensing proteins Cdt1 and MCM4 were shown to respond to DNA damage, with Cdt1 affecting the double strand break repair choice pathway and MCM4 exhibiting reduced chromatin binding following UV irradiation.