- / -

- / -

- / -

- / -

- / -

Η ανακάλυψη των microRNA γονιδίων το 1993 έφερε επανάσταση στα όσα γνωρίζαμε από το κεντρικό δόγμα της Βιολογίας για τη σύνθεση των πρωτεϊνών και τη ρύθμιση της πρωτεϊνικής έκφρασης. Αυτό γιατί τα microRNA γονίδια δεν κωδικοποιούν κάποια πρωτεΐνη αλλά αντί αυτού παράγουν μικρά μόρια μεγέθους περίπου 22 νουκλεοτιδιών. Τα μόρια αυτά αλληλεπιδρούν με το mRNA και συγκεκριμένα βρίσκουν στόχους στις 3 UTR περιοχές άλλων γονιδίων και αλληλεπιδρούν με βάση την αρχή της συμπληρωματικότητας Watson-Crick. Αποτέλεσμα αυτής της πρόσδεσης είναι η καταστολή της πρωτεϊνικής έκφρασης του γονιδίου στόχου μέσω αναστολής της μετάφρασης ή μέσω της υποβάθμισης του mRNA. Μετά την ανακάλυψη των microRNA και του τρόπου αλληλεπίδρασης τους ήταν φυσικό να ακολουθήσουν εκτεταμένες έρευνες για τις κυτταρικές διεργασίες τις οποίες ρυθμίζουν αλλά και σε ποιών γονίδιων τη ρύθμιση λαμβάνουν μέρος. Ως αποτέλεσμα προέκυψε ότι σε πολλές γνωστές ασθένειες παρουσιάζεται άμεση συσχέτιση με ρύθμιση από microRNA. Τέτοια περίπτωση αποτελεί και η ασθένεια του καρκίνου η οποία σε συνδυασμό με την «λεπτή» ρύθμιση που προκαλούν τα microRNA δίνει ελπίδες για νέες μοριακές θεραπείες. Αυτά είναι μερικά παραδείγματα από τα οποία μπορούμε να καταλάβουμε τη μεγάλη σημασία των microRNA και την ανάγκη για αποδοτική πρόβλεψη τους. Εξαιτίας του μικρού τους μεγέθους αλλά και του μικρού τους ποσοστού σε σχέση με το μέγεθος του γονιδιώματος (περίπου 3%) ο πειραματικός τους εντοπισμός χαρακτηρίζεται εξαιρετικά δύσκολος. Για το λόγο αυτό έχουν επιστρατευτεί αρκετές μέθοδοι Υπολογιστικής Νοημοσύνης και Αλγόριθμοι οι οποίοι μπορούν να «ξεχωρίσουν» τα πραγματικά γονίδια από τα ψεύτικα γονίδια δημιουργώντας έτσι μοντέλα πρόβλεψης. Μέχρι στιγμής έχουν χρησιμοποιηθεί σαν μέθοδοι ταξινόμησης, Support Vector Machine, δίκτυα Bayes και άλλες πιθανοτικές μέθοδοι όπως τα Hidden Markov μοντέλα .Όλες οι μέθοδοι αυτού του είδους βασίζονται στον υπολογισμό αρκετών χαρακτηριστικών για τα microRNA που σχετίζονται με το ακολουθιακό περιεχόμενο, με τη δομή τους στο χώρο αλλά και με θερμοδυναμικά στοιχεία των μορίων. Σε μεγάλο βαθμό η αποδοτικότητα πρόβλεψης βασίζεται στην επιλογή των πιο αντιπροσωπευτικών χαρακτηριστικών και στη βελτιστοποίηση των παραμέτρων της υπολογιστικής μεθόδου που χρησιμοποιείται χωρίς μέχρι τώρα να έχει βρεθεί μια αξιόπιστη λύση. Στην παρούσα διπλωματική εργασία αρχικά προτείναμε μια νέα υβριδική μεθοδολογία για ταυτόχρονη ταξινόμηση microRNA γονιδίων, εξαγωγή χαρακτηριστικών και υπολογισμό παραμέτρων. Η προτεινόμενη μεθοδολογία χρησιμοποιεί τις καινοτόμες τεχνικές του Εξελικτικού Προγραμματισμού και συγκεκριμένα τους Γενετικούς Αλγορίθμους για την εξαγωγή χαρακτηριστικών και βελτιστοποίηση παραμέτρων καθώς και Support Vector Machine για ταξινόμηση. Απώτερος στόχος της παρούσας εργασίας ήταν να αναπτυχθεί μια ολοκληρωμένη διαδικτυακή πλατφόρμα η οποία επιτρέπει αρχικά υπολογισμό χαρακτηριστικών για τις γονιδιακές ακολουθίες που θα εισάγει ο χρήστης και κατά δεύτερον δίνει την πρόβλεψη του ταξινομητή για το αν είναι ή όχι microRNA γονίδια μέσω ενός φιλικού περιβάλλοντος. Επιπλέον, ενσωματώθηκαν τα περισσότερα microRNA χαρακτηριστικά που έχουν προταθεί στη βιβλιογραφία και η αποδοτικότητα πρόβλεψης του ταξινομητή βελτιώθηκε μέσω της προτεινόμενης υβριδικής μεθόδου. Ενσωματώσαμε διάφορα πακέτα για τον υπολογισμό των χαρακτηριστικών όπως το Vienna RNA Package και το UnaFold και αυτό το κομμάτι της εργασίας σχετίζεται με την έρευνα για τη θερμοδυναμική και φυσικοχημική συμπεριφορά των μικρών RNA μορίων. Καινοτόμο στοιχείο αποτελεί το γεγονός ότι ο υπολογισμός των χαρακτηριστικών γίνεται με τέτοιο τρόπο ώστε να ευνοείται στη συνέχεια η εφαρμογή μεθόδων Υπολογιστικής Νοημοσύνης. Επιπλέον στο σύστημα ενσωματώσαμε βάση δεδομένων η οποία αποθηκεύει τις επεξεργασμένες ακολουθίες και τα υπολογισμένα χαρακτηριστικά δίνοντας ώθηση για την κατασκευή νέων συνόλων δεδομένων. Τέλος αυτή η δυνατότητα ανάκτησης πληροφορίας κάνει το σύστημα μας μια ολοκληρωμένη πλατφόρμα μελέτης μικρών RNA μορίων και πρόβλεψης microRNA γονιδίων. / The discovery of microRNA genes in 1993 challenged the view of the Central Dogma of Biology and introduced a new layer of complexity in which RNA is not only a carrier of gene information but also a mediator of gene expression and protein synthesis. Typically, microRNA genes are short non-coding (~20-22 nt) RNAs that do not encode proteins, but instead they produce small RNA molecules. These molecules can regulate mRNA target genes by binding to the 3’ UTR of mRNA in accordance to Watson-Crick complementarity for cleavage or translational repression. MicroRNAs have been a major object of study as they have been found to be involved in some basic biological processes. These observations underline the importance of normal microRNA homeostasis on functions such as development, differentiation, apoptosis and proliferation. Dysregulation of miRNA is fundamental to the pathogenesis of many diseases and it has been long suspected that miRNA expression can be deregulated in cancer and abnormal miRNA activity may lead to tumorgenesis. From all the above, it is obvious that the better understanding of miRNA mechanism and function may lead to new and more sophisticated design of clinical therapies. Consequently, the identification of novel microRNA genes is a challenging bioinformatics problem. The experimental identification has some important drawbacks: the small size of microRNA genes in comparison to the size of the genome, cost and time, and low sensitivity. To overcome these technical problems a lot of computational methods have been proposed and several Artificial Intelligence techniques have been applied to distinguish real pre-miRNAs from pseudo hairpins. Support Vector Machines, Naïve Bayes and other probabilistic algorithms such as Hidden Markov Models have been successfully developed as classification methods. All these computational methods rely on the computation of several sequential, structural and thermodynamical microRNA features. In addition, the prediction efficiency is related to the extraction of the most discriminative features and to the optimization of the parameters. At first, this thesis presents a hybrid approach for simultaneous microRNA classification, feature extraction and parameters optimization. We took advantage of the innovative techniques of Evolutionary Programming and we introduced an embedded classification method, which combines the efficiency and robustness of Support Vector Machines with Genetic Algorithms for feature selection and parameters optimization. Secondly, objective of this thesis was the development of an online platform for effective microRNA genes prediction. The prediction model is based on our classification model and we used a significant feature subset that the proposed methodology revealed to be consistent. Also, we provided the opportunity to calculate all the microRNA features that have been proposed in the literature. We incorporated different packages such as the Vienna RNA package and UnaFold package and we introduced some new features with high discriminative power. This work is related to biophysics and thermodynamics of small RNA molecules and it can be applied to other categories of regulatory molecules. Also, the provided service in accordance to the feature calculation will encourage the application of other Artificial Intelligence Techniques in identifying microRNAs. We hope that the construction of new datasets will contribute to the Development of new Machine Learning methodologies. Furthermore, our tool maintains a Database about predicted microRNA sequences plus some informating metadata about them. Finally it can act as an integraded system and the usage of metadata enables information retrieval.

Το πολλαπλούν μυέλωμα είναι μια νεοπλασία η οποία, έως και σήμερα, παραμένει ανίατη. Στο ΠΜ, το ανοσοποιητικό σύστημα δε κατορθώνει να καταστρέψει τα κακοήθη πλασμοκύτταρα, ενώ υπάρχουν ενδείξεις ότι τα κύτταρα του όγκου παίζουν ενεργό ρόλο σε αυτό. Στην παρούσα διατριβή, ελέγξαμε ποικίλλες μυελωματικές σειρές σχετικά με την έκφραση των προ- και αντι-αποπτωτικών γονιδίων. Βρήκαμε ότι τα μυελωματικά κύτταρα εκφράζουν έναν μη φυσιολογικό φαινότυπο (fas high/bcl low). Μελετώντας τα κύτταρα του μυελού των οστών ενός ασθενούς με ΠΜ τύπου IgG/k σταδίου ΙΙΙΑ, διαπιστώσαμε ότι αυτά τα κύτταρα εξέφραζαν τα γονίδια granzyme B και perforin, τα οποία υπό κανονικές συνθήκες εκφράζονται μόνο από τα κυτταροτοξικά Τ λεμφοκύτταρα (CTLs) και τα φυσικά φονικά κύτταρα (ΝΚ). Προτείνουμε ότι πιθανόν το παραπάνω γεγονός αποτελεί έναν επιπλέον αμυντικό μηχανισμό των κυττάρων του όγκου εναντίον των CTLs και ΝΚ κυττάρων. Συγκεκριμένα υποθέτουμε ότι τα κύτταρα του όγκου προσελκύουν τα CTLs και τα ΝΚ κύτταρα και τα καταστρέφουν με τη διαδικασία της κυτταρόλυσης. Τα διφωσφονικά οξέα χρησιμοποιούνται ευρέως για τη θεραπεία του ΠΜ, ενώ η θαλιδομίδη χρησιμοποιείται σήμερα για τη θεραπεία πολλών τύπων ΠΜ. Μελετήσαμε την επίδραση της θαλιδομίδης, του ζολεδρονικού οξέος και το συνδυασμό τους στην επιβίωση των μυελωματικών κυττάρων. Βρήκαμε ένα συνεργιστικό αποτέλεσμα των δύο αυτών ουσιών. Όταν η θαλιδομίδη συγχοηγηθεί με το ζολεδρονικό οξύ σε ελάχιστους μη δραστικούς μηχανισμούς, μειώνει την τοξική επίδραση 50% του τελευταίου 3-4 φορές. / Multiple Myeloma (MM) is a plasma cell neoplasia which, to this day, remains incurable. In MM, the immune system fails to destroy the malignant plasmocytes, and evidence exists that the tumor plays an active part in this. In the present study, we tested various MM cell lines for the expression of pro- and anti-apoptotic genes. We found that MM cells express an abnormal phenotype, namely fas high/bcl low. By studying bone marrow cells from a patient suffering of MM IgG/k type stage IIIA, we found that those cells expressed granzyme B nad perforin, normally expressed by cytotoxic T cells (CTLs) and natural killer (NK) cells. We propose that this may constitute an additional acquired mechanism by the tumor cells to protect themselves against the host.

- / -

- / -

Τα έντομα και άλλοι ποικιλόθερμοι οργανισμοί έχουν αναπτύξει διάφορους μοριακούς μηχανισμούς για την προστασία τους από ακραίες θερμοκρασίες και άλλες στρεσογόνες καταστάσεις που συμβαίνουν κατά τη διάρκεια της ζωής τους. Ένας από τους σημαντικότερους μηχανισμούς είναι η παραγωγή των θερμοεπαγόμενων πρωτεϊνών οι οποίες, ως μοριακοί συνοδοί, προστατεύουν τα κύτταρα από τη μετουσίωση και συσσωμάτωση των πρωτεϊνών τους. Πολλές από τις θερμοεπαγόμενες πρωτεΐνες συνθέτονται και σε φυσιολογικές συνθήκες και παίζουν σημαντικούς ρόλους στην ορθή αναδίπλωση, μεταφορά και αποικοδόμηση των πρωτεϊνών του κυττάρου. Το εργαστήριο μας ενδιαφέρεται για το ρόλο των θερμοεπαγόμενων πρωτεϊνών και τη ρύθμιση των γονιδίων τους στη Μεσογειακή μύγα. Τέσσερα θερμοεπαγόμενα γονίδια, hsp90, hsp70, hsp27 και hsp26, έχουν κλωνοποιηθεί και χαρακτηριστεί στο εργαστήριό μας. Στόχοι αυτής της μεταπτυχιακής εργασίας είναι α) η λειτουργική ανάλυση της 5’ ανοδικής περιοχής του γονιδίου hsp90 της Μεσογειακής μύγας και β) η έκφραση του γονιδίου σε συνθήκες ψυχρού στρες. Για να μελετήσουμε την ρύθμιση του γονιδίου hsp90, δημιουργήσαμε διαγονιδιακά στελέχη που έφεραν το γονίδιο της λουσιφεράσης (ως γονίδιο αναφοράς) υπό τον έλεγχο διαφορετικών 5’ περιοχών του γονιδίου hsp90. Η ανάλυση των στελεχών αυτών έδειξε ότι η ευρύτερη περιοχή του υποκινητή που εκτίνεται έως και το -3536 περιλαμβάνει όλα τα απαραίτητα στοιχεία για τη θερμοεπαγόμενη έκφραση του γονιδίου. Για να μελετήσουμε εάν η χαμηλή θερμοκρασία (0 oC) έχει κάποια επίδραση στη βιωσιμότητα του εντόμου και στην έκφραση του hsp90, ομάδες αρσενικών ενήλικων εντόμων επωάστηκαν για διαφόρους χρόνους στους 0 oC και ακολούθως μελετήθηκε η επιβίωσή τους και η έκφραση του θερμοεπαγόμενου γονιδίου με RT-PCR και qRT-PCR. Τα αποτελέσματά μας υποδηλώνουν ότι οι χαμηλές θερμοκρασίες αυξάνουν την έκφραση του hsp90 σχεδόν στα ίδια επίπεδα με εκείνα του θερμικού στρες. Επίσης η βιωσιμότητα των εντόμων βρέθηκε πολύ υψηλή στους 0 oC. / Insects and other poikilotherms have multiple molecular mechanisms for their protection from extreme environmental and other stressful conditions which happens during their life. One of these mechanisms is the production of heat shock proteins. These proteins, being molecular chaperones, protect the cells from protein denaturation and aggregation. Some of these proteins are produced under normal conditions, and they play important role in proper protein folding, transport and degradation. We are interested in the role of heat shock proteins and the regulation of their genes in Mediterranean fruit fly (medfly). Four heat shock genes have been cloned and characterized in our laboratory. These are hsp90, hsp70, hsp27 and hsp26. The aim of this master thesis is: a) to study the normal and heat-induced regulation of the medfly’s hsp90 gene and b) to study the expression of this gene under cold shock conditions. For the first aim we created transgenic flies which they had the lusiferase gene (as a reference gene) under the control of different 5’ upstream regions of hsp90 gene. The analysis of these transgenic strains showed that the region between the first transcription base pair and -3536 base pair is crucial for the expression of the gene under normal and heat shock conditions. In order to examine whether the low temperature (0 oC) has any effect in the medfly’s viability and the expression of hsp90 gene, male groups were exposed at different intervals at 0 oC and then it was examined the viability and the expression of the gene. Our results suggest that the low temperature increases the expression of hsp90 nearly to the same levels of the thermal stress and this temperature does not affect the viability of the insect.