Η ΒΥΠ διαθέτει αντίτυπο της διατριβής σε έντυπη μορφή στο βιβλιοστάσιο διδακτορικών διατριβών που βρίσκεται στο ισόγειο του κτιρίου της. / Τα κακοήθη γλοιώματα συνιστούν τον πιο κοινό τύπο καρκίνου του κεντρικού νευρικού συστήματος στους ενήλικες και χαρακτηρίζονται από υψηλό βαθμό αγγειογένεσης και διήθησης στον παρακείμενο φυσιολογικό ιστό. Αν και οι θεραπευτικές προσεγγίσεις που χρησιμοποιούνται περιλαμβάνουν χειρουργική επέμβαση, ακτινοθεραπεία και χημειοθεραπεία, ποσοστό μεγαλύτερο του 90% των ασθενών εμφανίζουν υποτροπή της νόσου και η συνολική επιβίωση είναι εξαιρετικά χαμηλή. Τα παραπάνω γεγονότα εντείνουν την ανάγκη για την εφαρμογή πιο αποτελεσματικών θεραπευτικών σχημάτων, καθώς και την ανακάλυψη νέων μορίων-στόχων για τη θεραπεία του συγκεκριμένου τύπου καρκίνου. Η HARP είναι ένας εκκρινόμενος αυξητικός παράγοντας με μοριακό βάρος 18 kDa που έχει ισχυρή συγγένεια με την ηπαρίνη. Η HARP εκφράζεται κυρίως κατά την εμβρυϊκή ανάπτυξη και απομονώθηκε για πρώτη φορά ως πρωτεΐνη που προάγει την επέκταση των νευριτών στον αναπτυσσόμενο εγκέφαλο. Στην HARP έχει αποδοθεί ένας σημαντικός αριθμός βιολογικών δράσεων, όπως η συμμετοχή της στον πολλαπλασιασμό, στη μετανάστευση και στη διαφοροποίηση των κυττάρων, στο σχηματισμό οστών, στη χονδρογένεση, στη σπερματογένεση, στην ογκογένεση και στην αγγειογένεση. Η HARP εκφράζεται σε διάφορες καρκινικές σειρές από μηνιγγίωμα, νευροβλάστωμα, αστροκυττάρωμα, μελάνωμα, μικροκυτταρικό τύπο καρκίνου του πνεύμονα και γλοιοβλάστωμα. Κλινικές μελέτες έχουν αναφέρει αυξημένα επίπεδα της HARP στον ορό αίματος ασθενών με καρκίνο του κόλον του εντέρου, με καρκίνο του παγκρέατος και με καρκίνο του μαστού. Στην παρούσα μελέτη, προσπαθήσαμε να διερευνήσουμε το ρόλο της HARP στην ανάπτυξη όγκου και στην αγγειογένεση που προκαλούν τα κύτταρα C6, μετασχηματίζοντας τα κύτταρα αυτά με την αντινοηματική αλληλουχία για το cDNA της HARP και καταστέλλοντας την έκφρασή της στα κύτταρα C6. Μείωση της ενδογενούς έκφρασης της πρωτεΐνης της HARP στα κύτταρα C6 (κύτταρα AS-C6) προκάλεσε στατιστικά σημαντική αύξηση στον πολλαπλασιασμό, στην ανάπτυξη των κυττάρων σε τρισδιάστατο περιβάλλον και στη μετανάστευση. Όταν κύτταρα AS-C6 εμβολιάστηκαν σε χοριοαλλαντοϊκή μεμβράνη εμβρύου όρνιθας, οδήγησαν σε σημαντική αύξηση της καρκινικής αγγειογένεσης, σε σύγκριση με τις μεμβράνες που είχαν εμβολιαστεί με μη μετασχηματισμένα κύτταρα C6 ή με κύτταρα C6 που είχαν μετασχηματιστεί μόνο με το πλασμίδιο-φορέα (κύτταρα ΡC-C6). Με παρόμοιο τρόπο, θρεπτικό μέσο καλλιέργειας των κυττάρων AS-C6 προκάλεσε στατιστικά σημαντική αύξηση στον πολλαπλασιασμό, στη μετανάστευση και στο σχηματισμό ψευδαγγείων των ενδοθηλιακών κυττάρων in vitro σε σύγκριση με την επίδραση του θρεπτικού μέσου καλλιέργειας των κυττάρων C6 και ΡC-C6. Η έκφραση της HARP φαίνεται να είναι απαραίτητη για την ανασταλτική δράση αυξημένων ενδοκυτταρικών επιπέδων cAMP στον πολλαπλασιασμό και τη μετανάστευση των κυττάρων C6 και αύξηση των ενδοκυτταρικών επιπέδων cAMP οδήγησε σε αύξηση της έκφρασης και έκκρισης HARP, πιθανά μέσω ενεργοποίησης του μεταγραφικού παράγοντα AP-1. Τέλος, παρατηρήθηκε σημαντική αύξηση των επιπέδων του mRNA και της πρωτεΐνης του αυξητικού παράγοντα των ενδοθηλιακών κυττάρων (vascular endothelial growth factor, VEGF) σε καλλιέργειες των κυττάρων AS-C6 σε σχέση με τα κύτταρα C6 και PC-C6. H HARP βρέθηκε να συν-ανοσοκατακρημνίζεται με τον VEGF σε θρεπτικό μέσο καλλιέργειας των κυττάρων C6 και pC-C6, το οποίο υποδηλώνει μια άμεση αλληλεπίδραση μεταξύ των δύο αυτών αυξητικών παραγόντων. Συνοψίζοντας, τα αποτελέσματα της παρούσας εργασίας προτείνουν ότι ο αυξητικός παράγοντας HARP έχει αρνητικό ρόλο στη ρύθμιση της ανάπτυξη όγκου και της αγγειογένεση που επάγουν τα κύτταρα C6, πιθανά ρυθμίζοντας την έκφραση ή/και τη διαθεσιμότητα άλλων αυξητικών παραγόντων. / Malignant gliomas, the most common type of brain tumors in adults, present a remarkable degree of neovascularisation and invasiveness into surrounding tissues. Although combinations of surgery, radiotherapy and chemotherapy are used, more than 90% of the patients experience local recurrence and their survival is extremely low. These facts stress the need for more effective therapeutic strategies and new targets for tumour therapy. Heparin affin regulatory peptide (HARP), also known as pleiotrophin or heparin-binding growth-associated molecule, is an 18-kDa secreted growth factor that has high affinity for heparin. HARP is mainly expressed during embryonic development, in early postnatal rat and bovine brain and was first isolated as a major neurite outgrowth-promoting protein of developing brain. Since then, a number of biological activities have been well established for HARP, such as its role in cellular proliferation, migration and differentiation and its involvement in bone formation, chondrogenesis, spermatogenesis, tumor growth and angiogenesis. HARP is expressed in various cancer cell lines, derived from meningiomas, neuroblastomas, astrocytomas, melanomas, small cell lung cancer (SCLC) cell lines and glioblastomas. Clinical studies have shown elevated serum levels and tumor expression of HARP in patients with colon, stomach, pancreatic and breast cancer. Ιn the present study, we tried to elucidate the role of HARP in the growth and angiogenicity of C6 glioma cells by using an antisense strategy for inhibition of HARP expression in rat C6 glioma cells. Decrease of the expression of endogenous HARP protein in C6 cells (AS-C6 cells) significantly increased proliferation rate and anchorage-independent growth of cells. Implantation of AS-C6 cells onto chicken embryo chorioallantoic membranes resulted in a significant increase of tumor-induced angiogenesis, compared with those induced by non transfected or C6 cells transfected with the plasmid alone (PC-C6 cells). In the same line, conditioned medium from AS-C6 cells significantly increased endothelial cell proliferation, migration and tube formation in vitro compared with the effect of C6 or PC-C6 cells. HARP expression is required for cAMP-induced inhibition of C6 cell proliferation and migration and cAMP increased the expression and secretion of HARP by C6 cells, possibly through activation of Activator Protein 1. Finally, a significant increase in vascular endothelial growth factor (VEGF) mRNA and protein levels were observed in cultures of AS-C6 cells compared with C6 or PC-C6 cells. HARP was co-immunoprecipitated with VEGF from the conditioned medium of C6 and PC-C6 cells, which indicates a direct interaction between the two factors. Collectively, these data suggest that HARP negatively regulates tumor growth and angiogenesis induced by C6, possibly through regulation of the expression or/and activation of other growth factors.

Η παρούσα εργασία αφορά στην ρύθμιση της έφρασης και έκκρισης της πλειοτροπίνης απο ανθρώπινα ενδοθηλιακά και κύτταρα γλοιοβλαστώματος. Γενικά, οι βιβλιογραφικές αναφορές σχετικά με τη ρύθμιση της μεταγραφής του γονιδίου της πλειοτροπίνης είναι πολύ λίγες, παρόλο που είναι ένα μόριο το οποίο φαίνεται να συμμετέχει στην αγγειογένεση και την ανάπτυξη πολλών τύπων όγκων. Μελετήθηκε η επίδραση παραγόντων που προάγουν της αγγειογένεση όπως, το μονοξείδιο του αζώτου, ο ορός και υποξία με σκοπό την διαλεύκανση του μονοπατιού ρύθμισης της ανάπτυξης των γλοιοβλαστωμάτων, το οποίο αν αξιοποιηθεί θεραπευτικά, ίσως να οδηγήσει σε καλύτερα θεραπευτικά αποτελέσματα. / In this study we examined the regulation of the expression and secretion of pleiotrophin from human endothelial and glioblastoma cells. Although pleiotrophin is a growth factor proved to promote angiogenesis and tumor growth, yet few things are known about its transcriptional regulation. In this work we studied the effect of factors that promote angiogenesis like nitric oxide, serum and hypoxia in order to elucidate the involved pathway.

Ο αυξητικός παράγοντας πλειοτροπίνη (Pleiotrophin, PTN), γνωστός και ως HARP (Heparin-Affin Regulatory Peptide), έχει μοριακή μάζα 18 kDa και ανήκει σε μια διακριτή οικογένεια αυξητικών παραγόντων που δεσμεύονται στην ηπαρίνη και σχετίζονται με αγγειογένεση και καρκινική ανάπτυξη. Στην παρούσα εργασία, μελετήσαμε την επίδραση εξωγενώς χορηγούμενης PTN στην παραγωγή Η2Ο2 ενδοκυτταρικά, σε δύο τύπους ανθρώπινων κυττάρων, ενδοθηλιακά από φλέβα ομφάλιου λώρου (HUVEC) και καρκινικά κύτταρα προστάτη LNCaP. Η ΡΤΝ επάγει με δοσο-εξαρτώμενο και χρονο-εξαρτώμενο τρόπο την παραγωγή του Η2Ο2 και στους δύο τύπους κυττάρων. Προεπώαση των κυττάρων με apocynin, που θεωρείται εκλεκτικός αναστολέας του ενζυμικού συστήματος της NADPH οξειδάσης, οδήγησε σε πλήρη αναστολή της επαγόμενης από ΡΤΝ αύξησης του ενδοκυτταρικού Η2Ο2 και κυτταρικής μετανάστευσης. Ο υποδοχέας RPTPβ/ζ, ο οποίος εμπλέκεται στην επαγόμενη από ΡΤΝ μετανάστευση των HUVEC, φαίνεται να εμπλέκεται και στην επαγόμενη από ΡΤΝ αύξηση των ενδοκυτταρικών επιπέδων Η2Ο2, αφού μείωση της έκφρασης ή της ενεργότητας του RPTPβ/ζ στα κύτταρα HUVEC και LNCaP είχε ως αποτέλεσμα την αναστολή της επαγόμενης από την PTN ενδοκυτταρικής παραγωγής Η2Ο2. Η κινάση Src, η οποία αλληλεπιδρά και ενεργοποιείται από δέσμευση της ΡΤΝ στον RPTPβ/ζ, εμπλέκεται στην παραγωγή Η2Ο2 που επάγεται από την PΤΝ και στους δύο υπό μελέτη τύπους κυττάρων, αφού αναστολή της από τον εκλεκτικό αναστολέα ΡΡ1 είχε ως αποτέλεσμα την αναστολή της επαγόμενης από την PTN ενδοκυτταρικής παραγωγής Η2Ο2. Με σκοπό να αξιολογηθεί ο ρόλος της ενδογενούς ΡΤΝ στα ενδοκυτταρικά επίπεδα Η2Ο2 χρησιμοποιήθηκαν κύτταρα LNCaP που είχαν μετασχηματιστεί σταθερά με την αντινοηματική αλληλουχία του γονιδίου της ΡΤΝ και εκφράζουν μειωμένα επίπεδα ΡΤΝ (AS-LNCaP) ή κύτταρα που είχαν μετασχηματιστεί σταθερά μόνο με το πλασμίδιο φορέα (PC-LNCaP). Επιπλέον, δημιουργήθηκαν και χαρακτηρίστηκαν σταθερά μετασχηματισμένα ανθρώπινα καρκινικά κύτταρα PC3, τα οποία εκφράζουν την αντινοηματική αλληλουχία του γονιδίου της ΡΤΝ και εκφράζουν μειωμένα επίπεδα ΡΤΝ (AS-PC3),τροποποιημένη μορφή της ΡΤΝ από την οποία λείπουν 26 αμινοξέα από το καρβοξυτελικό της άκρο (ΗΔ-PC3), ή μόνο το πλασμίδιο φορέα (PC-PC3). Παρατηρήθηκε ότι μειωμένα επίπεδα έκφρασης PTN ή υπερέκφραση της τροποποιημένης μορφής της χωρίς το καρβοξυτελικό άκρο σχετίζεται με μειωμένη μεταναστευτική ικανότητα και στους δύο τύπους κυττάρων. Συμπερασματικά, στην παρούσα εργασία καταδεικνύεται ότι η πλειοτροπίνη μέσω του υποδοχέα της RPTPβ/ζ και της κινάσης src επάγει την παραγωγή Η2Ο2 σε ανθρώπινα ενδοθηλιακά και καρκινικά κύτταρα προστάτη, γεγονός που φαίνεται να εμπλέκεται με επαγωγή της μετανάστευσης των κυττάρων. / Pleiotrophin (PTN), also called heparin affin regulatory peptide or heparin-binding growth associated molecule, is an 18 kDa secreted growth factor that displays high affinity for heparin. A growing body of evidence indicates that PTN is involved in cell proliferation, migration and differentiation. In the present work, we studied the effect of exogenous administration of PTN on the generation of hydrogen peroxide (HP) by two types of human cells, umbilical vein endothelial (HUVEC) and prostate cancer LNCaP cells. Human recombinant PTN significantly increased the production of HP in a concentration and time dependent manner. The PTN induced production of HP was blocked by the NADP(H) oxidase inhibitor apocynin, suggesting that superoxide is probably the initial ROS produced by PTN, rapidly dismutating to HP. In addition, apocynin completely abolished the stimulatory effect of PTN in migration of both HUVEC and LNCaP cells. Receptor protein-tyrosine phosphatase beta/zeta (RPTPβ/ζ), which has been implicated in PTN-induced migration, seems to be also involved in PTN-induced HP generation, since suppression of the receptor using genetic and pharmacological inhibitors or inhibition of src kinase activity abolished PTN induced HP levels. Finally, stably transfected human prostate cancer LNCaP and PC3 cells that express reduced amounts of PTN or over-express a truncated form of PTN missing 25 aminoacids from its carboxyl terminus, considered as dominant negative for tumor growth, have reduced amounts of intracellular HP and decreased migration capability, compared with the corresponding cells that are non transfected or are transfected only with the carrier plasmid. Collectively, these results suggest a role of HP in the PTN/RPTPβ/ζ signaling pathway that leads to cell migration in both human endothelial and prostate cancer cell lines.

Η Heparin affin regulatory peptide (HARP) είναι ένας αυξητικός παράγοντας με μοριακό βάρος 18 kDa, που έχει μεγάλη συγγένεια με την ηπαρίνη. Είναι συντηρημένη μεταξύ διαφόρων ειδών και παρουσιάζει 50% ομολογία με τη Midkine και την RI-HBP. Οι πρωτεΐνες αυτές συγκροτούν μια σχετικά νέα οικογένεια αυξητικών παραγόντων που έχουν συγγένεια με την ηπαρίνη. Η HARP απομονώθηκε για πρώτη φορά από τον εγκέφαλο νεογέννητου βοός ως ένα μόριο που μπορεί να επάγει την προέκταση των νευρικών κυττάρων. Επίσης, εκφράζεται στη μήτρα, στους χόνδρους και στα οστά. Αρκετές αναφορές αποδεικνύουν ότι υπάρχει μεγάλη συσχέτιση μεταξύ της έκφρασης της HARP και της ανάπτυξης καρκινικού όγκου και της αγγειογένεσης. Η HARP αποτελεί μιτογόνο παράγοντα για διάφορους τύπους ενδοθηλιακών κυττάρων, ενώ μπορεί να επάγει την αγγειογένεση in vivo και in vitro. Ασκεί τη βιολογική της δράση μετά από αλληλεπίδραση με πρωτεογλυκάνες της επιφάνειας του κυττάρου, όπως η N-συνδεκάνη, ή μετά από δέσμευση σε πιο ειδικούς υποδοχείς. Η RPTPβ/ζ, η εκκρινόμενη μορφή της (φωσφακάνη), αλλά και η κινάση ALK, έχει αναφερθεί ότι μπορούν να δεσμεύουν τη HARP και να συμμετέχουν στη μεταγωγή του σήματός της. Ο κύριος σκοπός αυτής της διατριβής είναι η μελέτη της δομής και της δράσης της HARP, χρησιμοποιώντας μικρότερα τμήματα της HARP τα οποία τα έχουμε βιοτινυλιώσει για να διερευνήσουμε τις περαιτέρω δράσεις της, τους διάφορους μηχανισμούς και με ποιους υποδοχείς αλληλεπιδρά. Τα βιοτινυλιωμένα-σεσημασμένα πεπτίδια αποτελούν χρήσιμα εργαλεία για την βιοτεχνολογία, σε διάφορες εφαρμογές στερεής φάσης ανοσολογικών δοκιμών καθώς και τον εντοπισμό των υποδοχέων. Τα συνθετικά πεπτίδια της HARP συντέθηκαν με μεθοδολογία Fmoc/t-Bu σε στερεά φάση χρησιμοποιώντας ως στερεό υπόστρωμα τη 2-χλωροτρίτυλ-ρητίνη για την παραλαβή μιας ελεύθερης αμινοομάδας (ΝΗ2) και C-τελικού καρβοξυλικού οξέος αντίστοιχα. Για την παραγωγή βιοτινυλιωμένων πεπτιδίων, περιλαμβάνει τον σχηματισμό ενός δεσμού: της ελεύθερη αμινοομάδα με την βιοτίνη στην διάρκεια της πεπτιδικής σύνθεσης στερεής φάσης. Επειδή η βιοτίνη έχει μικρή διαλυτότητα στα διαλύματα της πεπτιδικής σύνθεσης χρησιμοποιούμε τους προσχηματισμένους ενεργοποιημένους εστέρες όπως την βιοτίνη- ONp (biotin p-nitrophenyl ester ). Τα συνθετικά πεπτίδια P(13-39) και Ρ (65-97), που αντιστοιχούσαν στην Ν-CTR-I και C-TSR-I περιοχή της HARP μελετήθηκαν ως προς την επίδρασή τους στον πολλαπλασιασμό και στην μετανάστευση των καρκινικών κυττάρων του προστάτη (PC3). / Heparin affin regulatory peptide (HARP) is an 18 kDa growth factor that has a high affinity for heparin. HARP is highly conserved among species and shares 50% homology with Midkine and RI-HBP. The above proteins constitute a relatively new family of growth factors with high affinity for heparin. HARP has been originally purified from perinatal rat and bovine brain as a molecule that induces neurite outgrowth. HARP is also expressed in uterus, cartilage and bone extracts. Several reports have established a strong correlation between HARP expression and tumour growth and angiogenesis. HARP has been reported to be mitogenic for different types of endothelial cells and angiogenic in vivo and in vitro. HARP exerts its biological activity through interactions with cell surface proteoglycans, such as N-syndecan, or binding to more specific cell surface receptors. Receptor-type protein tyrosine-phosphatase β/ζ (RPTPβ/ζ) and its secreted variant phosphacan, as well as ALK are implicated in HARP signalling. The main target of this study is to investigate the structure and the biological activities of HARP, using smaller fragments of HARP which are biotinylated in order to study its further activities, the mechanisms and the interactions with the receptor. Biotin-labelled peptides are extremely useful tools for biochemistry, with applications in solid-phase immunoassays, affinity purification and receptor localization. The synthetic peptides of HARP were synthesized by Fmoc/t-Bu solid phase methodology utilizing a 2-chlorotrityl-chloride resin to provide a free NH2- amino-group and carboxyl acid, respectively. The simplest approach for the production of biotin-labelled peptides involves capping of a resin-bound free amino group with biotin, prior to cleavage of the peptide from the resin and side-chain deprotection. Because of the poor solubility of biotin in peptide synthesis solvents, biotin is most frequently introduced using a pre-formed active ester, such as biotin p-nitrophenyl ester. The synthetic peptides, P(13-39) and P(65-97) with amino acids sequence corresponding to the N- and C-TSR-I domains of HARP, were studied for their impact to the proliferation and chemotactic (migration) on prostate cancer cells (PC3).

Τα ρετινοειδή αποτελούν μια μεγάλη οικογένεια οργανικών μορίων που μοιάζουν δομικά με τη βιταμίνη Α. Το all-trans ρετινοϊκό οξύ (atRA) συμμετέχει σε μεγάλο εύρος βιολογικών διεργασιών μέσω της πρόσδεσής του και της ενεργοποίησης των υποδοχέων του, τους υποδοχείς ρετινοϊκού οξέος (RAR) και τους υποδοχείς ρειτινοειδών Χ (RXR). Κάθε κατηγορία υποδοχέων περιλαμβάνει τρία μέλη, α, β και γ. Τα ρετινοειδή χρησιμοποιούνται για τη θεραπεία πολλών ασθενειών, από την κοινή ακμή ως την οξεία προμυελωτική λευχαιμία. Λόγω των σοβαρών ανεπιθύμητων ενεργειών τους, γίνεται προσπάθεια να συντεθούν ανάλογα με λιγότερες ανεπιθύμητες δράσεις ή/και καλύτερη αποτελεσματικότητα. Προς αυτήν την κατεύθυνση έχουν συντεθεί πολλά ανάλογα, ανάμεσα τους και αυτά που χρησιμοποιήθηκαν στην παρούσα εργασία: RA2SPM (ένα σύζευγμα δύο μορίων atRA με σπερμίνη), ACI2SPM (ένα σύζευγμα δύο μορίων ασιτρετίνης με σπερμίνη), TRX2SPM (ένα σύζευγμα δύο μορίων τριοξαλενίου με σπερμίνη), ACI-SPM-TRX (σύζευγμα ασιτρετίνης και τριοξαλενίου με σπερμίνη), RA-SPM-ACI (σύζευγμα atRA και τριοξαλενίου με σπερμίνη). Τα ανάλογα αυτά συντέθηκαν από την ερευνητική ομάδα του καθηγητή Δ. Παπαϊωάννου, στο Τμήμα Χημείας του Πανεπιστημίου Πατρών. Στην παρούσα εργασία μελετήθηκε η δράση των αναλόγων αυτών στην ανάπτυξη καρκινικών κυττάρων προστάτη PC3 in vitro και έγινε μια αρχική διερεύνηση του μηχανισμού δράσης και της πιθανής εμπλοκής των υποδοχέων ρετινοειδών. Ως πρότυπη ένωση με την οποία συγκρίθηκαν όλες οι άλλες ενώσεις χρησιμοποιήθηκε το ανάλογο RA2SPM, Το ανάλογο ACI2SPM έχει την καλύτερη δράση σε σύγκριση με τα άλλα ανάλογα, αφού προκάλεσε δοσο-εξαρτώμενη μείωση του αριθμού των κυττάρων PC3 σε ποσοστό παρόμοιο με τη δράση του RA2SPM και είναι πιο δραστικό στη συγκέντρωση 10-6Μ σε σχέση με τα άλλα ανάλογα. Αυτή η δράση φαίνεται να σχετίζεται με αύξηση των επιπέδων του mRNA του ογκοκατασταλτικού γονιδίου RARβ, που όμως είναι μικρότερη από αυτήν που προκαλεί το ανάλογο RA2SPM. Ο εκλεκτικός ανταγωνιστής του RARα, Ro-41-5253, βρέθηκε ότι επίσης προκαλεί αύξηση των επιπέδων του mRNA του RARβ, ενώ δεν επηρεάζει τη δράση του ACI2SPM. Επιπλέον, το ανάλογο ACI2SPM μείωσε τα επίπεδα της πρωτεΐνης πλειοτροπίνης (PTN), η οποία είναι γνωστό πως παίζει σημαντικό ρόλο στην ανάπτυξη των καρκινικών κυττάρων προστάτη PC3. Η μείωση είναι μικρότερη από αυτήν που προκαλεί το ανάλογο RA2SPM και δεν επηρεάζεται από τον ανταγωνιστή Ro 41-5253, ο οποίος έχει από μόνος του ανασταλτική δράση. Συμπερασματικά, τα αποτελέσματα της παρούσας εργασίας υποδεικνύουν ότι το ανάλογο ACI2SPM είναι αποτελεσματικό στη μείωση του αριθμού των καρκινικών κυττάρων προστάτη PC3 και στη μείωση των επιπέδων της (PTN), αλλά η δράση του είναι μικρότερη από αυτήν του RA2SPM. Επίσης, καταδεικνύουν ότι ο εκλεκτικός αναστολέας του RARα Ro-41-5253, όπως έχει αναφερθεί ξανά στη διεθνή βιβλιογραφία, παρουσιάζει προβλήματα εκλεκτικότητας και πρέπει να χρησιμοποιείται με προσοχή. / Retinoids constitute a large family of organic compounds structurally related to the naturally occurring vitamin A. All-trans-retinoic acid (atRA) is known to modulate a wide range of cellular biological processes through binding to and activation of its specific receptors, retinoic acid receptors (RAR) and retinoid X receptors α, β and γ. Retinoids are being used for the treatment of various diseases, ranging from acne vulgaris to acute promyelocytic leukemia. However, due to serious adverse effects, there has been a great effort to synthesize analogues with better efficacy or/and minimized adverse effects. Towards this direction, many analogues have been synthesized, among which those that have been used in the present work: RA2SPM (a conjugate of all-trans retinoic acid with spermine), ACI2SPM (a conjugate of 2 molecules of acitretin with spermine), TRX2SPM (a conjugate of 2 molecules of trioxalen with spermine), ACI-SPM-TRX (a conjugate of trioxalen and acitretin with spermine), RA-SPM-ACI (a conjugate of all-trans retinoic acid and acitretin with spermine). These analogues have been synthesized by the research group of Prof. D. Papaioannou at the Department of Chemistry of the University of Patras. The present work represents an initial investigation of the in vitro effects of these analogues on prostate cancer cell growth (PC3), as well as of their mechanism of action and the possible involvement of retinoid receptors. The analogue RA2SPM was used as a reference control. The analogue ACI2SPM decreased the number of prostate cancer PC3 cells in a concentration-dependent manner, being as effective as RA2SPM and more effective compared with the rest of the tested analogues. This effect seems to correlate with an increase of the mRNA levels of the RARβ tumour repressor gene; however, the RARβ tumour repressor mRNA levels decrease is smaller than that observed with RA2SPM. The RARa selective antagonist Ro 41-5253 also increases the RARβ mRNA levels, while it does not affect the ACI2SP-induced increase. Furthermore, the ACI2SPM analogue was found to decrease the protein levels of the growth factor pleiotrophin (PTN), which is known to play an important role in the growth of the prostate cancer cell line PC3. Similarly to the effect on RARβ, the decrease of the PTN levels achieved by ACI2SPM is smaller than the one achieved by RA2SPM and is unaffected by the antagonist Ro 41-5253. Ro 41-5253 decreased PTN levels by itself, supporting the increasing notion that it should be used with caution as a RARα antagonist. In conclusion, the results of this work suggest that the ACI2SPM analogue is efficient in decreasing the prostate cancer PC3 cell numbers and PTN protein levels but seems to be less effective than RA2SPM action. More work is required in order to define the mechanism(s) of action of the tested analogues, as well as to better specify their effectiveness and toxicity.

Η πλειοτροπίνη (PTN) αποτελεί έναν αυξητικό παράγοντα με ποικίλες δράσεις και σημαντικό ρόλο στην ανάπτυξη όγκων και την αγγειογένεση. Διάφοροι υποδοχείς αλληλεπιδρούν με την ΡΤΝ και διαμεσολαβούν τις βιολογικές της δράσεις, όπως η Ν-συνδεκάνη, ο ALK (κινάση αναπλαστικού λεμφώματος) και ο RPTPβ/ζ (υποδοχέας με δράση φωσφατάσης τυροσίνης β/ζ). Η ερευνητική μας ομάδα έχει δείξει σε προηγούμενη μελέτη ότι η ικανότητα της PTN να επάγει κυτταρική μετανάστευση εξαρτάται από το σχηματισμό ενός λειτουργικού συμπλόκου που αποτελείται από τον RPTPβ/ζ και την ιντεγκρίνη ανβ3. Η πολυ-λειτουργική πρωτεΐνη νουκλεολίνη (NCL), η οποία υπερεκφράζεται στην επιφάνεια ενεργοποιημένων ενδοθηλιακών και καρκινικών κυττάρων και διαμεσολαβεί τις διεγερτικές δράσεις διαφόρων αγγειογενετικών παραγόντων, έχει επίσης προταθεί ως υποδοχέας χαμηλής συγγένειας για την ΡΤΝ, με άγνωστες όμως λειτουργίες. Στην παρούσα μελέτη δείξαμε, με τη χρήση μεθόδων ανοσοκατακρήμνισης-ανοσοαποτυπώματος, διπλού ανοσοφθορισμού και προσδιορισμού αλληλεπίδρασης λόγω εγγύτητας, ότι η PTN αλληλεπιδρά άμεσα με τη NCL. Η αλληλεπίδραση αυτή περιλαμβάνει πρόσδεση της αμινοτελικής περιοχής της ΡΤΝ (αμινοξέα: 16-24) στην κεντρική περιοχή της NCL (αμινοξέα: 308-645). Μείωση της έκφρασης της NCL με siRNA ή λειτουργική αναστολή της μεμβρανικής NCL από το πεπτίδιο 5(KPR)TASP ανέστειλε πλήρως την επαγόμενη από ΡΤΝ μετανάστευση ενδοθηλιακών κυττάρων. Με αφετηρία την παρατήρηση ότι ο εντοπισμός της NCL στην κυτταρική επιφάνεια ανιχνεύθηκε μόνο σε κύτταρα που εκφράζουν την ανβ3, και πραγματοποιώντας πειράματα ανοσοφθορισμού και βιοχημικές μελέτες σε κύτταρα με γενετικά τροποποιημένη έκφραση των υπό μελέτη μορίων, δείξαμε ότι ο εντοπισμός της NCL στην πλασματική μεμβράνη εξαρτάται από τη φωσφορυλίωση της β3 στην τυροσίνη 773 μέσω ενεργοποίησης του RPTPβ/ζ και της c-src. Καθοδικά της ανβ3, η PI3K συμμετέχει σε αυτή τη δράση. Ο VEGF165 που επίσης επάγει το μεμβρανικό εντοπισμό της NCL, δρα μέσω δέσμευσης στον RPTPβ/ζ και ενεργοποίησης του σηματοδοτικού μονοπατιού RPTPβ/ζ/c-src/ανβ3. Η περιοχή δέσμευσης στους υποδοχείς VEGFR-1 και VEGFR-2 ή η περιοχή δέσμευσης στην ηπαρίνη στο μόριο του VEGF165 δεν εμπλέκονται στον επαγόμενο από VEGF165 εντοπισμό της NCL στην κυτταρική μεμβράνη. Εκτός από την PI3K, στη δράση του VEGF165 καθοδικά της ανβ3 εμπλέκεται και η κινάση p38, η ενεργοποίηση της οποίας είναι ανεξάρτητη από τον RPTPβ/ζ και τη φωσφορυλίωση της β3 στις τυροσίνες 773 ή 785, και φαίνεται να ανήκει σε μονοπάτι που ενεργοποιείται παράλληλα και που παραμένει αδιευκρίνιστο. Μηχανιστικά, η NCL βρέθηκε να αλληλεπιδρά άμεσα με την ανβ3, τον RPTPβ/ζ, τον VEGF165 και τον VEGFR-2, αλλά επηρεάζει τον ενδοκυτταρικό εντοπισμό μόνο του RPTPβ/ζ και της PTN. Θετική συσχέτιση παρατηρήθηκε ως προς την έκφραση της μεμβρανικής NCL και της ανβ3 σε μικροσυστοιχίες ιστών προερχόμενων από ανθρώπινα γλοιοβλαστώματα. Τέλος, βρέθηκε ότι το μονοκλωνικό αντίσωμα anti-C23 και τα πεπτίδια που στοχεύουν τη μεμβρανική NCL, 5(KPR)TASP, ΗΒ-19 και Nucant 6L, ανέστειλλαν σημαντικά τη μετανάστευση κυττάρων που εκφράζουν ανβ3, ενώ είχαν μικρή ή καθόλου δράση στη μετανάστευση κυττάρων που δεν εκφράζουν ανβ3 ή υπερεκφράζουν μετάλλαγμα της β3 με αντικατάσταση της κυτταροπλασματικής τυροσίνης 773 σε φαινυλαλανίνη. Συνολικά, από τα αποτελέσματα της παρούσας διατριβής προκύπτει ότι η έκφραση της ανβ3 και η φωσφορυλίωση της β3 στην τυροσίνη 773 καθορίζουν τον εντοπισμό της NCL στην κυτταρική επιφάνεια, καθοδικά του σηματοδοτικού μονοπατιού RPTPβ/ζ/c-src που συμμετέχει στην κυτταρική μετανάστευση που επάγεται τόσο από την ΡΤΝ, όσο και από τον VEGF165. Επίσης, φαίνεται ότι η έκφραση της ανβ3 θα μπορούσε να χρησιμοποιηθεί ως βιοδείκτης για τη χρήση ανταγωνιστών της μεμβρανικής NCL ως αντικαρκινικών παραγόντων. / Pleiotrophin (PTN) is a growth factor that plays a significant role on tumor growth and angiogenesis. Several receptors interact with PTN and mediate its biological actions, such as N-syndecan, anaplastic lymphoma kinase (ALK) and receptor protein tyrosine phosphatase beta/zeta (RPTPβ/ζ). Our group has previously shown that the ability of PTN to stimulate migratory responses depends on the formation of a functional complex consisting of RPTPβ/ζ and integrin ανβ3. The multifunctional protein nucleolin (NCL), which is over-expressed on the surface of activated endothelial and tumor cells and mediates the stimulatory actions of several angiogenic factors, has been also suggested as a low affinity receptor for PTN, however with unknown functions. In the present study, by using immunoprecipitation/Western blot analyses, double immunofluorescence and proximity ligation assays, we showed that PTN directly interacts with NCL. This interaction involves binding of the amino-terminal domain of PTN (amino acids: 16-24) to the central domain of NCL (amino acids: 308-645). Down-regulation of NCL by siRNA or blockage of cell surface NCL by its ligand 5(KPR)TASP completely abolished PTN-induced endothelial cell migration. Based on the observation that cell surface NCL localization was detected only in cells expressing ανβ3 and by performing immunofluorescence and biochemical studies in cells with genetically altered expression of the studied molecules, we demonstrated that cell surface NCL localization depends on the phosphorylation of β3 at Tyr773 through RPTPβ/ζ and c-src activation. Down-stream of ανβ3, PI3K activity is required for cell surface NCL localization. VEGF165 that also induces cell surface NCL localization acts through binding to RPTPβ/ζ and activation of the RPTPβ/ζ/c-src/ανβ3 signaling pathway. The receptor or the heparin binding sites on the VEGF165 molecule do not seem to be involved in this VEGF165 action. Apart from PI3K, in VEGF165-induced cell surface NCL localization, p38 that lays down-stream of ανβ3, is also involved. Activation of p38 is independent of RPTPβ/ζ and β3 Tyr773 or Tyr785 phosphorylation, and seems to belong to a parallel signaling pathway that remains unclear. Mechanistically, NCL was found to directly interact with ανβ3, RPTPβ/ζ, VEGF165 and VEGFR-2, but only affects the intracellular localization of RPTPβ/ζ and PTN. Positive correlation of cell surface NCL and ανβ3 expression was observed in human glioblastoma tissue arrays. Finally, the monoclonal antibody anti-C23 and the peptides targeting cell surface NCL, 5(KPR)TASP, HB-19 and Nucant 6L, significantly inhibited migration of cells expressing ανβ3 in the presence of serum, while they had a minor or no effect on cells lacking ανβ3 or over-expressing mutant β3 with replacement of cytoplasmic tyrosine 773 to phenylalanine. Collectively, these data suggest that ανβ3 expression and β3 phosphorylation at Tyr773 downstream of the RPTPβ/ζ/c-src signaling cascade determines the cell surface localization of NCL, which is required for cell migration induced by both PTN and VEGF165. Moreover, expression of ανβ3 could be used as a biomarker for the use of cell surface NCL antagonists as anticancer agents.

Τα πυρρολοκαρβαζολικά ανάλογα του ινδολοκαρβαζολικού αρωματικού σκελετού φυσικών προϊόντων είναι μία νέα τάξη ενώσεων που εξετάζονται ως πιθανά αντικαρκινικά φάρμακα. Διακρίνονται σε αναστολείς πρωτεϊνικών κινασών και σε παράγοντες που δρουν στη DNA τοποϊσομεράση Ι ή ΙΙ και βλάπτουν το DNA, ανάλογα με το μηχανισμό δράσης τους και τη δομή τους. Μελετώντας την επίδραση επτά πυρρολο[2,3-α]καρβαζολικών αναλόγων στην ενεργότητα της κυκλινο-εξαρτώμενης κινάσης 1 (cyclin dependent kinase 1, CDK1) βρήκαμε ότι μόνο ένα από τα ανάλογα (1e) ανέστειλε πλήρως και με δοσο-εξαρτώμενο τρόπο το ένζυμο, ενώ όλα αναστέλλουν μερικώς ή πλήρως την ενεργότητα της τοποϊσομεράσης Ι in vitro. Στηn παρούσα εργασία μελετήθηκε η επίδραση των ίδιων αναλόγων στον πολλαπλασιασμό και μετανάστευση των ενδοθηλιακών κυττάρων in vitro και στην αγγειογένεση in vivo, στο μοντέλο της χοριοαλλαντοϊκής μεμβράνης εμβρύου όρνιθας. Διαπιστώθηκε ότι όλα τα ανάλογα αναστέλλουν τον πολλαπλασιασμό και τη μετανάστευση των ενδοθηλιακών κυττάρων in vitro, καθώς και την αγγειογένεση in vivo, αλλά διαφέρουν ως προς την αποτελεσματικότητα ή την ισχύ. Από προηγούμενες μελέτες της ερευνητικής μας ομάδας είναι γνωστό ότι ο αυξητικός παράγοντας πλειοτροπίνη (PTN) επάγει τη μετανάστευση ενδοθηλιακών κυττάρων in vitrο, δρώντας μέσω του υποδοχέα της με δράση φωσφατάσης τυροσίνης RPTPβ/ζ και της ιντεγκρίνης ανβ3. Με δεδομένο ότι στη βιβλιογραφία η CDK1 έχει αναφερθεί να συμμετέχει στην επαγόμενη από ενεργοποίηση της ανβ3 μετανάστευση ενδοθηλιακών κυττάρων, μελετήσαμε την επίδραση των πυρρολο[2,3-α]καρβαζολικών αναλόγων στην επαγόμενη από ΡΤΝ κυτταρική μετανάστευση. Μόνο το ανάλογο 1e ανέστειλε τη δράση της ΡΤΝ, τόσο στα ενδοθηλιακά, όσο και στα ανθρώπινα κύτταρα γλοιοβλαστώματος U87MG, τα οποία εκφράζουν RPTPβ/ζ και ιντεγκρίνη ανβ3 και μεταναστεύουν ως ανταπόκριση στη διέγερση με ΡΤΝ. Ίδια δράση είχε και η ροσκοβιτίνη, γνωστός αναστολέας των CDK1/2 και CDK5 και στα δύο είδη κυττάρων, ενώ ο εκλεκτικός μόνο για CDK1/2 αναστολέας NU2058 δεν είχε καμία δράση στην επαγόμενη από ΡΤΝ κυτταρική μετανάστευση. Τα αποτελέσματά μας υποδεικνύουν ότι η επαγόμενη από ΡΤΝ μετανάστευση ανθρώπινων ενδοθηλιακών κυττάρων δεν εξαρτάται από τις κινάσες CDK1 και CDK2, αλλά από την κινάση CDK5, δεδομένο που επιβεβαιώθηκε με μείωση της έκφρασης της CDK5 με την τεχνική του siRNA. Η ΡΤΝ δρα επαγωγικά στην ενεργότητα της CDK5, με μέγιστη δράση 5 λεπτά μετά την επίδραση της ΡΤΝ. Σε αυτήν την ενεργοποίηση συμμετέχει και ο υποδοχέας της ΡΤΝ RPTPβ/ζ, αλλά όχι η ιντεγκρίνη ανβ3. Από παλιότερες μελέτες μας είναι δεδομένο πως η πρόσδεση της ΡΤΝ στον υποδοχέα της RPTPβ/ζ οδηγεί σε ενεργοποίηση της κινάσης c-SRC, η οποία απαιτείται για την επαγόμενη από ΡΤΝ κυτταρική μετανάστευση. Για πρώτη φορά αναφέρουμε την αλληλεπίδραση της c-SRC με την CDK5 σε εκχυλίσματα ενδοθηλιακών κυττάρων, καθώς και το ότι η επαγόμενη από ΡΤΝ ενεργοποίηση της κινάσης CDK5 επιτυγχάνεται μέσω ενεργοποίησης της κινάσης c-SRC. Τέλος, η κινάση CDK5 δεν εμπλέκεται στην ενεργοποίηση της ιντεγκρίνης ανβ3 και των ERK1/2 από την ΡΤΝ. Συμπερασματικά, η κυκλινο-εξαρτώμενη κινάση 5 (CDK5) φαίνεται να επηρεάζει σημαντικά λειτουργίες των ενδοθηλιακών κυττάρων που σχετίζονται με αγγειογένεση και τα αποτελέσματά μας προσφέρουν σημαντικά δεδομένα προς αυτήν την κατεύθυνση. Eίναι η πρώτη φορά που περιγράφεται η έκφραση του βασικού ρυθμιστή της CDK5 p35 σε άλλο είδος κυττάρων, εκτός των νευρικών, και ιδιαίτερα στα ενδοθηλιακά. Ο εξέχων ρόλος της κινάσης CDK5 σε διάφορες λειτουργίες και σε παθολογικές καταστάσεις, αρχικά στο νευρικό και στη συνέχεια στα περισσότερα συστήματα, καθιστά ιδιαίτερα σημαντικό το σχεδιασμό και την ανάπτυξη αναλόγων που επιδρούν στην ενεργότητά της άμεσα ή έμμεσα, με βάση τη δομή του αναλόγου 1e. / Indolocarbazole alkaloids constitute a group of natural products that have attracted great attention because of their potential therapeutic applications. Ιndolopyrrolocarbazoles are a new class of antitumor drugs, which can be divided into two major groups, depending on their mechanisms of action and structural features: protein kinase inhibitors and DNA-damaging agents. We have previously evaluated the effect of 7 pyrrolo[2,3-a]carbazole analogues on CDK1/cyclinB (Cyclin Dependent Kinase 1, CDK1) activity and found that only compound1e totally inhibited the enzyme in a dose-dependent manner, while all analogues partially or totally inhibited the activity of topoisomerase I in vitro, with compound 1e being the least effective. In this thesis, the effect of all the pyrrolo[2,3-a]carbazole analogues on angiogenesis was investigated, using the in vivo model of the chick embryo chorioallantoic membrane, as well as proliferation and migration of human endothelial cells in vitro. All the analogues had an effect on the proliferation and migration of endothelial cells in vitro and angiogenesis in vivo, but with differences in their effectiveness or potency. We have previously shown that PTN induces migration of endothelial cells through binding to its receptor protein tyrosine phosphatase β/ζ (RPTPβ/ζ) and ανβ3 integrin. The recent report that ανβ3 expression up-regulates CDK1, which then modulates cell migration, led us to test the effect of the CDK1 inhibitor compound 1e and the other pyrrolo[2,3a]carbazole analogues on the PTN induced migration of human endothelial cells. Only compound 1e inhibited PTN induced migration of human endothelial cells, a result also confirmed in human glioblastoma U87MG cells, which are known to express both RPTPβ/ζ and ανβ3 and migrate in response to PTN. Roscovitine, a synthetic inhibitor of CDKs with selectivity towards CDK1/2 and CDK5, completely attenuated PTN-induced migration of endothelial cells, while the CDK1/2 selective inhibitor NU2058 had no effect, suggesting that inhibition of CDK5 is responsible for inhibition of PTN-induced cell migration. The complete attenuation of PTN-induced migration of endothelial cells following the down-regulation of CDK5 by siRNA further confirmed that CDK5 plays an important role in PTN-induced migration of endothelial cells. PTN increased CDK5 kinase activity with the maximum increase observed within 5 min after stimulation of cells with PTN. This was confirmed by both direct kinase assays, as well as by measuring interaction of CDK5 with its activator protein p35. PTN-induced activation of CDK5 is independent of ανβ3, but depends on RPTPβ/ζ and its downstream activated c-SRC kinase. This is the first time that an interaction between CDK5 and c-SRC is reported in extracts of endothelial cells, as well as the fact that PTN induced CDK5 activation requires c-SRC activation in these cells. Finally, we report no immediate effect of kinase CDK5 on PTN induced activation of ανβ3 integrin and ERK1/2 phosphorylation. Accumulating data favour the notion that CDK5 plays an important role in angiogenesis-related functions of endothelial cells and our data reinforce this observation. The expression of p35 in endothelial cells, the prime regulator of CDK5, is reported here for the first time in other type of cells apart from neuronal. The basic role of CDK5 in several pathologies point out the importance of research and development of compounds that can be effective in inhibiting this kinase, based on the structure of analogue 1e.