Μελετήθηκαν επιδηµιολογικές, κλινικές, βιοχηµικές, ιολογικές και ανοσολογικές παράµετροι σε ασθενείς αιµοκαθαιρόµενους για χρόνια νεφρική ανεπάρκεια µε HCV λοίµωξη και συγκρίθηκαν µε τις αντίστοιχες παραµέτρους HCV µολυνθέντων ασθενών µε φυσιολογική νεφρική λειτουργία. 1) Η µελέτη µας έδειξε ότι οι αιµοκαθαιρόµενοι ασθενείς µε HCV λοίµωξη είχαν σηµαντικά µικρότερες τιµές αµινοτρανσφερασών από αυτούς που είχαν φυσιολογική νεφρική λειτουργία. Από αυτό συµπεραίνεται ότι στους αιµοκαθαιρόµενους, για να εκτιµηθούν οι αµινοτρανσφεράσες σαν βιοχηµικοί δείκτες της ηπατίτιδας C θα πρέπει να διορθώνονται όσον αφορά την υποαµινοτρανσφερασαιµία των αιµοδιυλιζοµένων. 2) Οι αιµοδιυλιζόµενοι είχαν χαµηλότερο ιικό φορτίο από τους ασθενείς µε φυσιολογική νεφρική λειτουργία, σε αντίθεση µε άλλους ανοσοκατεσταλµένους ασθενείς που παρουσιάζουν υψηλότερο ιικό φορτίο από τους ανοσοϊκανούς µε HCV λοίµωξη. Με το χαµηλότερο ιικό φορτίο πιθανώς συσχετίζεται ο µικρότερος βαθµός νεκροφλεγµονώδους δραστηριότητας που ανευρέθη στην βιοψία του ήπατος αυτών των ασθενών. 3) Η συχνότητα κρυοσφαιριναιµίας των αιµοκαθαιροµένων ασθενών δεν διέφερε από αυτών µε φυσιολογική νεφρική λειτουργία, αλλά οι αιµοκαθαιρόµενοι παρουσίαζαν µικρότερες τιµές κρυοκρίτη και κανείς εξ αυτών δεν εµφάνισε κλινικό σύνδροµο κρυοσφαιριναιµίας. Επίσης η συχνότητα ανευρέσεως θετικού ρευµατοειδούς παράγοντος ήταν µικρότερη ενώ τα επίπεδα του C4 κλάσµατος του συµπληρώµατος ήταν υψηλότερα στους αιµοκαθαιρόµενους ασθενείς. Αυτά τα ευρήµατα υποδηλώνουν σχετική ανεπάρκεια του µηχανισµού δηµιουργίας αυτοαντισωµάτων και ανοσοσυµπλεγµάτων στους αιµοκαθαιρόµενους ασθενείς. 4) Οι αιµοδιυλιζόµενοι ασθενείς µε HCV λοίµωξη παρουσίαζαν ξηρά κερατοεπιπεφυκίτιδα σε παρόµοιο ποσοστό µε τους HCV ασθενείς µε φυσιολογική νεφρική λειτουργία, αλλά η ανοσολογική αντίδραση των δακρυικών αδένων έναντι του ιού της ηπατίτιδας C ήταν µάλλον µικρότερη. Η ξηρά κερατοεπιπεφυκίτιδα στους ασθενείς µε HCV λοίµωξη έδειξε να συνδυάζεται µε µεγάλη ηλικία και µεγαλύτερο στάδιο ηπατικής ίνωσης. 5) Τέλος, οι αιµοκαθαιρόµενοι ασθενείς ανευρέθησαν να έχουν µικρότερο βαθµό νεκροφλεγµονώδους δραστηριότητας και ίνωσης από τους ασθενείς µε φυσιολογική νεφρική λειτουργία και πιθανώς µάλιστα ηπιώτερη νόσο όσον αφορά όλες τις παραµέτρους αυτής. / We studied epidemiological, clinical, biochemical, virological and immunological characteristics of HCV infected patients on chronic hemodialysis for end stage renal failure and we compared them to those of otherwise normal patients with chronic HCV infection. 1) Our study showed that the mean values of aminotransferases were significantly lower in hemodialysis patients compared to patients with normal renal function. Our data suggest that in patients undergoing hemodialysis aminotransferases levels should be interpreted, for evaluation of hepatitis C activity, after correction for hypoaminotransferasemia of the hemodialysis population. 2) HCV viral load was found significantly lower in patients on maintenance hemodialysis than in the group with normal renal function. This contrasts with the high HCV viral load that is usually found in other immunocompromised patients. The lower grading of necroinflammatory activity, which was found in liver biopsy samples of hemodialysis patients, is possibly related to the lower viral load in these patients. 3) Prevalence of cryoglobulinemia in HCV-infected hemodialysis patients was not different from that of patients with normal renal function, but hemodialysis patients had lower cryocrit values and none of them presented a cryoglobulinemic syndrome. Rheumatoid factor positivity rate was also lower in hemodialysis group, while complement C4 levels were higher in these patients. These findings denote less efficient mechanism of creating autoantibodies and immune complexes in this population. 4) Patients on hemodialysis infected with HCV have a similar percentage of keratoconjunctivitis sicca with normal renal function HCV patients. Nevertheless hepatitis C virus appears to incite lower immunologic response to lacrimal glands in uremic as opposed to otherwise normal patients. Keratoconjunctivitis sicca in patients with chronic HCV infection was associated with older age and higher staging score of fibrosis in liver biopsy. 5) Finally, hemodialysis patients were found to have lower grading and staging score than those with normal renal function and possibly less severe disease from every aspect.

Η ηπατική εγκεφαλοπάθεια είναι ένα σύνθετο νευροψυχιατρικό σύνδρομο το οποίο εκδηλώνεται κυρίως σε συνθήκες ηπατικής κίρρωσης. Διάφορες παθολογικές και τοξικές καταστάσεις μπορεί να επηρεάσουν την ηπατική λειτουργία σε τέτοια βαθμό ώστε να προκληθεί ηπατική εγκεφαλοπάθεια. Το οξειδωτικό στρές έχει ενεπλακεί σε διάφορες μελέτες στην παθογένεση της ηπατικής εγκεφαλοπάθειας. Επιπλέον, η ανάπτυξη αυξημένου οξειδωτικού στρές υπό την επίδραση αποφρακτικού ικτέρου έχει μετρηθεί σε διάφορα όργανα πειραματοζώων, συμπεριλαμβανομένου και του εγκεφάλου. Ο σκοπός της παρούσας μελέτης ήταν να ανιχνεύσει της αλλαγές στις αποφρακτικές συνδέσεις των τριχοειδικών αγγείων του εγκεφάλου που συσχετίζονται με την οκκλουδίνη. Για να το επιτύχουμε αυτό χρησιμοποιήσαμε ένα μοντέλο απολίνωσης του κοινού χοληδόχου πόρου (BDL) σε πειραματόζωα (αρουραίους). Στο πείραμα 1 η έκφραση της οκκλουδίνης εκτιμήθηκε μέσω της μεθόδου ποσοτικοποίησης κατά Westernblot. Σε αυτό το πείραμα χρησιμοποιήθηκαν πέντε (BDL) και πέντε ψευδώς χειρουργηθέντα πειραματόζωα (sham). Τα πειραματόζωα θανατώθηκαν δέκα ημέρες μετα το χειρουργείο. Στην κατά Westernblot ποσοτικοποίηση παρατηρήθηκε μεγάλη μείωση της ποσότητας της οκκλουδίνης στα BDL πειραματόζωα σε σχέση με τα sham. Στο πείραμα 2 χρησιμοποιήθηκαν εννέα BDL και εννέα sham πειραματόζωα. Τρία πειραματόζωα από τις δύο παραπάνω ομάδες θανατώθηκαν την πρώτη, την πέμπτη και τη δέκατη μετεγχειρητική ημέρα. Τα επίπεδα οκκουδίνης σε αυτά τα πειραματόζωα συσχετιστήκαν με τις τιμές τηςinvivo μέτρησης των ελευθέρων ριζών οξυγόνο. Τα αποτελέσματα ανέδειξαν ότι η τιμή της οκκλουδίνης στα BDL ζώα ήταν σημαντικά μειωμένη σε σχέση με τα sham όλες τις χρονικές στιγμές που έγιναν οι μετρήσεις, ενώ οι χαμηλότερες τιμές καταγράφηκαν στα πειραματόζωα που παρέμειναν υπό αποφρακτικό ίκτερο για δέκα ημέρες. Επιπλέον καταδείχθη ότι η χρονικά συσχετιζόμενη μείωση των επιπέδων της οκκλουδίνης στα ενδοθηλιακά κύτταρα του εγκεφάλου συσχετίζεται με τα αυξανόμενα επίπεδα ελευθέρων ριζών οξυγόνου της ημέρες μετά το χειρουργείο, φανερώνοντας τη σχέση μεταξύ αυτών των δύο φαινομένων. Συμπερασματικά, η παρούσα μελέτη πρώτη παραθέτει στοιχεία που προτείνουν την εμπλοκή της οκκλουδίνης στην παθοφυσιολογία της ηπατικής εγκεφαλοπάθειας σε συνθήκες εξωηπατικής χολόστασης. Αυτό γίνεται μέσω της μείωσης των επιπέδων τις οκκλουδίνης στις αποφρακτικές συνδέσεις των ενδοθηλιακών κυττάρων του εγκεφάλου υπο την επίδραση του χολοστατικού ικτέρου, η οποία οδηγεί σε άρση του αιματο-εγκεφαλικού φραγμού. / Hepatic encephalopathy in a complicate neuro-psychiatric syndrome which is common under hepatic cirrhosis. Various pathological and toxic lesions can deteriorate liver function in such way, so hepatic encephalopathy can be inflicted. Oxidative stress is involved in pathogenesis of hepatic encephalopathy in several protocols. Moreover the development of increased oxidative stress in the context of obstructive cholestasis has been proven in various rats' organs including the brain. The present study aimed to detect alterations of tight junction-associated occludin in rat brain capillaries. To accomplish that we have used a rats bile duct ligation experimental model (BDL). In experiment 1, occludin expression was evaluated by Western blot analysis. In this experiment were used five BDL and five sham rats. The experimental animals were sacrificed ten days after the operation. Western blot analysis revealed significant decrease of occlidins amount in BDL rats compared to the sham rats. In experiment 2, nine BDL and nine sham animals were used. Three animals from each group were sacrificed during the first, fifth and tenth post-operate day. The results of occludin level to these animals were associated with the in vivo superoxide radical production. The results indicated that occludin level in BDL animals, as opposed to sham-operated, was significantly reduced at every time point studied, being lowest in the rats remaining on BDL condition for 10 days. Moreover, it was demonstrated that the time-dependent reduction of occludin level in the brain endothelial was significantly correlated with the time dependent increase of brain superoxide radical level, implying a relationship between these two abnormalities. In conclusion, the evidence presented herein suggests for first time the implication of occludin in pathophysiology of hepatic encephalopathy under extra-hepatic cholestasis. This phenomenon occur due to the reduce of occludin level to cerebral endothelial cells’ tight junctions under cholestatic jaundice, which drives to lift of brain-blood barrier.

ΣΚΟΠΟΣ: Σήμερα είναι πλέον γνωστό ότι το χολοστατικό ήπαρ είναι πιο ευαίσθητο στην ισχαιμία από το φυσιολογικό ήπαρ. Η ηπατική αναγέννηση μετά μερική ηπατεκτομή (ΡΗχ) ρυθμίζεται από διάφορους παράγοντες οι οποίοι ενεργοποιούν ή αναστέλλουν τον πολλαπλασιασμό των ηπατοκυττάρων. Ένα από τα κυτταρικά στοιχεία που συμβάλλει στην αναγέννηση του ήπατος είναι το ηπατοκύτταρο με χολαγγειακή μορφολογία (DΗ). Από την άλλη μεριά, η απόπτωση φαίνεται να παίζει ένα σημαντικό ρόλο στον κυτταρικό πολλαπλασιασμό και στην ηπατική αναγέννηση. Στην παρούσα μελέτη, μετά από Ρηχ σε φυσιολογικούς ποντικούς και σε άλλους με ίκτερο, με ή χωρίς επιπλέον ισχαιμία, ερευνήσαμε: α) τα ιστοπαθολογικά χαρακτηριστικά της ισχαιμικής ηπατικής βλάβης και αναγέννησης, β) το δυνητικό ρόλο των ηπατοκυττάρων με χολαγγειακή μορφολογία κατά τη διάρκεια της ηπατικής αναγέννησης και γ)την έκφραση των γονιδίων bcl-2 και bax, τα οποία σχετίζονται με την απόπτωση, καθώς και την παρουσία της απόπτωσης. ΥΛΙΚΑ ΚΑΙ ΜΕΘΟΔΟΙ: Η μελέτη συμπεριέλαβε 140 ποντικούς Wistar οι οποίοι χωρίστηκαν σε 14 ομάδες: Ι –control, II - εγχείρηση sham. III-IV-V-παροδικός αγγειακός αποκλεισμός ηπατικής αρτηρίας και πυλαίας φλέβας (ολική ηπατική ισχαιμία) (TLI) για 15-30-60 λεπτά αντίστοιχα. VI - απολίνωση του κοινού χοληδόχου πόρου (BDL) για 10 ημέρες, VII-VIII-ΙΧ-BDL-ΤLI-ΡΗχ. Χ-μερική ηπατεκτομή (ΡΗχ 68%}, XI- ΡΗχ + TLI (30 min), XII-BDL+ΡΗχ, XIII-BDL+ ΡΗχ+TLI (30 min) και XIV- BDL+TLI (30 min) + ΡΗχ. Τα ζώα θυσιάστηκαν 24 και 48 ώρες μετά από Ρηχ, με εξαίρεση τις περιπτώσεις όπου η κατάσταση υγείας ήταν κρίσιμη. Η μελέτη του ηπατικού ιστού περιελάμβανε: (α) Η&Α stain, (β) υβριδισμό in situ (ανίχνευση mRΝΑ των bcl-2 και bax σε παραφίνη, (γ) ανάλυση Western Blot για τη μελέτη των πρυτεϊνικών επιπέδων των bcl-2 και bax, (δ) in situ υβριδισμός (TUNEL) για την ανίχνευση παραγόντων απόπτωσης, (ε) ανοσοϊστοχημικά stains σε παραφίνη (μέθοδος στρεπταβιδίνης-βιοτίνης) με σκοπό να μελετηθεί η έκφραση των ακόλουθων αντιγόνων: κυτοκερατίνη 7 και 19 (χολικός φαινότυπος), ηπατοκυτταρίκή και α1-σντιθρυψίνη (ηπατοκυτταρικός φαινότυπος), βιμεντίνη, CD34, α-φετοπρωτείνη, GST-π(γλουταθειονιν-S-τρανσφεράση-π). Κι67 (κυτταρικός πολλαπλασιασμός), bcl-2 και bax (γονίδια απόπτωσης). ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ: Ήπαρ από ποντικούς α)με TLI ανέπτυξε βλάβες ηπατικής ισχαιμίας, β)με BDL βλάβες ηπατικής απόφραξης, γ)με BDL+TLI ανέπτυξαν βλάβες ηπατικής ισχαιμίας μαζί με αλλαγές λόγω απόφραξης των χοληφόρων. Το ποσοστό του επηρεασμένου ηπατικού παρεγχύματος (%ηπατικής νέκρωσης) ήταν υψηλότερο στις ομάδες με TLI+BDL. Σε αυτές τις ομάδες, ο ηπατοκυτταρικός δείκτης (δείκτης πολλαπλασιασμού) του Κi67 ήταν μικρότερος από τον αντίστοιχο της ομάδας χωρίς TLI. Το εύρημα αυτό υποδηλώνει ότι το χολοστστικό ήπαρ είναι πιο ευαίσθητο στην ισχαιμία κι εκδηλώνει μειωμένη αναγεννητική ικανότητα, συγκρινόμενο με μη χολοστατικό ήπαρ. Βιοψίες ήπατος έδειξαν χαρακτήρες ηπατικής αναγέννησης προερχόμενης από τη ζώνη 2, η οποία επεκτεινόταν στη ζώνη 1 και κάποιες φορές στη ζώνη 3. Ανοσοϊστοχημικές αναλύσεις ανέδειξαν κύτταρα θετικά στο ΑΕ1 και κύτταρα θετικά στο ΗΕΡΡΑΡ. Σε όλες τις ομάδες με TLI τα ηπατοκύτταρα χολαγγειακής μορφολογίας εμφανίζονταν κυρίως σε περιοχές περι-πυλαίες. Εξέφραζαν κυτοκερατίνες 19 και 7, ηπατοκυτταρίκή και α1-αντιθρυψίνη ενώ εμφάνιζαν και συνδυασμένη έκφραση CΚ7/CΚ19 και ηπατοκυτταρική ή ΑΕ1/CΚ19 και α1-αντιθρυψϊνη. Το ποσοστό των κυττάρων αυτών ήταν ευθέως ανάλογο με το χρόνο επιβίωσης των ζώων (r=0,354, ρ<0,05). Όσον αφορά την απόπτωση, προ ηπατεκτομής, τα επίπεδα του bcl-2 ( πρωτεΐνη ή mRΝΑ) ήταν υψηλότερα σε ποντικούς με ίκτερο απ' ό,τι στους ποντικούς controls. Επιπλέον τα επίπεδα του bax (πρωτεΐνη ή mRΝΑ) και ο σωματικός δείκτης απόπτωσης (ΑΒΙ) ήταν υψηλότερα σε χολοστατικό ήπαρ. Μετά ηπατεκτομή, παρατηρήθηκε πρώιμη ελάττωση των επιπέδων πρωτεϊνών και mRΝΑ του γονιδίου bcl-2 και μια ύστερη αύξηση του προ-αποπτωτικού γονιδίου bax και του ΑΒΙ, σε σύγκριση με τα controls. ΣΥΜΠΕΡΑΣΜΑΤΑ: Σε περιπτώσεις αποφρακτικού ίκτερου (χολαγγειοπάθεια), η ηπατική ισχαιμία καθιστά το όργανο πιο ευαίσθητο σε ενδεχόμενη βλάβη, καθώς προκαλεί ευρύτερη νέκρωση παρεγχύματος και ελαττώνει το ρυθμό πολλαπλασιασμού των ηπατοκυττάρων, Η διεργασία αναγέννησης του ήπατος επιτελείται κυρίως μέσω του πολλαπλασιασμού μη νεκρωτικών κυττάρων τα οποία εκφράζουν ηπατοκυτταρικά ή χολαγγειακά επιθηλιακά χαρακτηριστικά. Σε τέτοιες περιπτώσεις, το κύριο στοιχείο της ηπατικής αναγέννησης αποτελεί η παρουσία των ηπατοκυττάρων με χολαγγειακή μορφολογία (κύτταρα που εκδηλώνουν φαινότυπο ενδιάμεσο μεταξύ κυττάρων χολαγγειακής και ηπατικής προέλευσης) και η διαφοροποίηση τους σε ώριμα ηπατοκύτταρα. Τέλος, η απόπτωση έχει ρόλο στο χολοστατικό ήπαρ με ή χωρίς επιπλέον ισχαιμία και πιστεύεται ότι μπορεί να συμβάλλει στην παρουσία κατεσταλμένης αναγεννητικής απόκρισης που παρατηρήθηκε σε ήπαρ ποντικών με ίκτερο μετά από μερική ηπατεκτομή. / AIM: Today, it is known that cholestatic liver is more susceptible to ischemia than normal liver. Liver regeneration after partial hepatectomy (PHx) is regulated by several factors that activate or inhibit hepatocyte proliferation. One of the cellular elements that contributes to liver regeneration is ductular hepatocyte (DH). On the other hand, apoptosis seems to play an important role in cellular proliferation and liver regeneration. In this study and. after PHx. in normal and jaundiced rats with or without superimposed ischemia, we assessed a) the histopathologic features of hepatic Ischemic damage and liver regeneration, b) the potential role of ductular hepatocytes during liver regeneration and c) the expression apoptosis-asscciated genes bcl-2 and bax. and the presence of apoptosis, MATERIALS £ METHODS: The study comprised 140 male Wistar rats, assigned randomly in 14-groups: l-controls. ll-sham. Ill-IV-V-cIamping of hepatic artery and portal vein (total liver Ischemia-TLI) for 15-30-60 min respectively. Vl-common bile duct ligation (BDL) for lOdays. VII-VIII-IX-BDL-TLI-X-partial hepatectomy(PHx-68%). XI-PHx+TLI(30min). XU-BDL+PHx. XIII-BDL+PHx+TLI(30min) and XIV-BDL+TLI (30min)+PHx. Animals were sacrificed 24 and 48hrs after PHx unless their condition was critical. Liver tissue evaluation Included: (a) H&E stain, (b) in situ hybridization (detection of bcl-2 and bax mRNA) in paraffin sections, (c) Western blot analysis for the evaluation of bcl-2 and bax protein levels, (d) in situ hybridization (TUNEL) for the detection of apoptotic bodies, and (e) immunohistochemical stains (streptavidin-biotin method) in paraffin sections, in order to evaluate the expression of the following antigens: cytokeratins 7 and 16 (biliary phenotype), Hepatocyte and a 1-antitrypsin (hepatocytic phenotype), vimentin, CD34, alpha-fetoprotein, GST-pi (glutahione-S-trarsferase-pi), Ki67 cell proliferation), bcl-2 and bax (apoptotlc genes). RESULTS: Sections from rats a) with TLI developed changes of liver ischemia, b) with BDL changes of liver obstruction and c) with BDL+TLI developed changes of ischemia together with changes of biliary obstruction. The total liver parenchymal area affected (% liver necrosis} was higher in groups with TLI+BDL. In these groups the Ki67 hepatocytic index (proliferation index) was lower compared to the groups without TLI. This finding implies that cholestatic livers are more vulnerable to ischemia and also display impaired generative capabilities, compared to non-cholestatic ones. Liver biopsies exhibited features of liver regeneration that originated from zone 2, extended to zone 1 and occasionally to zone 3. Immunonistochemical stains revealed cells positive to AE1 and cells positive to HEPPAR. In all groups with TLI, DHs appeared mainly in periportal areas. They expressed cytokeratirs-19 and 7. hepatocyte and al-antrtrypsm and co-expressed CK7/CK1S and Hepatocyte or AE1/CK1S and a 1-antitrypsin The percentage of DHs was directly correlated with the time that animals survived (r=0,354, p<0,05). Regarding apoptosis, before hepatectomy, bcl-2 (protein or mRNA} levels were higher in jaundiced rats vs controls. Furthermore, bax (protein or mRNA) levels and apoptotic body index (ABl) were higher in cholestatic livers. After hepatectomy, there was an early decease in the protein and mRNA levels of antiapoptotic gene bcl-2 and a late increase of proapoptotic gene bax and the A8I. compared to controls. CONCLUSIONS: In cases with obstructive jaundice (cholangiopathy), liver ischemia makes the organ more vulnerable to damage because it causes greater parenchymal necrosis and decreases the degree of hepatocyles proliferation. Liver regenerative process is mediated mainly by proliferation of non-necrotic cells that express hepatocellular or ductular epithelial features. In such cases a main element of liver regeneration is the presence of DHs, cells that display a phenotype intermediate between ductular and hepatocytic origin} and their differentiation to mature hepatocytes. Finally, apoptosis takes place in cholestatic livers with or without superimposed ischemia and may contribute in the impaired regenerative response observed in livers of jaundiced rats after partial hepatectomy.