Η απόκριση των κυττάρων στο στρες συνδέεται με την επαγωγή μιας ομάδας πρωτεϊνών που ονομάζονται θερμοεπαγόμενες πρωτεΐνες (Hsps). Οι πρωτεΐνες αυτές ανήκουν στην κατηγορία των κυτταρικών συνοδών μορίων (chaperons) και προστατεύουν τα κύτταρα από τη μετουσίωση και συσσωμάτωση των πρωτεϊνών τους. Οι περισσότερες Hsps συντίθενται και σε φυσιολογικές συνθήκες και παίζουν σημαντικούς ρόλους στην ορθή αναδίπλωση, μεταφορά και αποικοδόμηση των πρωτεϊνών του κυττάρου. Οι Hsps κατηγοριοποιούνται σε διακριτές οικογένειες σύμφωνα με τα μοριακά τους βάρη. Από τις οικογένειες αυτές η οικογένεια των μικρών Hsps (sHsps), με μοριακά βάρη12-43 kDa, χαρακτηρίζονται από την παρουσία μιας πολύ συντηρημένης επικράτειας της α-κρυσταλλίνης στο καρβoξυτελικό τους άκρο. Μία από τις πιο καλά μελετημένες sHsps είναι η Hsp27. Η Hsp27, εκτός από το κύριο ρόλο της ως μοριακού συνοδού, εμπλέκεται και σε άλλες κυτταρικές λειτουργίες όπως η διαφοροποίηση, η απόπτωση, ο σχηματισμός του κυτταροσκελετού και η ρύθμιση της οξειδωτικής ισορροπίας των κυττάρων. Από τα αποτελέσματα της παρούσας εργασίας φάνηκε ότι το γονίδιο Cchsp27 εκφράζεται κάτω από φυσιολογικές συνθήκες κατά την ανάπτυξη της μεσογειακής μύγας και ότι η έκφραση του ρυθμίζεται στα διάφορα αναπτυξιακά στάδια του εντόμου. Πειράματα στον εγκέφαλο, στις ωοθήκες και στους όρχεις ενηλίκων ατόμων έδειξαν ότι στον εγκέφαλο των αρσενικών ατόμων το Cchsp27 mRNA παρουσιάζει σημαντικά υψηλότερα επίπεδα έκφρασης συγκριτικά με τον εγκέφαλο των θηλυκών ατόμων. Ακόμη παρατηρήθηκαν υψηλότερα επίπεδα έκφρασης του Cchsp27 mRNA στους όρχεις από ότι στις ωοθήκες. Τα αποτελέσματα από την έκφραση του γονιδίου στους σιελογόνους αδένες προνυμφών έδειξαν υψηλά επίπεδα έκφρασης στους σιελογόνους αδένες 24 ώρες πριν την εκτίναξη των προνυμφών, ενώ σταδιακά η έκφραση μειώνεται μέχρι το στάδιο της εκτινασσόμενης προνύμφης. Η έκφραση του Cchsp27 mRNA αυξάνεται στο στάδιο του λευκού προβομβυκίου ενώ στη συνέχεια σταδιακά μειώνεται. Ύστερα από την καλλιέργεια σιελογόνων αδένων παρουσία εκδυσόνης φάνηκε ότι συμβαίνει καταστολή της έκφρασης γονιδίου σε υψηλές συγκέντρωσης της ορμόνης, ενώ παρατηρείται επαγωγή σε συγκέντρωση 10-6 M. Σε ότι αφορά στην καλλιέργεια ωοθηκών και όρχεων παρουσία εκδυσόνης, παρατηρήθηκε μέγιστη επαγωγή του Cchsp27 γονιδίου στις ωοθήκες στα νεοεκκολαπτόμενα θηλυκά, ενώ μέγιστη επαγωγή στους όρχεις παρατηρήθηκε στα αρσενικά άτομα δύο ημερών. Ακολούθως, δημιουργήθηκε ένα διαγονιδιακό στέλεχος που φέρει το υβριδικό γονίδιο hsp27-GFP υπό τον έλεγχο της ευρύτερης 5΄ περιοχής του hsp27 γονιδίου, με σκοπό την μελλοντική μελέτη της κυτταρικής και ενδοκυτταρικής κατανομής της πρωτεΐνης Hsp27 κατά την ανάπτυξη της μεσογειακής μύγας. Τέλος, μελετήθηκε η έκφραση των γονιδίων Cchsp27 και Cchsp23 σε συνθήκες ψυχρού στρες. Και τα δύο γονίδια έδειξαν σημαντική έκφραση αυξανόμενου χρόνου επώασης στους 0 οC, με το Cchsp27 να παρουσιάζει υψηλότερα επίπεδα έκφρασης σε σχέση με το Cchsp23. / The stress response in cells is connected with the induction of heat shock proteins (Hsps). The Hsps are part of the molecular chaperons system and their role is to protect the cells from the protein denaturation and aggregation. Most Hsps are produced under non-stress conditions and they play a significant role in the correct folding, transmission and degradation of the cell’s proteins. Hsps are being divided into families according to their molecular mass. One of these families is the small heat shock proteins (sHsps) with molecular mass 12-43 kDa. This family is being characterized with a highly conservative domain called α-crystallin, which is located in the C-terminal domain. One of the most well studied sHsp is Hsp27. Hsp27 has an important role as molecular chaperone but also it is implicated in other events such differentiation, apoptosis, cytoskeleton’s formation and the regulation of the oxidized balance of the cell. The results that had arisen from this project, have shown that the Cchsp27 gene is expressed under non-stress conditions during the medfly’s development and that its expression is being regulated during the insect’s developmental stages. Experiments that were performed in brain, ovaries and testes which were removed from individual adults, have shown that the Cchsp27 gene is expressed highly in the male brain and in testes, comparing with female brain and ovaries respectively. Experiments that were performed in larvae salivary glands have shown significant expression levels of the Cchsp27 gene, 24 hours before jumping stage. The expression levels of the Cchsp27 gene are being reduced until the jumping stage and then they increased in the white pupa stage. The expression levels of the Cchsp27 gene are being reduced for the next three stages. The salivary glands were incubated with the hormone ecdysone and the results from these cultures have shown that in high ecdysone concentrations there is a repression in the gene’s expression whereas in concentration of 10-6 M there has been an induction. Ovaries and testes were incubated also with ecdysone and the results indicate that the maximum Cchsp27 gene induction happens in ovaries that have been removed from newborn females, and in testes that have been removed from males of the age of two days. Also, part of this project was the construction of a transgenic strain that it carries the hybrid gene hsp27-GFP under the regulation of the 5΄upstream region of the hsp27 gene. This strain will be used in the future for the study of the cellular distribution of the Hsp27 protein during the medfly’s development. For the last part of this project we study the expression levels of Cchsp27 and Cchsp23 genes under cold shock conditions. Both genes are expressed and their expression levels are being raised as the time of incubation increases in 0 οC. The expression levels of Cchsp27 gene were higher in comparison with the expression levels of Cchsp23 gene.

Τo Gene Expression Programming - GEP (Προγραμματισμός Γονιδιακής Έκφρασης - ΠΓΕ) είναι μια μέθοδος αυτόματης παραγωγής προγραμμάτων η οποία ανήκει στη γενική κατηγορία των Εξελικτικών Αλγορίθμων, εκείνων των τεχνικών δηλαδή που εμπνέονται από τις φυσικές διεργασίες της βιολογικής εξέλιξης. Συγκεκριμένα ο ΠΓΕ χρησιμοποιεί πληθυσμούς από άτομα, επιλέγει τα άτομα σύμφωνα με την καταλληλότητά τους (fitness) και εισάγει νέα σημεία (άτομα, πιθανές λύσεις) στον πληθυσμό χρησιμοποιώντας έναν ή περισσότερους γενετικούς τελεστές. Στόχος αυτής της Μεταπτυχιακής Διπλωματικής Εργασίας ήταν ο σχεδιασμός και η υλοποίηση ενός Ολοκληρωμένου Γραφικού Περιβάλλοντος για τον Προγραμματισμό Γονιδιακής Έκφρασης καθώς και η υλοποίηση ορισμένων καινοτομιών. Στα πλαίσια της διπλωματικής εργασίας, σχεδιάσθηκε και αναπτύχθηκε ένας καινοτόμος τελεστής για την μέθοδο του ΠΓΕ. Ο συγκεκριμένος τελεστής πραγματοποιεί μια τοπική αναζήτηση στις μεταβλητές που χρησιμοποιούνται στη μοντελοποίηση του εκάστοτε προβλήματος και επιλέγει εκείνες τις μεταβλητές για τις οποίες η απόδοση του αλγορίθμου βελτιστοποιείται. Η απόδοση του καινούργιου τελεστή ελέγχθηκε και πειραματικά. Μια επιπλέον καινοτομία που εφαρμόστηκε είναι η αυξομείωση του αριθμού των μεταλλάξεων. Συγκεκριμένα, επιλέγουμε να μειώνουμε τον αριθμό των μεταλλάξεων καθώς ο πληθυσμός εξελίσσεται, ενώ τον αυξάνουμε όταν έχουμε μικρή διαφορά ανάμεσα στη βέλτιστη και τη μέση απόδοση του πληθυσμού. Ο μεταβλητός αριθμός μεταλλάξεων σε συνδυασμό με την ικανότητα της μεθοδολογίας του ΠΓΕ να αποφεύγει τα τοπικά ακρότατα βελτιώνει σημαντικά την προσαρμοστικότητα του αλγορίθμου. Επιπλέον, για την αντιμετώπιση της αυξημένης υπολογιστικής πολυπλοκότητας που παρουσιάζει η μέθοδος, εισήχθη η έννοια του παραλληλισμού. Τέλος, η τροποποιημένη μέθοδος του ΠΓΕ εφαρμόστηκε σε πληθώρα προβλημάτων όπως η μοντελοποίηση συμπεριφοράς μιας χρονοσειράς μαγνητοεγκεφαλογραφήματος, η μοντελοποίηση της συμπεριφοράς κόπωσης υλικών, η πρόβλεψη ισοτιμίας δολαρίου – ευρώ, η πρόβλεψη πρωτεϊνικών αλληλεπιδράσεων και η πρόβλεψη του βαθμού υδατοκορεσμού ελαιοκαλλιεργειών. Τα αποτελέσματα που προέκυψαν είναι ιδιαίτερα ενθαρρυντικά. / Gene Expression Programming (GEP) is one method of automatic generation of programs that belongs to a wider class of Evolutionary Algorithms. Evolutionary Algorithms are inspired by biological mechanisms of evolution. Specifically, GEP uses populations of individuals, select the individuals according to their fitness, and introduce genetic variation using one or more genetic operators. The purpose of this Master's Thesis was to design and implement an Integrated Graphical Environment for Gene Expression Programming and the implementation of certain innovations. Ιn the context of this thesis an innovative operator was designed and developed for the GEP method. This particular operator is conducting a local search on the variables used in modeling of a problem and chooses those variables for which the performance of the algorithm is optimized. The performance of the new operator was experimentally tested. Another innovation implemented was the fluctuation in the number of mutations. Specifically, we choose to reduce the number of mutations as the population evolves, while we increase it when the performance of the best individual found is very close to the average performance of the population. The variable number of mutations in combination with the ability of the methodology of GEP to avoid local extrema significantly improves the adaptability of the algorithm. Moreover, in order to face the increased computational complexity of the method, we introduce parallelism. Finally, the modified method of GEP was applied to many problems such as modeling behavior of a MEG’s time series, modeling of fatigue behavior of materials, forecasting Euro - United States Dollar exchange rate, predicting protein interactions and predicting the degree of saturation of olive crops. The results are very encouraging.

The advent of efficient genome sequencing tools and high-throughput experimental biotechnology has lead to an enormous progress in life sciences. Among the most important innovations is the microarray technology. It allows to quantify the expression of thousands of genes simultaneously by measuring the hybridization from a tissue of interest to probes on a small glass or plastic slide. Before launching into microarray research it is important to recall that the characteristics of this data include a fair amount of noise and an atypical dimensionality (which makes difficult the use of classic statistics tools – experimental samples in the order of dozens and measured parameters in thousands or tens of thousands). Therefore, the main goal of this thesis is the development of adequate computational methods and algorithms, capable of extracting valuable biological knowledge from this type of data. Applications of microarray technology as a tool for gene expression analysis range from the assignment of functional categories for genes of unknown biological function (based on the analysis of genes with already established biological role), to precise and early diagnosis of different tumor malignancies. However, the main goal of computational analysis of gene expression data is the extraction of regulatory knowledge at genetic level that may be used to provide a broader understanding on the functioning of complex cellular systems. In this direction, revealing the structures of regulatory networks based of gene expression data becomes a pivotal task. The thesis contributes with a framework for the discovery of biological functional category of genes based on the synergy of ICA and a dynamic SOM-based clustering algorithm, that accurately finds groups of co-regulated genes, while identifying interesting regulatory signals within the data with the help of ICA decomposition. We also pursue the task of molecular characterization of different tumor types using gene expression profiling, by providing a novel method for tissue samples classification, based on an ensemble of classifiers sequentially trained on reweighted versions of the data. The algorithm, known as boosting, is adapted to peculiarities of gene expression data and employed in conjunction with SVMs. Additionally, the novel concept of finding predictive genes whose signatures are significant for phenotype discrimination is treated. Finally, the thesis presents a method developed for reverse-engineering gene regulatory networks based on recurrent neuro-fuzzy networks, which exploits the advantages of fuzzy-based models, in terms of results interpretability, and those of neural systems, in terms of computational power and time series prediction capabilities. / H έλευση ικανών υπολογιστικών εργαλείων για την μελέτη της γενομικής ακολουθίας και της ερευνητικής βιοτεχνολογίας υψηλής ανάλυσης, οδήγησε σε μια τεράστια πρόοδο στις επιστήμες ζωής. Μεταξύ των πιο σημαντικών καινοτομιών είναι η τεχνολογία μικροσυστοιχιών. H τεχνολογία αυτή επιτρέπει την ποσοτικοποίηση της έκφρασης χιλιάδων γονιδίων ταυτόχρονα, μετρώντας τον υβριδισμό από έναν ιστό ενδιαφέροντος έως σε δείγματα σε μικρό γυαλί η σε πλαστικά τσιπ. Πριν ξεκινήσουμε την έρευνα πάνω στις μικροσυστοιχίες είναι σημαντικό να θυμόμαστε ότι τα χαρακτηριστικά των δεδομένων αυτής περιλαμβάνουν αρκετό ποσό θορύβου και ένα μη τυπικό αριθμό διαστάσεων (το οποίο καθιστά δύσκολη την χρήση κλασσικών στατιστικών μεθόδων – μέγεθος δείγματος σε δωδεκάδες και μέγεθος χαρακτηριστικών σε χιλιάδες η δεκάδες η εκατοντάδες). Επομένως, ο κύριος στόχος αυτής της διδακτορικής εργασίας είναι η ανάπτυξη ικανών υπολογιστικών μεθόδων και αλγόριθμων έτσι ώστε να εξάγουν πολύτιμη βιολογική γνώση από τον συγκεκριμένο τύπο δεδομένων. Εφαρμογές της τεχνολογίας μικροσυστοιχιών σαν ένα εργαλείο για την ανάλυση έκφρασης γονιδίων ξεκινούν από την εύρεση και απόδοση λειτουργικών κατηγοριών για γονίδια άγνωστης βιολογικής λειτουργικότητας (βασισμένη στην ανάλυση των γονιδίων ήδη εδραιωμένου βιολογικού ρόλου) έως την ακριβή και πρώιμη διάγνωση διαφορετικών κακοήθων όγκων. Όμως ο κύριος στόχος της υπολογιστικής ανάλυσης της έκφρασης γονιδίων είναι η εξαγωγή ρυθμιζόμενης γνώσης στο γενετικό επίπεδο το οποίο μπορεί να χρησιμοποιηθεί ώστε να παρέχει μία ευρύτερη κατανόηση της λειτουργίας πολύπλοκων κυτταρικών συστημάτων. Σε αυτή την κατεύθυνση, το να αναδεικνύεις τις δομές ρυθμιστικών δικτύων βασισμένων στην έκφραση γονιδίων γίνεται καίριο έργο. Η διδακτορική διατριβή συνεισφέρει στο πλαίσιο για την ανακάλυψη βιολογικά λειτουργικών κατηγοριών γονιδίων βασισμένη στην συνεργία της ΙCA και της δυναμικού βασισμένου στη SOM ομαδοποίηση αλγορίθμου η οποία με ακρίβεια βρίσκει ομάδες γονιδίων που συν-ρυθμίζονται ενώ παράλληλα αναγνωρίζει ενδιαφέροντα ρυθμιστικά σήματα μέσα στα δεδομένα με τη βοήθεια της ΙCA αποδόμησης. Eπίσης, προσανατολιζόμαστε στην εύρεση του μοριακού χαρακτηρισμού διαφορετικών τύπων όγκων χρησιμοποιώντας το προφίλ της γονιδιακής έκφρασης, βασισμένο σε ένα σύνολο κατηγοριοποιητών οι οποίοι εκπαιδεύτηκαν σειριακά σε επανασταθμισμένες παραλλαγές των δεδομένων. Ο αλγόριθμος, γνωστός και σαν boosting, έχει προσαρμοστεί στις ιδιαιτερότητες των δεδομένων έκφρασης γονιδίου και εφαρμόζεται σε συνδυασμό με τα SVMs. Επιπλέον, εξετάζεται η πρωτοποριακή τεχνική της εύρεσης προβλέψιμων τιμών των οποίων οι υπογραφές είναι σημαντικές για τον χαρακτηρισμό φαινότυπου. Τελικά, η παρούσα διδακτορική διατριβή παρουσιάζει μια μέθοδο που αναπτύχθηκε για αντίστροφα μηχανικά ελεγχόμενα από γονίδια νευρωνικά δίκτυα βασισμένα σε αναδρομικά νευρωνικά δίκτυα τύπου fuzzy, τα οποία αξιοποιούν τα πλεονεκτήματα των μοντέλων τύπου fuzzy σε βάση επεξηγηματικότητας αποτελεσμάτων, και αυτών των νευρωνικών δικτύων σε βάση υπολογιστικής δύναμης και ικανότητας πρόβλεψης χρονοσειρών.

Σκοπός της παρούσας ερευνητικής εργασίας ήταν η επιδημιολογική μελέτη των σταφυλοκοκκικών λοιμώξεων και κυρίως των λοιμώξεων από MRSA, τόσο στο ενδονοσοκομειακό περιβάλλον, όσο και στην κοινότητα, το διάστημα 2001-2006. Κατά τη διάρκεια της μελέτης, συλλέχθηκαν συνολικά 1922 στελέχη Staphylococcus aureus από όλες τις κλινικές και από διαφορετικούς ασθενείς στο Πανεπιστημιακό Γενικό Νοσοκομείο Πατρών (ΠΓΝΠ). Στη συνέχεια τα στελέχη ελέγχθηκαν για την παραγωγή της πρωτεΐνης PBP2α και την ύπαρξη του γονιδίου mecA για τον προσδιορισμό των ανθεκτικών στη methicillin στελεχών S. aureus (Methicillin-Resistant S. aureus, MRSA). Από το σύνολο των 1922 S. aureus, τα 757 (39.4%) χαρακτηρίσθηκαν ως MRSA. Γενικά, παρατηρήθηκε αύξηση του αριθμού των λοιμώξεων από S. aureus, με παράλληλη αύξηση του ποσοστού των MRSA λοιμώξεων, από 23% το 2001 στο 49% το 2006. Οι MRSA αποτελούν σοβαρό πρόβλημα για τα νοσοκομεία, αλλά και γενικότερα σε όλο το πληθυσμό, καθώς απομονώνονται με αυξανόμενη συχνότητα από την κοινότητα. Στο διάστημα που καλύπτει η παρούσα μελέτη, 2001-2006, το ποσοστό των στελεχών που απομονώθηκαν από την κοινότητα (Community-acquired MRSA, CA-MRSA) αυξήθηκε από 3% το 2001, σε 37% το 2006, ενώ εκείνο των ενδονοσοκομειακών στελεχών (Hospital-acquired MRSA, HA-MRSA), είναι ενθαρρυντικό ότι μειώθηκε από 20% το 2001, στο 12% το 2006. Για την επιδημιολογική μελέτη των λοιμώξεων που οφείλονται σε MRSA στελέχη, μέθοδος αναφοράς είναι η PFGE, κυρίως σε συνδυασμό και με υβριδισμό του χρωμοσωμικού DNA με ειδικούς ανιχνευτές. Oι μέθοδοι αυτές παρουσιάζουν δυσκολία στη σύγκριση των κλώνων μεταξύ των χωρών και έτσι αναπτύχθηκε η MLST, που βασίζεται στη εύρεση της νουκλεοτιδικής αλληλουχίας επτά συντηρημένων γονιδίων και επιτρέπει τον προσδιορισμό των κλωνικών συμπλεγμάτων (Clonal Complex, CC) με δυνατότητα άμεσης ταυτοποίησής τους. Τα MRSA που απομονώθηκαν κατατάχθηκαν σε επτά ST/SCCmec κλώνους, τους ST80/IV, ST5/IV, ST377/V, ST30/IVvar, ST239/III, ST225/NT και ST217/NT και πέντε κλωνικά συμπλέγματα (Πίνακας 46). Στα CA-MRSA επικρατεί ο ST80/IV, με μικρό ποσοστό να ανήκει και στον πρόσφατο τύπο ST377/V, ενώ στα HA-MRSA απαντώνται κυρίως οι ST239/III και ST30/IVvar. Η PVL είναι μια τοξίνη που καταστρέφει τα λευκοκύτταρα ανοίγοντας πόρους στην κυτταρική τους μεμβράνη, προκαλεί νέκρωση ιστών και νεκρωτική πνευμονία, κυρίως σε μικρά παιδιά, και κωδικοποιείται από τα γονίδια lukS-PV και lukF-PV. Το 74% των MRSA που μελετήθηκαν το διάστημα 2001-2006, έφεραν τα γονίδια αυτά, καταγράφοντας αύξηση από 33% το 2001, σε 88% το 2006. Τα PVL-θετικά MRSA ανήκουν στους κλώνους ST80/IV και ST377/V. Τα περισσότερα PVL-θετικά CA-MRSA της μελέτης μας απομονώθηκαν από λοιμώξεις δέρματος και μαλακών μορίων, ενώ τα PVL-θετικά HA-MRSA προέρχονταν από χειρουργικά τραύματα, κυρίως σε περιπτώσεις χρήσης προσθετικών υλικών. Ένα PVL-θετικό στέλεχος, που απομονώθηκε από αιματοκαλλιέργεια, προερχόταν από οστεομυελίτιδα. Πρόκειται για πρώτη αναφορά περιστατικών οξείας οστεομυελίτιδας, με αίτιο στελέχη CA-MRSA και MSSA που παράγουν PVL. Φαίνεται ότι η παρουσία των γονιδίων lukS-PV και lukF-PV συνδέεται κυρίως με λοιμώξεις που προκύπτουν δευτερογενώς σε τραύματα και επιπολής λοιμώξεις δέρματος και μαλακών μορίων, ενώ η απομόνωση PVL-θετικού στελέχους από οστεομυελίτιδα αποτελεί ένδειξη για την εμπλοκή της τοξίνης αυτής και στη παθογένεια εν τω βάθει λοιμώξεων. Εκτός από την PVL, σημαντικοί λοιμογόνοι παράγοντες και αίτια σοβαρών κλινικών συνδρόμων στον άνθρωπο θεωρούνται και οι τοξίνες της οικογένειας των υπεραντιγόνων, όπως η τοξίνη του συνδρόμου τοξικής καταπληξίας (TSST-1) και οι εντεροτοξίνες (SEs). Το γονίδιο tst κωδικοποιεί την παραγωγή της TSST-1, ενώ το οπερόνιο egc (enterotoxin gene cluster) την έκφραση πρωτεϊνών που μοιάζουν στη δομή και αλληλουχία με τις εντεροτοξίνες. Στα MRSA της συλλογής μας, τα γονίδια tst και egc2 ανιχνεύθηκαν μόνο στον κλώνο ST30/IV και δε βρέθηκαν ποτέ να συνυπάρχουν με τα γονίδια της PVL. Ανιχνεύθηκαν και συνδυασμοί των γονιδίων tst και του οπερονίου egc στους κλώνους ST80/IV και ST239/III, που σημαίνει ότι τα γονίδια αυτά διασπείρονται με οριζόντια μεταφορά, ενώ τα γονίδια lukS-PV και lukF-PV, που εντοπίστηκαν αποκλειστικά στους κλώνους ST80/IV ST377/V και χωρίς να συνυπάρχουν με γονίδια υπεραντιγόνων, φαίνεται ότι μεταφέρονται πιο ειδικά. Προϊόν της παρούσας ερευνητικής εργασίας ήταν η ανάπτυξη μεθοδολογίας για την ποσοτικοποίηση με αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης πραγματικού χρόνου, του γονιδίου tst σε στελέχη S. aureus που ήταν ανθεκτικά στη methicillin, κατατάσσονταν σε διαφορετικούς κλώνους και έφεραν ποικίλα γονίδια τοξινών. Για τη σήμανση και παρακολούθηση των προϊόντων χρησιμοποιήθηκε το SYBR Green I (SG), που είναι μη ειδικός τρόπος σήμανσης. Η χρήση του SYBR Green I κάνει τη μέθοδο εύχρηστη, αφού μπορεί η χρωστική να προστεθεί απλά στο υπόλοιπο μίγμα της αντίδρασης και φθηνή, επειδή δε χρειάζεται να σχεδιαστούν καινούριοι, ειδικοί εκκινητές. Οι αντιδράσεις απόλυτης ποσοτικοποίησης, που πραγματοποιήθηκαν με τη συγκεκριμένη μέθοδο, είχαν υψηλή απόδοση (2.04) και τα αποτελέσματα ήταν συνεχή και επαναλαμβανόμενα, γεγονός που σημαίνει ότι μπορεί να εφαρμοσθεί στη ρουτίνα του κλινικού εργαστηρίου για τη γρήγορη ανίχνευση και ποσοτικοποίηση του γονιδίου tst στα κλινικά στελέχη. Επί πλέον αποδείχθηκε με τη στατιστική ανάλυση, ότι στελέχη που απομονώθηκαν από λοιμώξεις μαλακών μορίων συνέθεταν υψηλότερα ποσά tst. Για τον υπολογισμό των λόγων έκφρασης του γονιδίου tst, στη σχετική ποσοτικοποίηση εφαρμόσθηκαν δυο μαθηματικά μοντέλα (2-ΔΔCt και Pfaffl). Συγκρίνοντας τα αποτελέσματα από τους δυο διαφορετικούς τρόπους υπολογισμού, βρέθηκαν διαφορές στα επίπεδα έκφρασης ίδιων στελεχών και καταλήξαμε στο συμπέρασμα ότι το μαθηματικό μοντέλο του Pfaffl είναι πιο ακριβές και αξιόπιστο, καθώς συνυπολογίζει την απόδοση της αντίδρασης. / The purpose of this study was to establish the clonality and evolution of CA-MRSA (Community-acquired MRSA, CA-MRSA) and HA-MRSA (Hospital-acquired MRSA, HA-MRSA), as well as the epidemiology of MRSA (Methicillin-Resistant S. aureus, MRSA) infections, during 2001-2006. In total 1922 Staphylococcus aureus strains were collected from patients with different pathologies admitted at the University Hospital of Patras. Among them 757 (39.4%) strains were MRSA. The prevalence of MRSA infections rose from 23% in 2001 to 49% in 2006. MRSA is a major problem worldwide in the nosocomial setting and the community. During 2001-2006 CA-MRSA isolated with an increasing rate from 3% in 2001 to 37% in 2006, while HA-MRSA decreased from 20% in 2001 to 12% in 2006. The epidemiological study of MRSA infections was based on PFGE, the “gold standard” of typing methods and hybridization with specific DNA probes. However, for the full characterization of a strain it is recommended the application of the multilocus sequence typing (MLST), since it is a highly discriminatory method and permits to compare the results from different laboratories. MLST represents a major advance since it relates organisms on the basis of the nucleotide sequences of ~450 bp internal fragments of seven conserved housekeeping genes resulting to the determination of Sequence Types (ST) and Clonal Complexes (CC). MRSA of our collection belonged to seven ST/SCCmec clones (ST80/IV, ST5/IV, ST377/V, ST30/IVvar, ST239/III, ST225/NT and ST217/NT) and five Clonal Complexes. Most CA-MRSA isolates belonged to ST80/IV clone and a small percentage to the newly described clone, ST377/V, while HA-MRSA strains were mainly characterized as ST239/III and ST30/IVvar clones. PVL is a bicomponent toxin associated with skin and soft tissue infections, but also with necrotizing pneumonia, especially in children. In total 74% of MRSA were positive for the PVL genes rising from 33% in 2001 to 88% in 2006. PVL-positive MRSA strains belonged to ST80/IV and ST377/V clones. Most PVL-positive CA-MRSA isolated from skin and soft tissue infections, while PVL-positive HA-MRSA isolated from surgical wounds, especially when prosthetic devices were used. In one patient acute staphylococcal osteomyelitis (AO) was diagnosed, due to MRSA carrying the PVL genes. This is the first description of CA-MRSA producing PVL as causative agents of AO suggesting that PVL-positive S. aureus can be isolated from patients with invasive musculo-skeletal infections, including acute childhood osteomyelitis, as well as among patient with skin and soft-tissue infections. Staphylococcal enterotoxins, enterotoxin-like superantigens (enterotoxin gene operon, egc) and the toxic shock syndrome toxin-1 that belong to the pyrogenic toxin superantigens (PTSAgs) are considered major virulence factors. The genotype tst/egc belonged only to ST30/IV clone and never coexisted with the PVL genes. Other combinations of genes were also detected belonging to clones ST80/IV and ST239/III, suggesting the horizontal transfer of those genes. On the contrary, the PVL genes were detected only in ST80/IV and ST377/V clones, meaning a more specific way of spread. A real-time PCR assay was developed for the quantification of tst gene in methicillin-resistant S. aureus using SYBR Green I (SG) chemistry, which is an easy and cost-effective approach to real-time, since it does not require the design of sequence specific probes and new primers. By the developed method of absolute quantification the results were reproducible and constant, meaning that the assay can be applied in the routine laboratory. The statistically significant difference of tst gene expression among strains associated with SSTIs, suggests that such strains may be the cause of TSS among patients. For the calculation of expression ratios in the relative quantification we applied two mathematical models (2-ΔΔCt and Pfaffl). Comparing ratios derived from the two mathematical methods we found variations, allowing us to suggest the use of the Pfaffl model as the more precise and reliable method.

Σε αυτή τη διπλωματική εργασία, με τη χρήση ενός δείγματος που αποτελούνταν από 4458 καυκάσια άτομα, για τα οποία ήταν γνωστά: - ο Δείκτης Μάζας Σώματος (ΔΜΣ), - το φύλο, - η ηλικία, και - τα γενετικά χαρακτηριστικά 23 γονιδίων τους (δηλ. τα αλληλόμορφα γονίδια), διερευνήθηκε: - η ύπαρξη κύριων (μεμονωμένων) επιδράσεων αυτών των παραγόντων (φύλο, ηλικία, αλληλόμορφα γονίδια) στον ΔΜΣ, και - ο αντίκτυπος των αλληλεπιδράσεων μεταξύ έως και τριών παραγόντων στον ΔΜΣ. Μετά από την απαραίτητη προ-επεξεργασία των δεδομένων (αναζήτηση διπλών καταχωρήσεων και διαγραφή τους, κωδικοποίηση, εξαγωγή περιγραφικών στατιστικών στοιχείων, κ.λπ.) εκτελέστηκαν παραμετρικοί και μη παραμετρικοί στατιστικοί έλεγχοι με τη χρήση των 26 συνολικά διαθέσιμων μεταβλητών. Οι στατιστικές μέθοδοι που χρησιμοποιήθηκαν ήταν οι ακόλουθες (σε παρένθεση δίνονται κάποια συνοπτικά χαρακτηριστικά των μεταβλητών που ελέγχονταν κατά περίπτωση): - γραμμική συσχέτιση του Pearson (μεταξύ του ΔΜΣ και της Ηλικίας, καθώς και μεταξύ του ΔΜΣ και του Φύλου), - ανάλυση της διακύμανσης (ANOVA) (με χρήση του ΔΜΣ ως ποσοτική συνεχής μεταβλητή και των υπόλοιπων μεταβλητών σε κατηγορική μορφή), - μέθοδος x2 (chi-square): o με χρήση του ΔΜΣ σε κατηγορική μορφή 4 κατηγοριών (λιποβαρείς, κανονικού σωματικού βάρους, υπέρβαροι, παχύσαρκοι) και των υπόλοιπων μεταβλητών σε κατηγορική μορφή, και o με χρήση του ΔΜΣ σε κατηγορική μορφή 2 κατηγοριών [κανονικού βάρους (ενσωματώνει τις κατηγορίες λιποβαρών ατόμων και ατόμων κανονικού βάρους), μη κανονικού βάρους (ενσωματώνει τις κατηγορίες υπέρβαρων και παχύσαρκων ατόμων)] και των υπόλοιπων μεταβλητών σε κατηγορική μορφή, - μέθοδος μείωσης πολυπαραγοντικής διάστασης (MDR - Multifactor Dimensionality Reduction) με χρήση του ΔΜΣ σε κατηγορική μορφή 2 κατηγοριών [κανονικού βάρους (ενσωματώνει τις κατηγορίες λιποβαρών ατόμων και ατόμων κανονικού βάρους), μη κανονικού βάρους (ενσωματώνει τις κατηγορίες υπέρβαρων και παχύσαρκων ατόμων)] και των υπόλοιπων μεταβλητών σε κατηγορική μορφή. / In this thesis, using a sample that consisted of 4458 Caucasian men, for which we had the following available: - Body Mass Index (BMI) - Sex, - Age, and - The genetic characteristics of 23 genes (ie alleles) we examined: - The existence of major (individual) effects of these factors (gender, age, alleles) in BMI, and - The impact of interactions between up to three factors in BMI. After the necessary pre-processing of data (search for duplicate entries and deletion, coding, extraction of descriptive statistics, etc.) we performed parametric and non parametric statistical tests using the total of 26 available variables. The statistical methods used were as follows (in brackets are some brief features of the controlled variables as appropriate): - Linear correlation of Pearson (between BMI and age, and between BMI and sex) - Analysis of variance (ANOVA) (using BMI as a quantitative continuous variable and other variables in categorical form) - Chi-square test: o Using the BMI, in categorical form of four categories (underweight, normal weight, overweight, obese) and other variables in categorical form, and o Using the BMI, in categorical form of two categories [normal weight (incorporates underweight and normal weight), non-normal weight (incorporates overweight and obese)] and other variables in categorical form - Multifactor Dimensionality Reduction (MDR), using the BMI in categorical form of two categories [normal weight (incorporates underweight and normal weight), non-normal weight (incorporates overweight and obese)] and other variables in categorical form.

Η ντοπαμινεργική νεύρωση είναι πολύ σημαντική για τις μακροχρόνιες αλλαγές της συναπτικής πλαστικότητας στον ιππόκαμπο και στον προμετωπιαίο φλοιό, καθώς και για την έκφραση των πρώιμων γονιδίων που σχετίζονται με τη μνήμη και τη μάθηση. Πολλές εργασίες έχουν δείξει ότι οι αλληλεπιδράσεις μεταξύ ντοπαμινεργικών και γλουταμινεργικών υποδοχέων είναι ιδιαίτερα σημαντικές για τις γνωστικές λειτουργίες του ιππόκαμπου και του προμετωπιαίου φλοιού. Προκειμένου να μελετήσουμε το μοριακό υπόβαθρο των αλληλεπιδράσεων μεταξύ των ντοπαμινεργικών και γλουταμινεργικών υποδοχέων στο ιππόκαμπο και τον προμετωπιαίο φλοιό του επίμυος, εξετάσαμε «in vitro» την επίδραση της ενεργοποίησης των D1 υποδοχέων ντοπαμίνης στο επίπεδο φωσφορυλίωσης των υπομονάδων των NMDA και AMPA υποδοχέων γλουταμινικού οξέος., καθώς στην φωσφορυλίωση/ ενεργοποίηση του σηματοδοτικού μονοπατιού της ERK1/2 κινάσης (Extracellular Regulated Kinase1/2) και της DARPP-32 (Dopamine-and cyclicAMP-Regulated PhosphoProtein-32). Επιπλέον, συγκρίναμε τις αλληλεπιδράσεις των D1/NMDA/AMPA υποδοχέων που παρατηρούνται στον ιππόκαμπο και στον προμετωπιαίο φλοιό με αυτές που εμφανίζονται στο ραβδωτό σώμα, στο οποίο η πυκνότητα των D1 υποδοχέων είναι η μέγιστη στον εγκέφαλο. Τα αποτελέσματά μας δείχνουν ότι η ενεργοποίηση των D1 υποδοχέων από τον ειδικό αγωνιστή τους SKF38393 (10 μΜ) στις τομές του ιππόκαμπου και του προμετωπιαίου φλοιού έχει ως αποτέλεσμα μια σημαντική αύξηση των επιπέδων φωσφορυλίωσης: α) της σερίνης-897 της NR1 υπομονάδας και της σερίνης-1303 της NR2B υπομονάδας του NMDA υποδοχέα, οι οποίες επάγουν τη διακίνηση των υποδοχέων στην μεμβρανική επιφάνεια (trafficking) και την ενίσχυση των ρευμάτων του ιοντικού διαύλου, αντίστοιχα, β) των σερινών-831 και -845 της GLUR1 υπομονάδας του AMPA υποδοχέα, οι οποίες ενισχύουν τα ρεύματα του ιοντικού διαύλου και αυξάνουν την πιθανότητα ανοίγματος του καναλιού, αντίστοιχα και γ) της ERK1/2 κινάσης, αλλά όχι της DARPP-32. Είναι ενδιαφέρον το γεγονός ότι η συνενεργοποίηση των D1 και NMDA υποδοχέων με ανενεργές δόσεις των ειδικών αγωνιστών τους SKF38393 (2 μΜ) και NMDA (5 μΜ), αντίστοιχα έχει ως αποτέλεσμα μια περαιτέρω αύξηση των επιπέδων φωσφορυλίωσης των υπομονάδων των NMDA και AMPA υποδοχέων, καθώς και της ERK1/2 κινάσης, αλλά όχι της DARPP-32. Οι παραπάνω επαγόμενες από την ενεργοποίηση των D1 υποδοχέων και την συνενεργοποίηση των D1/ NMDA υποδοχέων φωσφορυλιώσεις αναστέλλονται πλήρως από τον ειδικό αναστολέα της ενεργοποίησης της ERK1/2 κινάσης, SL327. Αντίθετα, στο ραβδωτό σώμα τα αποτελέσματα επιβεβαιώνουν ότι η επαγόμενη από τους D1 υποδοχείς φωσφορυλίωση των υπομονάδων των NMDA και AMPA υποδοχέων βασίζεται στο καλά περιγραμμένο σηματοδοτικό μονοπάτι D1/PKA/DARPP-32. Συμπερασματικά, τα «in vitro» πειράματα δείχνουν στον ιππόκαμπο και στον προμετωπιαίο φλοιό να υφίσταται ισχυρή συνεργιστική αλληλεπίδραση μεταξύ των D1 και των NMDA υποδοχέων, η οποία οδηγεί στην ενεργοποίηση του σηματοδοτικού μονοπατιού της ΕΡΚ1/2 κινάσης. Επιπλέον, η επαγόμενη από την διέγερση των D1 υποδοχέων και από τη συνδιέγερση των D1/ NMDA υποδοχέων φωσφορυλίωση των υπομονάδων των NMDA και AMΡΑ υποδοχέων φαίνεται να οφείλεται στο σηματοδοτικό μονοπάτι της ERK1/2 κινάσης και πιθανώς αποτελεί το μοριακό υπόβαθρο της ενίσχυσης των ρευμάτων των NMDA και AMPA υποδοχέων από την ενεργοποίηση των D1 υποδοχέων. Προκειμένου να διερευνήσουμε εάν αυτή η συνεργιστική αλληλεπίδραση των D1/ NMDA υποδοχέων υφίσταται και «in vivo» και να εξετάσουμε περαιτέρω τη λειτουργική της σημασία, επιλέξαμε ένα φυσικό συμπεριφορικό τεστ, την εισαγωγή των πειραματόζωων σε «πρωτόγνωρο» περιβάλλον (ελεύθερη εξερεύνηση του χώρου). Η δοκιμασία αυτή είναι γνωστό ότι επάγει την αύξηση των επιπέδων ντοπαμίνης στον ιππόκαμπο και τον προμετωπιαίο φλοιό και κατ’επέκταση επάγει την ενεργοποίηση των D1 υποδοχέων. Τα αποτελέσματα μας δείχνουν ότι η εισαγωγή των επίμυων στο «καινούργιο» περιβάλλον επάγει στον ιππόκαμπο και στον προμετωπιαίο φλοιό: α) μια σημαντική αύξηση των επιπέδων φωσφορυλίωσης των υπομονάδων των NMDA και ΑΜPA υποδοχέων, καθώς και ισχυρή φωσφορυλίωση/ ενεργοποίηση του σηματοδοτικού μονοπατιού της ERK1/2 κινάσης. Τα φαινόμενα αυτά όπως δείξαμε μετά τη χορήγηση ειδικών ανταγωνιστών εξαρτώνται από τη σύγχρονη ενεργοποίηση των D1/ NMDA υποδοχέων και οφείλονται στο «νέο» ερέθισματα, δεδομένου ότι δεν εμφανίζονται μετά από δοκιμασία «εξοικείωσης» των επίμυων στο «καινούργιο» περιβάλλον, β) επιγεννετικές τροποποιήσεις (φωσφορυλίωση/ ακετυλίωση της ιστόνης Η3) και γ) αύξηση των πρωτεϊνικών επιπέδων έκφρασης των πρώιμων γονιδίων cFos και zif268 επιλεκτικά στη CA1 περιοχή του ιπποκάμπου, φαινόμενα τα οποία εξαρτώνται από την συνενεργοποίηση των D1/ NMDA υποδοχέων, καθώς και των μουσκαρινικών υποδοχέων ακετυλοχολίνης. Συμπερασματικά τα αποτελέσματα μας δείχνουν ότι: α) η φωσφορυλίωση των υπομονάδων των NMDA και AMPA υποδοχέων πιθανώς δρα ως «δείκτης του πρωτόγνωρου ερεθίσματος», δεδομένου ότι δεν εμφανίζονται μετά την «εξοικείωση» των επίμυων στο «καινούργιο» περιβάλλον, β) η ισχυρή ενεργοποίηση του σηματοδοτικού μονοπατιού της ERK1/2 κινάσης που επάγεται από το «νέο» ερέθισμα απαιτεί τη συνεργιστική αλληλεπίδραση των D1/ NMDA υποδοχέων και γ) η ενεργοποίηση του μονοπατιού μεταγωγής σήματος της ERK1/2 κινάσης οδηγεί σε επιγεννετικές αλλαγές και αύξηση της έκφρασης των πρώιμων γονιδίων cFos και zif268, φαινόμενα τα οποία απαιτούνται στη ρύθμιση της συναπτικής πλαστικότητας, καθώς και στις διαδικασίες της μνήμης και της μάθησης. / Dopaminergic innervation is critical for long term changes in synaptic efficacy in hippocampus and prefrontal cortex (PFC), as well as for learning-associated immediate-early gene expression. Many studies have demonstrated that the interactions between dopamine and glutamate receptors are essential for the prefrontal cortical (PFC) and hippocampal cognitive functions. In order to understand the molecular basis of dopamine/glutamate interactions in rat PFC and hippocampus, we investigated the effect of “in vitro” dopamine D1 receptor stimulation on glutamate NMDA and AMPA receptor subunits’ phosphorylation, as well as on ERK1/2 (Extracellular Regulated Kinase1/2) and DARPP-32 (Dopamine-and cyclicAMP-Regulated PhosphoProtein-32) phosphorylation/activation. Furthermore, we compared the D1/NMDA/AMPA receptor interactions seen in PFC and hippocampus with those appearing in striatum, in which the D1 receptors’ density is the highest within the mammalian brain. Our results showed that stimulation of D1 receptor by the specific agonist SKF38393 (10μM) in PFC and hippocampal slices significantly increased the phosphorylation state of: a) NR1ser897 and NR2Bser1303 subunits of NMDA receptor, which promotes the trafficking and enhances the ionic currents, respectively, b) of GLUR1(ser831 and ser845) subunit of AMPA receptor, which enhances the receptor currents and the open probability of the receptor channel and c) of ERK1/2, but not of DARPP-32. Interestingly, co-stimulation of D1 and NMDA receptors with an ineffective dose of SKF38393(2μM) and NMDA(5μM) respectively, elevated further the phosphorylation level of NMDA and AMPA receptor subunits, as well as of ERK1/2, but not of DARPP-32. The D1- and D1/NMDA-induced phosphorylations were totally inhibited by SL327 (specific ERK1/2 inhibitor). Conversely, in striatal slices our data confirm that the D1-mediated phosphorylation of NMDA and AMPA receptor subunits relies on D1/PKA/DARPP-32 signalling. In conclusion, in PFC and hippocampus: a) a strong synergistic interaction of D1 and NMDA receptors exists, which results in a significant ERK1/2 pathway activation, b) The D1 and the D1/NMDA receptor induced phosphorylation of NMDA and AMPA receptor subunits seems to rely on ERK1/2 signalling and could to some extend underlie the enhancement of NMDA and AMPA receptor currents mediated by D1 receptor activation. In order to investigate whether this synergistic interaction occurs also “in vivo” and to further examine its functional significance, we exposed the rats to a novel environment (open field exploration), which is known to evoke dopamine release in hippocampus and PFC. Our results showed that the “spatial” novelty stimulus induced in rat hippocampus and PFC: a) a significant increase in phosphorylation of NMDA and AMPA receptor subunits, as well as a robust phosphorylation/activation of ERK1/2 signalling, which are both dependent on the concomitant stimulation of D1/NMDA receptors and are both abolished by habituation, b) chromatin remodeling events (phosphorylation-acetylation of histone H3) and c) an increase in the immediate early genes cFos and zif268 expression in the CA1 region of hippocampus, which is dependent on the coactivation of D1/NMDA and muscarinic acetylcholine receptors. Our results indicate that: a) the phosphorylation of NMDA and AMPA receptor subunits could act as a ‘novelty detector’, since it is absent after habituation, b) the robust activation of ERK1/2 signalling elicited by “spatial” novelty, demands the synergistic interaction of D1/NMDA receptors and c) the activation of ERK1/2 pathway leads to chromatin remodeling events and expression of the immediate early genes cFos and zif268, which are required for the regulation of synaptic plasticity and memory consolidation.