Γενετικές παραλλαγές σε γονιδιακούς τόπους που βρίσκονται εντός (cis) αλλά και εκτός (trans) του συμπλέγματος των ανθρώπινων β-σφαιρινικών γονιδίων έχει δειχθεί πως συσχετίζονται σημαντικά με τα επίπεδα της εμβρυϊκής αιμοσφαιρίνης (HbF). Ένα από τα γονίδια αυτά είναι το γονίδιο MAP3K5 (ή ASK1), το οποίο είναι μέλος της οδού της MAP κινάσης, ενεργοποιείται από διάφορες παθολογικές καταστάσεις και από προ-φλεγμονώδεις κυτοκίνες, συμβάλλοντας στην κυτταρική απόπτωση. Πρόσφατα αποτελέσματα από το εργαστήριό μας έδειξαν ότι η παρουσία του σπάνιου αλληλομόρφου C σε μονονουκλεοτιδικούς πολυμορφισμούς (SNP) του συγκεκριμένου γονιδίου, και συγκεκριμένα στους rs9376230 και rs9483947, συσχετίζεται με μειωμένα επίπεδα της εμβρυϊκής αιμοσφαιρίνης (HbF) (Tafrali et al., 2013). Για το λόγο αυτό, υποθέσαμε ότι οι πολυμορφισμοί αυτοί συνδέονται με πιθανές αλλαγές σε ρυθμιστικές περιοχές του γονιδίου ΜΑΡ3Κ5 οι οποίες τροποποιούν τα επίπεδα έκφρασής του. Έτσι, ερευνήσαμε τον υποκινητή του γονιδίου ΜΑΡ3Κ5 ως προς τη συχνότητα παρουσίας τεσσάρων ή πέντε αντιγράφων της μικροδορυφορικής αλληλουχίας 5’ – GCGCG – 3’ (θέση -51 έως -27 από τη θέση έναρξης της μεταγραφής). Με την προσέγγιση αυτή θελήσαμε να εξακριβώσουμε εάν οι μικροδορυφορικές αυτές αλληλουχίες συνδέονται με τους μονονουκλεοτιδικούς πολυμορφισμούς και, κατά συνέπεια, με τα επίπεδα της HbF σε ασθενείς με ενδιάμεση ή μείζονα β-μεσογειακή αναιμία και σε μη-θαλασσαιμικά άτομα. Για τον σκοπό αυτό, χρησιμοποιήθηκαν 11 ασθενείς με ενδιάμεση β-μεσογειακή αναιμία, 15 ασθενείς με μείζονα β-μεσογειακή αναιμία και 60 μη-θαλασσαιμικά άτομα ελληνικής καταγωγής. Ο προσδιορισμός του γονότυπου πραγματοποιήθηκε με εκλεκτική ενίσχυση του τμήματος του υποκινητή του γονιδίου ΜΑΡ3Κ5, μεταξύ των θέσεων -273 έως και +79, και στη συνέχεια, είτε με αλληλούχιση σε αυτοματοποιημένο αναλυτή ή με ανάλυση ετεροδιμερών. Η ανάλυση έδειξε ότι υπάρχει σχεδόν απόλυτη σύνδεση των σπάνιων αλληλομόρφων C τόσο για τον rs9376230 όσο και για τον rs9483947 με τη μικροδορυφορική αλληλουχία των πέντε επαναλήψεων, σχηματίζοντας έναν απλότυπο. O συγκεκριμένος απλότυπος συσχετίζεται με χαμηλά επίπεδα της HbF και το φαινότυπο της βαριάς β-μεσογειακής αναιμίας, αφού σε ασθενείς με μείζονα β-μεσογειακή αναιμία εντοπίζεται με συχνότητα 60% και αποκλίνει στατιστικώς σημαντικά από τις αντίστοιχες συχνότητες σε ασθενείς με ενδιάμεση β-μεσογειακή αναιμία (p=0,04) και σε μη-θαλασσαιμικά άτομα (p=0,003). Τα αποτελέσματα αυτά δείχνουν ότι οι πολυμορφισμοί rs9376230 και rs9483947 συνδέονται με τη μικροδορυφορική αλληλουχία του υποκινητή, η οποία έχει πιθανό λειτουργικό ρόλο στα επίπεδα έκφρασης του γονιδίου ΜΑΡ3Κ5. / Genetic variations in loci that are in cis or trans of the human beta-globin gene cluster are shown to correlate significantly with the levels of fetal hemoglobin (HbF). One of these genes is MAP3K5 (or ASK1), a member of the MAPK pathway, which is activated by various stresses and pro-inflammatory cytokines that contribute to cellular apoptosis. Recent results from our laboratory have shown that the presence of the rare C allele in two intronic SNPs of MAP3K5, namely rs9376230 and rs9483947, is associated with reduced levels of fetal hemoglobin (HbF) (Tafrali et al., 2013). For this reason, we assumed that these polymorphisms may be associated with changes in the regulatory regions of MAP3K5 which could modify its expression levels. Thus, we investigated the frequency of a microsatellite marker at the proximal promoter region of MAP3K5, regarding the presence of four or five repeats of a 5-bp short tandem repeat (STR), am y 5’ – GCGCG – 3’ (positio -51 to -27 from transcription start site). With this approach, we wanted to ascertain whether this STR is associated with the previously studied SNPs (Tafrali et al., 2013) and consequently with th v s o bF i β-thalassemia intermediate or major patients compared to non-thalassemic individuals. For this purpose, we analyzed the DNA samples from 11 β-tha ass mia i t rm ia a 15 β-thalassemia major patients, as well as 60 non-thalassemic controls of Western Greek origin. Genotyping was performed by selectively amplifying a MAP3K5 gene promoter fragment between positions -273 to +79, followed by either sequencing or heteroduplex analysis. The analysis showed that there is an almost perfect correlation of the rare C allele for rs9376230 and the rare C allele for rs9483947 with the five STR repeats, forming a haplotype associated with low levels of HbF and with the phenotype of severe b-thalassemia. This haplotype is detected with a r qu cy o 60% i β-thalassemia major patients and it statistica y sig i ica t y viat s rom th corr spo i g r qu ci s i β-thalassemia intermedia patients (p = 0.04) and in non-thalassemic individuals (p = 0.003). These results indicate that the polymorphisms rs9376230 and rs9483947 are in linkage with the promoter STR polymorphism, which may have a functional role in MAP3K5 gene expression.

Οι αιμοσφαιρινοπάθειες συγκαταλέγονται ανάμεσα στις πιο κοινές μονογονιδιακές διαταραχές παγκοσμίως, συμπεριλαμβανομένης της β-θαλασσαιμίας και της δρεπανοκυτταρικής αναιμίας. Η επανενεργοποίηση των γονιδίων της γ-σφαιρίνης φαίνεται να είναι μια ενδιαφέρουσα θεραπευτική προσέγγιση για τους ασθενείς που πάσχουν από β-τύπου αιμοσφαιρινοπάθειες. Ορισμένες φαρμακευτικές ουσίες έχουν τη δυνατότητα να επάγουν παροδικά την έκφραση των γονιδίων της γ-σφαιρίνης γεγονός που βελτιώνει το φαινότυπο των ασθενών λόγω των υψηλότερων επιπέδων HbF που παρατηρούνται. Η μόνη φαρμακευτική ουσία που έχει εγκριθεί από τον FDA και χρησιμοποιείται ευρύτατα σε ασθενείς που πάσχουν από β-τύπου αιμοσφαιρινοπάθειες και συγκεκριμένα από δρεπανοκυτταρική αναιμία είναι η HU. Παρά το γεγονός ότι στην πλειονότητα των ασθενών παρατηρείται αύξηση της παραγωγής HbF μετά από αγωγή με HU (Steinberg et al. 1997), τα επίπεδα αύξησης διαφέρουν αρκετά μεταξύ των ασθενών που πάσχουν από β-θαλασσαιμία και δρεπανοκυτταρική αναιμία(Patrinos and Grosveld 2008). Σύμφωνα με τους Borg και συνεργάτες, το γονίδιο KLF10 φαίνεται να σχετίζεται με την αύξηση των επιπέδων της HbF και την ανταπόκριση ασθενών με β-τύπου αιμοσφαιρινοπάθειες σε θεραπεία με HU(Borg et al. 2012). Στην παρούσα μελέτη διερευνήθηκε η πιθανή συσχέτιση των SNP rs319133 και rs11552577, που εδράζονται στο γονίδιο KLF10, με αυξημένα επίπεδα HbF και η αξιολόγηση αυτών ως φαρμακογονιδιωματικοί δείκτες, που σχετίζονται με τη μεταβλητότητα των επιπέδων της HbF ως απόκριση στη θεραπεία με HU. Χρησιμοποιήθηκαν ασθενείς που πάσχουν από βαριά β-θαλασσαιμία, ενδιάμεση β-θαλασσαιμία, μη-θαλασσαιμικοί ασθενείς και διπλά ετερόζυγοι ασθενείς για β-θαλασσαιμία και δρεπανοκυτταρική αναιμία. Η μέθοδος γονοτύπησης που χρησιμοποιήθηκε και για τους δύο πολυμορφισμούς ήταν η PCR-RFLP. Η απουσία του πολυμορφισμού rs319133 φαίνεται να σχετίζεται με αυξημένα επίπεδα HbF στους ασθενείς που χαρακτηρίζονται από ενδιάμεση β-θαλασσαιμία συγκριτικά με ασθενείς που πάσχουν από βαριά β-θαλασσαιμία (p=0.04). Επίσης παρατηρείται μια στατιστική τάση συσχέτισης χειρότερης ανταπόκρισης στην αγωγή με HU στους διπλά ετερόζυγους ασθενείς 96 για β-θαλασσαιμία και δρεπανοκυτταρική αναιμία. Για τον δεύτερο πολυμορφισμό που μελετήθηκε δεν παρατηρήθηκαν στατιστικά σημαντικές διαφορές. Τα δεδομένα της παρούσας μελέτης υποδεικνύουν συσχέτιση του γονιδίου KLF10 με αυξημένα επίπεδα HbF. Μελέτες σε πολυπληθέστερες ομάδες θα μπορούσαν να οδηγήσουν στον εντοπισμό και άλλων πολυμορφισμών που σχετίζονται με αυξημένη έκφραση των γονιδίων της γ-σφαιρίνης. / Hemoglobinopathies are amongst the most common single gene disorders worldwide, including the thalassemias and sickle cell disease (SCD). Reactivation of the human γ-globin genes would be a therapeutic intervention for β-type hemoglobinopathies patients. Some drugs and compounds can transiently induce γ-globin gene expression and improve the disease phenotype by augmenting HbF accumulation. Only HU (hydroxyurea) is approved from the FDA and is widely used to treat patients with β-type hemoglobinopathies, in particular sickle cell disease. Although the majority of patients show an increase of HbF production upon HU treatment(Steinberg et al. 1997), the level of HbF increase differs considerably among β-thalassemia and SCD patients(Patrinos and Grosveld 2008). According to Borg et al, KLF10 appears to be significantly associated with high HbF and it may act as an important pharmacogenetic biomarker for β-type hemoglobinopathies patients who are treated with HU(Borg et al. 2012). The aim of our study was to elucidate whether there is an association of the SNPs namely rs3191333 and rs11552577 in KLF10 gene with increased levels of HbF and with response to HU treatment in β-hemoglobinopathies patients. We analyzed samples of β-thalassemia major patients, of β-thalassemia intermedia patients, of healthy (non-thalassemic) donors and samples of SCD/β–thalassemia patients who have been treated with HU. Genotyping was carried out by using PCR-RFLP. The lack of rs3191333 is associated with increased HbF levels in β–thalassemia intermedia compared to β– thalassemia major patients (p=0.04). Also, it is shown a statistical trend of worse response to HU treatment in compound heterozygote β–thalassemia-SCD patients. As far as rs11552577 is concerned no statistically significant differences were observed. Our data show that KLF10 gene is strongly associated with HbF levels. Further analyses could possibly reveal novel variants which are associates with increased expression of γ-globin genes.

L’érythropoïèse inefficace joue un rôle central dans la physiopathologie de l’anémie des β-TM. Ses caractéristiques sont triple: accélération de la différenciation érythroïde, arrêt de maturation au stade d’érythroblaste polychromatophile et mort par apoptose à ce stade de différenciation. Les mécanismes précis de cette apoptose et de l’arrêt de la maturation n’ont pas encore été élucidés. Il a été montré, au cours de l’érythropoïèse physiologique, que la protéine chaperonne Hsp70, en se localisant dans le noyau des érythroblastes en cours de différenciation, protège GATA-1 (facteur de transcription érythroïde majeur) de sa destruction par la caspase-3. Cette enzyme clé de l’apoptose est en effet activée physiologiquement au cours de la différenciation érythroïde et peut cliver GATA-1. Notre travail se base sur l’hypothèse suivante : Hsp70 pourrait, au cours de l’érythropoïèse des β-TM, être séquestrée dans le cytoplasme des érythroblastes matures (stade d’une intense hémoglobinisation) afin d’exercer son rôle de chaperonne des chaînes d’α-globine libres. Cela aurait comme conséquence néfaste l’absence de localisation nucléaire d’Hsp70 et, en conséquence, la destruction de GATA-1 à l’origine de l’arrêt de maturation et de la mort cellulaire. Nous avons montré dans ce travail qu’Hsp70 était localisée principalement dans le cytoplasme des érythroblastes matures dans la moelle de patients β-TM, avec un défaut d’expression nucléaire. Par ailleurs, GATA-1 n’est plus exprimé dans ces cellules. Nous avons confirmé ces résultats dans un système de culture cellulaire érythroïde humaine en milieu liquide reproduisant les étapes de la différenciation érythroïde terminale. Une intéraction physique directe entre Hsp70 et l’α-globine a été identifiée par techniques de microscopie confocale, d’immunoprécipitation et de double hybride. Enfin, la transduction dans les érythroblastes de β-TM d’un mutant d’Hsp70-S400A, principalement nucléaire, ou d’un mutant de GATA-1 non clivable par la caspase-3 corrige l’érythropoïèse inefficace.Une modélisation mathématique du complexe Hsp70/α-globine nous a permis de préciser les domaines impliqués dans l’intéraction, ce qui ouvre la voie à une possibilité de criblage de petites molécules permettant la rupture de ce complexe afin de ramener Hsp70 dans le noyau avec un espoir thérapeutique pour améliorer l’érythropoïèse inefficace des β-TM. / Β-TM is an inherited hemoglobinopathy caused by a quantitative defect in the synthesis of the β-globin chains of hemoglobin, leading to the accumulation of free α-globin chains that form toxic aggregates. Despite extensive knowledge on the molecular defects causing β-TM, little is known about the mechanisms responsible for ineffective erythropoiesis (IE), which is characterised by accelerated erythroid differentiation, maturation arrest and apoptosis at the polychromatophilic stage. We have previously demonstrated that normal human erythroid cell maturation requires a transient activation of caspase-3. Although GATA-1, the master transcriptional factor of erythropoiesis, is a caspase-3 target, we have shown that during human erythroid differentiation, it is protected from cleavage through its association with the chaperone Hsp70 in the nucleus. Hsp70 is constitutively highly expressed in normal human erythroid cells. The best-known role of this ubiquitous chaperone is to participate in proteins folding and refolding of proteins denatured by cytoplasmic stress, thus preventing their aggregation.In this study, we have evidenced that during the maturation of human β-TM erythroblasts, Hsp70 is sequestrated in the cytoplasm by the excess of free α-globin chains, resulting in nuclear GATA-1 cleavage and, in turn, end-stage maturation arrest and apoptosis. A molecular modeling shows that α-globin binds to a highly electronegative cavity formed by all Hsp70 domains. Additionally, the transduction of a nuclear-targeted Hsp70 mutant (Hsp70-S400A) or caspase-3 uncleavable GATA-1 mutant (µGATA-1) corrects β-TM ineffective erythropoiesis in human cultured β-TM cells. Our data indicate that cytosolic Hsp70 sequestration by α-globin chains prevents its nuclear localization and is a key mechanism of the β-TM IE. In order to increase nuclear Hsp70 translocation, developing small molecules that could increase Hsp70 expression or disrupt the Hsp70/α-globin complex could be a novel approach of targeted therapies to improve erythropoiesis in β-TM.

Οι αιμοσφαιρινοπάθειες, συμπεριλαμβανομένης της β-θαλασσαιμίας και της δρεπανοκυτταρικής αναιμίας, συγκαταλέγονται ανάμεσα στις πιο κοινές μονογονιδιακές αναταραχές παγκοσμίως, που χρήζουν αποτελεσματικής θεραπευτικής στρατηγικής. Σήμερα, η επανενεργοποίηση των γονιδίων της γ-σφαιρίνης φαίνεται να είναι μια ενδιαφέρουσα θεραπευτική προσέγγιση για τους ασθενείς που πάσχουν από β-τύπου αιμοσφαρινοπάθειες. / Hemoglobinopathies are amongst the most common single gene disorders worldwide, including beta-thalassemia and sicle cell disease (SCD), seeking for therapeutic intervention. The reactivation of the human gamma-globin genes is considered to be a therapeutic strategy for beta-type hemoglobinopathies patients.