Η χ-κωνοτοξίνη MrIA, που απομονώθηκε από το δηλητήριο του θαλάσσιου σαλιγκαριού-κώνου Conus Marmoreus, είναι ένα 13-αμινοξέων πεπτίδιο (Asn1-Gly2-Val3-Cys4-Cys5-Gly6-Tyr7-Lys8–Leu9-Cys10-His11-HyP12-Cys13-OH) με δύο δισουλφιδικούς δεσμούς μοτίβου Cys1-Cys4 και Cys2-Cys3. Η κωνοτοξίνη αυτή στοχεύει εκλεκτικά τον μεταφορέα την νορεπινεφρίνης (ΝΕΤ) και αποτελεί πιθανό φάρμακο ως αναλγητικό. Η φαρμακοφόρος ομάδα αποτελείται από τη γ-στροφή που σχηματίζεται από το βρόγχο μεταξύ των Cys στις θέσεις 5 και 10 και από τα ενδιάμεσα αμινοξέα αυτών. Το αμιδιωμένο C-τελικό παράγωγο στο οποίο έχει πραγματοποιηθεί αντικατάσταση της Asn1 με pGlu είναι σήμερα υποψήφιο φάρμακο κατά του νευροπαθητικού πόνου, με ονομασία Xen2174. Οι μελέτες που έχουν ασχοληθεί με τη Ν-τελική περιοχή του χ-MrIA έχουν δείξει πως η Val3, σε αντίθεση με τα δύο πρώτα αμινοξέα της αλληλουχίας, (Asn1, Gly2), παίζει σημαντικό δομικό ρόλο. Σκοπός της διατριβής αυτής είναι η σύγκριση συνθετικών μεθόδων παραλαβής του φυσικού πεπτιδίου χ-MrIA-ΝΗ2 καθώς και ο σχεδιασμός και η σύνθεση αναλόγων του με τροποποιήσεις στην Ν-τελική αλληλουχία. Επίσης συντέθηκε ένα ανάλογο με Ala στη θέση 6 και ένα ανάλογο στο οποίο οι Cys4 και Cys13 έχουν αντικατασταθεί από Glu4 και Lys13 αντίστοιχα Η σύνθεση των αναλόγων πραγματοποιήθηκε με την Fmoc/tBu μεθοδολογία επί στερεάς φάσεως, χρησιμοποιώντας ως στερεό υπόστρωμα την Sieber Amide ρητίνη ή την Rink Amide MBHA ρητίνη. Σαν αντιδραστήρια σύζευξης χρησιμοποιήθηκαν α) DIC/HOBt, β) TBTU/DIEA/HOBt, γ) ΗBTU/DIEA/HOBt, δ) HATU/DIEA. Η δημιουργία των δισουλφιδικών δεσμών έγινε σε δύο στάδια με οξείδωση με DMSO ή / και με οξείδωση με I2/AcOH Τα πειραματικά αποτελέσματα έδειξαν πως καλύτερες αποδόσεις και καθαρότερα προϊόντα επιτυγχάνονται όταν η επιμήκυνση της πεπτιδικής αλυσίδας γίνεται σε υπόστρωμα Sieber Amide, οι συζεύξεις των αμινοξέων με τη χρήση ουρονικών παραγώγων και η οξείδωση με τη μέθοδο I2/AcOH. Η δομή επιλεκτικών αναλόγων μελετήθηκε με πειράματα πυρηνικού μαγνητικού συντονισμού (NMR). / The χ-conopeptide MrIA isolated from the venom of the cone snail Conus Marmoreus, is a 13-residue peptide with two disulfide bonds forming pairs Cys1-Cys4 and Cys2-Cys3. This conotoxin targets selectively the norepinephrine transporter (NET) and is a potent analgesic. The pharmacophore group consists of an inverse γ-turn formed by the first loop Cys2-Cys3 and the residues located between them. The amidated C-terminal derivative bearing the replacement of Asn1 by pGlu led to the potent drug against neuropathetic pain, Xen2174. However, not much is known about the N-terminal region of χ-MrIA. Studies have shown that Val3 has an important structural role, as opposed to the first two amino acids of the peptide sequence. The aim of this research is the design and synthesis of analogs of χ-MrIA-NH2 with substitutions at residues Asn1, Gly2, Val3, Gly6 as well as Cys4 and Cys13 of the peptide sequence and the comparison of these synthetic methods. These analogues were synthesized by solid peptide synthesis, using the Fmoc/tBu methodology. Sieber Amide resin and Rink Amide MBHA resin were used as solid support and a) DIC/HOBt, b) TBTU/DIEA/HOBt, c) TBTU/DIEA/HOBt, d) HATU/DIEA as coupling reagents. The formation of disulfide bonds was achieved in two steps by oxidation with DMSO and / or oxidation by iodine. We concluded that the preferred method for this peptide synthesis is Sieber Amide as solid support and uronic derivatives as coupling reagents, while for the formation of disulfide bonds, the oxidation with iodine. Some of these analogs are studied by NMR spectroscopy for structure determination.

Οι Κωνοτοξίνες είναι μικρά πεπτίδια πλούσια σε δισουλφιδικούς δεσμούς, τα οποία προέρχονται από τα δηλητήρια των θαλάσσιων σαλιγκαριών. Οι κωνοτοξίνες αυτές στοχεύουν διαφορετικούς υποδοχείς στο νευρικό σύστημα με υψηλή εκλεκτικότητα και ισχύ, αποτελώντας χρήσιμους φαρμακευτικούς δείκτες ή και φάρμακα. Μια ομάδα κωνοτοξινών είναι οι μ-κωνοτοξίνες, οι οποίες έχουν παρουσιάσει αναλγητική δράση. Οι μ-κωνοτοξίνες έχουν συγκεκριμένα δομικά χαρακτηριστικά πολύ σημαντικά για την βιολογική τους δραστικότητα. Περιέχουν τρείς δισουλφιδικούς δεσμούς μεταξύ των Cys1-Cys4, Cys2-Cys5 και Cys3-Cys6, σχηματίζοντας τρείς θηλιές (loop) στον σκελετό του πεπτιδίου. Οι μ-κωνοτοξίνες ερευνήθηκαν σαν πιθανά φαρμακευτικά εργαλεία εξαιτίας της ικανότητας τους να αναστέλλουν διαφορετικούς νευρικούς υποτύπους διαύλων Νατρίου και συνεπώς να στοχεύουν όχι μόνο κατά του χρόνιου πόνου αλλά και κατά άλλων ασθενειών. Στόχος της παρούσας διατριβής είναι η σύνθεση νέων μ-κωνοπεπτιδίων με πιθανή αναλγητική δράση, τα οποία στοχεύουν κυρίως σε πρωτεΐνες –κανάλια ιόντων Νατρίου, προκαλώντας αναστολή της μετάδοσης σήματος στα νευρικά κύτταρα. Η σύνθεση των αναλόγων πραγματοποιήθηκε με την Fmoc/But μεθοδολογία επί στερεάς φάσεως, χρησιμοποιώντας ως στερεό υπόστρωμα την Sieber Amide ρητίνη. Ο σχηματισμός των τριών δισουλφιδικών γεφυρών επιτεύχθηκε σε ένα στάδιο στην υγρή φάση με την χρήση ρυθμιστικών αναγωγικών μέσων. Στην παρούσα φάση, τα συντιθέμενα πεπτίδια βρίσκονται σε στάδιο βιολογικής αξιολόγησης μέσω ηλεκτροφυσιολογικών ανταγωνιστικών πειραμάτων. / Conotoxins are small disulfide rich peptides derived from the venom of Conus snails. They target different receptors in the nervous system with high selectivity and potency making them valuable as drug leads or drug themselves. One group of conotoxins, μ-conotoxins have been shown to have potential as analgesic treatment. μ-conotoxins have concrete conformational features, which are very crucial to their biological activity. They contain three disulfide bonds among Cys1-Cys4, Cys2-Cys5 and Cys3-Cys6, forming three loops in their backbone. μ-conotoxins studied as potent pharmacological tools due to their ability to inhibit different neuronal subtypes of sodium channels and likewise conotoxins target not only the chronic pain treatment but also target against other disease’s treatment. The goal of this present thesis is to synthesize new μ-conopeptides, with a potent analgesic activity, which target mostly proteins-sodium channels, inhibiting the nerve impulse transmission at the neuromuscular injection. These analogues were synthesized using the Fmoc/But methodology by SPPS, using Sieber Amide resin as solid support. The formation of three disulfide bonds was accomplished in one step in the solution phase using the redox buffer strategy. At present, the synthesized cono-peptides are under biological evaluation through electrophysiological competitive experiments.

Η Σωματοστατίνη (SRIF) είναι μια ορμόνη του υποθαλάμου. Ραδιοεπισημασμένα ανάλογα της χρησιμοποιούνται στη σπινθηρογραφική απεικόνιση όγκων που υπερεκφράζουν υποδοχείς της (στοχευμένη διάγνωση). Μειονεκτήματα της στοχευμένης διάγνωσης είναι η υψηλή και παρατεταμένη εντόπιση της ακτινοβολίας στους νεφρούς και η πρόσληψη των ραδιοπεπτιδίων από όργανα μη στόχους. Στόχος της παρούσας διατριβής είναι η ανάπτυξη νέων αναλόγων της SRIF τα οποία να πληρούν τις απαραίτητες προϋποθέσεις ώστε να καταστούν νέα διαγνωστικά μέσα. Αναπτύχθηκαν 33 νέα συνθετικά παράγωγα της SRIF. Σε πρώτη φάση συνετέθησαν απλά ανάλογα της SRIF. Ακολούθησε αξιολόγηση και σε αυτά τα οποία παρουσίαζαν ικανοποιητική συμπεριφορά σε σχέση με την συγγένεια τους με τον υποδοχέα και την πολικότητα τους συζεύχθηκε τετρααμινικός υποκαταστάτης για σύμπλεξη ραδιομετάλλου. Συνετέθησαν επίσης διμερή ανάλογα της SRIF και γλυκοπεπτιδικά ανάλογα. Τα πεπτίδια συντέθηκαν εφαρμόζοντας τεχνικές της Fmoc/tBu μεθοδολογίας. Ο συνδυασμός των μεθόδων που εφαρμόστηκαν οδήγησε στη λήψη των επιθυμητών δομών σε υψηλές αποδόσεις και καθαρότητα. Από τα αποτελέσματα των μελετών ανταγωνιστικής δέσμευσης τα οποία έγιναν σε μεμβράνες κυττάρων AR4-2J, αποδείχτηκε ότι όλα τα ανάλογα διαθέτουν πολύ υψηλές τιμές IC50. Ικανοποιήθηκε επίσης η απαίτηση για αύξηση της πολικότητας τους. Τα νέα ανάλογα πληρούν καταρχήν τις απαραίτητες προϋποθέσεις ώστε να καταστούν υποψήφια νέα διαγνωστικά μέσα και να βρουν κλινική εφαρμογή. Αναμένεται τα τελικά ραδιοπεπτίδια να οδηγούν σε μειωμένη πρόσληψη της ακτινοβολίας από τα όργανα μη στόχους και να εμφανίζουν αυξημένη απέκκριση από τους νεφρούς. Από προκαταρτικά πειράματα βρέθηκε ότι τα πιο πάνω επετεύχθησαν. / Somatostatin is a hyrothalamic regulatory peptide hormone with a pan-antisecretory profile. A large variety of human tumors are expressing multple somatostatin receptors. Synthetic somatostatin analogues radiolabelled with a variety of metallic radionuclide’s are used for the diagnosis and staging of sstr positive tumors but there is the main problem of high accumulation of the radiopeptides on non target organs and the high renal uptake of the radioactivity which leads to nephrotoxicity. Aim of this study was the development of new SRIF analogues as candidate useful clinical tools for the diagnosis and staging of sstr positive tumors. There have been developed thirty three new SRIF analogues and a glycoaminoacid suitable for use in SPPS. First, new analogues of [Tyr3]Octreotate were developed and the best of them, these that satisfied the relation between polarity and binding affinity to the sstr2, were coupled with a tetraaminic chelator ligand for the future complexation of a radionuclide. In other approach peptide dimers were developed. New glycopeptides were also developed. All analogues were synthesized on the solid phase applying several techniques of Fmoc/tBu strategy in high yield and purity. The binding affinity of the new SRIF analogs was checked with experiments of competitive binding with membranic preparations of AR42J cells, positive on SRIF receptors. All the new analogues are able to bind the sstr2 with high affinities. The new analogues accomplish the pre-condition to become new and useful clinical tools after their radiolabelling in the field of peptide-receptor imaging. It is expected that the new molecules will be able to have increased renal excretion via the kidneys and low non target accumulation. From preliminary experiments was shown that the above were succeeded.

Τα πεπτίδια, είτε ως πρωτεϊνικά θραύσματα είτε ως φυσικές οντότητες, χαρακτηρίζονται από την ακολουθία τους και από τα λειτουργικά τους χαρακτηριστικά. Ο σκοπός αυτής της Διδακτορικής Διατριβής είναι η ανάπτυξη μιας μεθοδολογίας εξόρυξης δεδομένων για μοναδικά tags και πεπτιδικά/πρωτεϊνικά χαρακτηριστικά του ανθρώπινου πρωτεώματος καθώς επίσης η ανάλυση και η εφαρμογή αυτών των βιολογικών δεδομένων σε πρωτεϊνες που σχετίζονται με τον καρκίνο. Δημιουργήθηκε μια αποθήκη αρχείων η οποία περιέχει μοριακά βάρη με ακρίβεια 0.01 Da που συνδέονται με τις αντίστοιχες πεπτιδικές ακολουθίες ανθρώπινων πρωτεϊνών της Swiss-Prot βάσης. Αυτές οι πρωτεϊνες διασπάστηκαν εξαντλητικά παρέχοντας ανεξαρτησία στις πεπτιδικές ακολουθίες από άλλες μεθόδους που βασίζονται στην ενζυματική διάσπαση. Από αυτήν την αποθήκη δεδομένων, διαχωρίστηκαν τα μοριακά βάρη που είναι μοναδικά και φτάνουν μέχρι τα 10 kDa καθώς και οι μοναδικές πεπτιδικές ακολουθίες (μέχρι 10 kDa). Στα πλαίσια της αξιοποίησης των δεδομένων εξόρυξης για την ταυτοποίηση των πρωτεϊνών, αναπτύχθηκε μια ευρέως διαθέσιμη διαδικτυακή εφαρμογή όπου γίνεται η αντιστοίχιση των μοριακών βαρών υψηλής ανάλυσης με πεπτίδια και πρωτεϊνες. Μια ακόμη διαδικτυακή εφαρμογή αναπτύχθηκε για να προσφέρει την πληροφορία της μοναδικότητας των μοριακών βαρών και των πεπτιδικών ακολουθιών στο ανθρώπινο πρωτέωμα. Η εφαρμογή μπορεί να αναζητήσει μοναδικά πρωτεϊνικά θραύσματα που προκύπτουν από την εζυματική διάσπαση πρωτεϊνών και να προσφέρει την πληροφορία για όλα τα μοναδικά μοριακά βάρη και τις μοναδικές πεπτιδικές ακολουθίες που περιέχονται σε μια πρωτεϊνη. Πολλές φορές χρειάζεται η μαζική διαχείριση των πεπτιδίων από λίστες. Για το σκοπό αυτό, αναπτύχθηκε ένας web server ο οποίος διαχειρίζεται τις πεπτιδικές λίστες, αναλύοντας τα χαρακτηριστικά των πεπτιδίων και ομαδοποιώντας τα πεπτίδια σύμφωνα μα αυτά τα χαρακτηριστικά, ενώ οπτικοποιείται η ομαδοποίηση με την χρήση ενός java applet. Το PepServe είναι ένα χρήσιμο εργαλείο για την κατανόηση της κατανομής των πεπτιδικών χαρακτηριστικών για ένα σύνολο πεπτιδίων. Τέλος, αναλύθηκαν σύνολα πρωτεϊνών που σχετίζονται με διάφορες περιπτώσεις καρκίνων, για πεπτιδικά χαρακτηριστικά. Αυτή η ανάλυση έχει σκοπό την εύρεση πιθανών προτιμήσεων σε χαρακτηριστικά και την εύρεση μοναδικών tags των πρωτεϊνών που σχετίζονται με καρκίνους. Τα μοναδικά tags μπορούν να χρησιμοποιηθούν στην ανακάλυψη βιοδεικτών και την ανάπτυξη νεων φαρμάκων για την πιο αποτελεσματική διάγνωση και θεραπεία. / Peptides, either as protein fragments or as naturally occurring entities are characterized by their sequence and function features. The purpose of the present Ph.D. thesis is to develop a datamining method for unique tags and peptide/protein characteristics in the human proteome and to analyze and apply the derived biological data in cancer-related proteins. A file repository has been created, containing indexed information that relates molecular masses with an accuracy of 0.01 Da to the corresponding peptides existing in human proteins. These proteins have been deposited in a completely digested protein database (Swiss-Prot) providing independence from any specific enzyme/digestion method. From this repository, the unique molecular masses, ranging from 1 to 10 kDa, and the unique peptide sequences from all the possible sequence fragments (up to 10 kDa) have been mined. A publicly available web application has been developed which facilitates a high resolution mapping of measured molecular masses to peptides and proteins, irrespectively of the enzyme/digestion method used. Μulti-filtering may be applied in terms of measured mass tolerance, molecular mass and isoelectric point range as well as pattern matching to refine the results In addition, another publicly available web application has been developed that offers information concerning the uniqueness of molecular masses and peptide sequences in the human proteome. The application is able to search for unique protein fragments derived computationally from enzymatic digestion driven by certain enzymes. Furthermore, the application can list all the unique masses and peptides of a given protein. Through this application, researchers are able to find unique tags, either on a molecular mass level or on a sequence level. A web server has beed developed that manages peptide lists in terms of feature analysis as well as interactive clustering and visualization of the given peptides. PepServe is a useful tool towards understanding peptide feature distribution among a group of peptides. Finally, cancer-related proteins have been analyzed producing peptide features and peptide feature’s sequence uniqueness resulting in some feature preferences and peptide unique tags. These unique tags can be used in biomarker discovery, and novel drug development for an efficient diagnosis and treatment.