Η παρούσα διπλωματική εργασία αποτελεί μία βιβλιογραφική μελέτη επάνω στην υποκλασματοποιημένη ακτινοθεραπεία του γλοιοβλαστώματος. Το πολύμορφο γλοιοβλάστωμα είναι ο πιο επιθετικός τύπος πρωτοπαθούς εγκεφαλικού όγκου με δυσμενείς προγνωστικούς δείκτες. Η θεραπεία του γλοιοβλαστώματος έχει προβληματίσει καθώς τα αποτελέσματα από τις διάφορες θεραπευτικές προσεγγίσεις είναι απογοητευτικά. Στο πρώτο μέρος της εργασίας έχουν δοθεί στοιχεία για την παθοφυσιολογία της νόσου και έχει γίνει ανάλυση της επίδρασης της ακτινοβολίας πρώτα στην οργανική ύλη και στην συνέχεια στο γλοιοβλάστωμα. Αμέσως μετά, εξετάστηκε, ο ρόλος της ακτινοθεραπείας κάνοντας εκτενή αναφορά στις βασικές της αρχές και στις τεχνολογικές εξελίξεις των ακτινοθεραπευτικών τεχνικών σε σχέση με το γλοιοβλάστωμα. Έγινε αναφορά σε κάθε μια χωριστά και παρουσιάζονται τα πλεονεκτήματα και τα μειονεκτήματα όλων των τεχνικών στο γλοιοβλάστωμα. Ακολούθως, η εργασία αυτή εστίασε την προσοχή της στην υποκλασματοποίηση της ακτινοθεραπείας, περιγράφοντας τον ορισμό της και παρουσιάζοντας τις διαστάσεις της. Στο τέλος του πρώτου μέρους αφιερώθηκε ένα μικρό κομμάτι στις γονιδιακές θεραπείες, καθώς δεν είναι λίγοι οι ερευνητές που αναζητούν ευθύνες σε συγκεκριμένα γονίδια και ελπίζουν να ανοίξει ο δρόμος σε νέες γονιδιακές θεραπευτικές προσεγγίσεις στο γλοιοβλάστωμα. Στο δεύτερο μέρος της εργασίας έγινε αναλυτική αναφορά στις μελέτες που έχουν γίνει σχετικά με την υποκλασματοποιημένη ακτινοθεραπεία του γλοιοβλαστώματος και παρατέθηκαν τα σημαντικότερα συμπεράσματα ολόκληρης της βιβλιογραφικής ανασκόπησης στο θέμα. Ένας συγκεντρωτικός πίνακας με επιλεγμένα στοιχεία όλων των μελετών ολοκλήρωσε τη διπλωματική εργασία αυτή. / The present dissertation is a literature study on the hypofractionated radiotherapy of glioblastoma. Glioblastoma multiform is the most aggressive type of primary brain tumour with unfavourable prognostic indicators. Treatment of glioblastoma has puzzled since the results of the different therapeutic approaches are disappointing. In the first part, information was given concerning the pathophysiology of the disease and an analysis have been made on the effect of radiation in the first organic material and then in glioblastoma. Then, the role of radiotherapy was examined, with extensive reference to basic principles and technological developments in radiotherapeutic techniques compared to glioblastoma. A reference was made to each single technique and then all advantages and disadvantages on glioblastoma were presented. Thereafter, the dissertation focuses its attention on subfractionation of radiotherapy, describing its definition and showing its dimensions. At the end of the first part a small chapter was devoted in gene therapies, as there are a few researchers looking into specific genes and hope to open the road to new gene therapeutic approaches in glioblastomas. The second part was a detailed report to studies that have been made on hypofractionated radiotherapy of glioblastoma and the most important conclusions of the literature review on the subject have been cited. Finally, a summary table of selected data of all studies concludes this dissertation.

Η πλειοτροπίνη (PTN) αποτελεί έναν αυξητικό παράγοντα με ποικίλες δράσεις και σημαντικό ρόλο στην ανάπτυξη όγκων και την αγγειογένεση. Διάφοροι υποδοχείς αλληλεπιδρούν με την ΡΤΝ και διαμεσολαβούν τις βιολογικές της δράσεις, όπως η Ν-συνδεκάνη, ο ALK (κινάση αναπλαστικού λεμφώματος) και ο RPTPβ/ζ (υποδοχέας με δράση φωσφατάσης τυροσίνης β/ζ). Η ερευνητική μας ομάδα έχει δείξει σε προηγούμενη μελέτη ότι η ικανότητα της PTN να επάγει κυτταρική μετανάστευση εξαρτάται από το σχηματισμό ενός λειτουργικού συμπλόκου που αποτελείται από τον RPTPβ/ζ και την ιντεγκρίνη ανβ3. Η πολυ-λειτουργική πρωτεΐνη νουκλεολίνη (NCL), η οποία υπερεκφράζεται στην επιφάνεια ενεργοποιημένων ενδοθηλιακών και καρκινικών κυττάρων και διαμεσολαβεί τις διεγερτικές δράσεις διαφόρων αγγειογενετικών παραγόντων, έχει επίσης προταθεί ως υποδοχέας χαμηλής συγγένειας για την ΡΤΝ, με άγνωστες όμως λειτουργίες. Στην παρούσα μελέτη δείξαμε, με τη χρήση μεθόδων ανοσοκατακρήμνισης-ανοσοαποτυπώματος, διπλού ανοσοφθορισμού και προσδιορισμού αλληλεπίδρασης λόγω εγγύτητας, ότι η PTN αλληλεπιδρά άμεσα με τη NCL. Η αλληλεπίδραση αυτή περιλαμβάνει πρόσδεση της αμινοτελικής περιοχής της ΡΤΝ (αμινοξέα: 16-24) στην κεντρική περιοχή της NCL (αμινοξέα: 308-645). Μείωση της έκφρασης της NCL με siRNA ή λειτουργική αναστολή της μεμβρανικής NCL από το πεπτίδιο 5(KPR)TASP ανέστειλε πλήρως την επαγόμενη από ΡΤΝ μετανάστευση ενδοθηλιακών κυττάρων. Με αφετηρία την παρατήρηση ότι ο εντοπισμός της NCL στην κυτταρική επιφάνεια ανιχνεύθηκε μόνο σε κύτταρα που εκφράζουν την ανβ3, και πραγματοποιώντας πειράματα ανοσοφθορισμού και βιοχημικές μελέτες σε κύτταρα με γενετικά τροποποιημένη έκφραση των υπό μελέτη μορίων, δείξαμε ότι ο εντοπισμός της NCL στην πλασματική μεμβράνη εξαρτάται από τη φωσφορυλίωση της β3 στην τυροσίνη 773 μέσω ενεργοποίησης του RPTPβ/ζ και της c-src. Καθοδικά της ανβ3, η PI3K συμμετέχει σε αυτή τη δράση. Ο VEGF165 που επίσης επάγει το μεμβρανικό εντοπισμό της NCL, δρα μέσω δέσμευσης στον RPTPβ/ζ και ενεργοποίησης του σηματοδοτικού μονοπατιού RPTPβ/ζ/c-src/ανβ3. Η περιοχή δέσμευσης στους υποδοχείς VEGFR-1 και VEGFR-2 ή η περιοχή δέσμευσης στην ηπαρίνη στο μόριο του VEGF165 δεν εμπλέκονται στον επαγόμενο από VEGF165 εντοπισμό της NCL στην κυτταρική μεμβράνη. Εκτός από την PI3K, στη δράση του VEGF165 καθοδικά της ανβ3 εμπλέκεται και η κινάση p38, η ενεργοποίηση της οποίας είναι ανεξάρτητη από τον RPTPβ/ζ και τη φωσφορυλίωση της β3 στις τυροσίνες 773 ή 785, και φαίνεται να ανήκει σε μονοπάτι που ενεργοποιείται παράλληλα και που παραμένει αδιευκρίνιστο. Μηχανιστικά, η NCL βρέθηκε να αλληλεπιδρά άμεσα με την ανβ3, τον RPTPβ/ζ, τον VEGF165 και τον VEGFR-2, αλλά επηρεάζει τον ενδοκυτταρικό εντοπισμό μόνο του RPTPβ/ζ και της PTN. Θετική συσχέτιση παρατηρήθηκε ως προς την έκφραση της μεμβρανικής NCL και της ανβ3 σε μικροσυστοιχίες ιστών προερχόμενων από ανθρώπινα γλοιοβλαστώματα. Τέλος, βρέθηκε ότι το μονοκλωνικό αντίσωμα anti-C23 και τα πεπτίδια που στοχεύουν τη μεμβρανική NCL, 5(KPR)TASP, ΗΒ-19 και Nucant 6L, ανέστειλλαν σημαντικά τη μετανάστευση κυττάρων που εκφράζουν ανβ3, ενώ είχαν μικρή ή καθόλου δράση στη μετανάστευση κυττάρων που δεν εκφράζουν ανβ3 ή υπερεκφράζουν μετάλλαγμα της β3 με αντικατάσταση της κυτταροπλασματικής τυροσίνης 773 σε φαινυλαλανίνη. Συνολικά, από τα αποτελέσματα της παρούσας διατριβής προκύπτει ότι η έκφραση της ανβ3 και η φωσφορυλίωση της β3 στην τυροσίνη 773 καθορίζουν τον εντοπισμό της NCL στην κυτταρική επιφάνεια, καθοδικά του σηματοδοτικού μονοπατιού RPTPβ/ζ/c-src που συμμετέχει στην κυτταρική μετανάστευση που επάγεται τόσο από την ΡΤΝ, όσο και από τον VEGF165. Επίσης, φαίνεται ότι η έκφραση της ανβ3 θα μπορούσε να χρησιμοποιηθεί ως βιοδείκτης για τη χρήση ανταγωνιστών της μεμβρανικής NCL ως αντικαρκινικών παραγόντων. / Pleiotrophin (PTN) is a growth factor that plays a significant role on tumor growth and angiogenesis. Several receptors interact with PTN and mediate its biological actions, such as N-syndecan, anaplastic lymphoma kinase (ALK) and receptor protein tyrosine phosphatase beta/zeta (RPTPβ/ζ). Our group has previously shown that the ability of PTN to stimulate migratory responses depends on the formation of a functional complex consisting of RPTPβ/ζ and integrin ανβ3. The multifunctional protein nucleolin (NCL), which is over-expressed on the surface of activated endothelial and tumor cells and mediates the stimulatory actions of several angiogenic factors, has been also suggested as a low affinity receptor for PTN, however with unknown functions. In the present study, by using immunoprecipitation/Western blot analyses, double immunofluorescence and proximity ligation assays, we showed that PTN directly interacts with NCL. This interaction involves binding of the amino-terminal domain of PTN (amino acids: 16-24) to the central domain of NCL (amino acids: 308-645). Down-regulation of NCL by siRNA or blockage of cell surface NCL by its ligand 5(KPR)TASP completely abolished PTN-induced endothelial cell migration. Based on the observation that cell surface NCL localization was detected only in cells expressing ανβ3 and by performing immunofluorescence and biochemical studies in cells with genetically altered expression of the studied molecules, we demonstrated that cell surface NCL localization depends on the phosphorylation of β3 at Tyr773 through RPTPβ/ζ and c-src activation. Down-stream of ανβ3, PI3K activity is required for cell surface NCL localization. VEGF165 that also induces cell surface NCL localization acts through binding to RPTPβ/ζ and activation of the RPTPβ/ζ/c-src/ανβ3 signaling pathway. The receptor or the heparin binding sites on the VEGF165 molecule do not seem to be involved in this VEGF165 action. Apart from PI3K, in VEGF165-induced cell surface NCL localization, p38 that lays down-stream of ανβ3, is also involved. Activation of p38 is independent of RPTPβ/ζ and β3 Tyr773 or Tyr785 phosphorylation, and seems to belong to a parallel signaling pathway that remains unclear. Mechanistically, NCL was found to directly interact with ανβ3, RPTPβ/ζ, VEGF165 and VEGFR-2, but only affects the intracellular localization of RPTPβ/ζ and PTN. Positive correlation of cell surface NCL and ανβ3 expression was observed in human glioblastoma tissue arrays. Finally, the monoclonal antibody anti-C23 and the peptides targeting cell surface NCL, 5(KPR)TASP, HB-19 and Nucant 6L, significantly inhibited migration of cells expressing ανβ3 in the presence of serum, while they had a minor or no effect on cells lacking ανβ3 or over-expressing mutant β3 with replacement of cytoplasmic tyrosine 773 to phenylalanine. Collectively, these data suggest that ανβ3 expression and β3 phosphorylation at Tyr773 downstream of the RPTPβ/ζ/c-src signaling cascade determines the cell surface localization of NCL, which is required for cell migration induced by both PTN and VEGF165. Moreover, expression of ανβ3 could be used as a biomarker for the use of cell surface NCL antagonists as anticancer agents.

Η διατριβή αφορά την ανάπτυξη και υλοποίηση ενός τετραδιάστατου, διακριτού μοντέλου προσομοίωσης της συμπεριφοράς καρκινικών κυτταρικών συστημάτων σε ελεύθερη ανάπτυξη και της απόκρισής τους σε χημειοθεραπευτική ή και ακτινοθεραπευτική αγωγή. Υλοποιήθηκαν δύο εκδοχές του μοντέλου: η χωρική και η μη χωρική προσέγγιση. Η χωρική προσέγγιση αναφέρεται στην τετραδιάστατη προσομοίωση συμπαγών όγκων. Η μη χωρική προσέγγιση βρίσκει εφαρμογή στην περίπτωση μη συμπαγών όγκων, καθώς και συμπαγών όγκων, όταν δεν δίνεται έμφαση στη χωρική εξέλιξή τους. Η ερευνητική εργασία έχει επικεντρωθεί σε τρεις τύπους καρκινικών όγκων: καρκίνος του μαστού, καρκίνος του πνεύμονα και πολύμορφο γλοιοβλάστωμα και σε θεραπευτικά σχήματα χορήγησης των σκευασμάτων: επιρουβικίνη (epirubicin), τεμοζολομίδη (temozolomide), σισπλατίνη (cisplatin), γεμσιταμπίνη (gemcitabine), βινορελμπίνη (vinorelbine) και δοσεταξέλη (docetaxel). Σκοπός της εργασίας είναι η ανάπτυξη ενός εργαλείου για την αξιόπιστη υποστήριξη ιατρών στη λήψη αποφάσεων σχετικά με την επιλογή θεραπευτικών σχημάτων και την εξατομικευμένη βελτιστοποίηση της θεραπευτικής αγωγής. Η αφετηρία είναι η μοντελοποίηση του κυτταρικού κύκλου και των πιθανών μεταβάσεων μεταξύ των καταστάσεων που μπορεί να βρεθεί ένα κύτταρο. Το μοντέλο βασίζεται στην υπόθεση ότι ο καρκινικός όγκος διατηρείται από μια συγκεκριμένη κατηγορία κυττάρων, τα καρκινικά βλαστικά κύτταρα (cancer stem cells), και έχει επεκταθεί ώστε να περιλαμβάνει σε μεγαλύτερη λεπτομέρεια διάφορους βιολογικούς μηχανισμούς σε μοριακό (πχ. εκφράσεις γονιδίων) και κυτταρικό επίπεδο. Ο μηχανισμός δράσης, η φαρμακοκινητική και η φαρμακοδυναμική των θεωρούμενων σκευασμάτων έχουν μελετηθεί βιβλιογραφικά και έχουν ενσωματωθεί στο μοντέλο. Επίσης, το μοντέλο έχει αναπτυχθεί ώστε να λαμβάνει υπόψη του την κλινική εικόνα του ασθενούς με χρήση εξατομικευμένων κλινικών δεδομένων, όπως απεικονιστικά δεδομένα (π.χ. CT, MRI, PET), ιστοπαθολογικά δεδομένα (π.χ. τύπος όγκου, βαθμός διαφοροποίησης) και μοριακά δεδομένα (π.χ. έκφραση γονιδίων). Στα πλαίσια της διατριβής πραγματοποιούνται έλεγχοι αξιοπιστίας και εκτενείς παραμετρικές μελέτες για την αποσαφήνιση της ευαισθησίας του μοντέλου στη διακύμανση των παραμέτρων του τόσο κατά την προσομοίωση της ελεύθερης ανάπτυξης όσο και κατά την εφαρμογή της χημειοθεραπευτικής αγωγής. Η ποσοτική αξιολόγηση, προσαρμογή και βελτιστοποίηση του μοντέλου πραγματοποιείται στα πλαίσια των ευρωπαϊκών ερευνητικών προγραμμάτων ACGT (Advancing Clinicogenomic Trials on Cancer, FP6-2005-IST-026996), ContraCancrum (Clinically Oriented Cancer Multilevel Modelling, FP7-ICT-2007-2-223979) και P-medicine (From data sharing and integration via VPH models to Personalized medicine, FP7-ICT-2009-6-270089) μέσω της αξιοποίησης πραγματικών κλινικών δεδομένων. Στην παρούσα διατριβή παρουσιάζονται τα αποτελέσματα της προσαρμογής του μοντέλου σε κλινικά δεδομένα του καρκίνου του μαστού, του καρκίνου του πνεύμονα και του πολύμορφου γλοιοβλαστώματος. Επιπλέον, διάφορες εκδόσεις του μοντέλου έχουν αξιοποιηθεί για ‘την επάνδρωση’ μιας ευρωπαϊκής βάσης μοντέλων για τον καρκίνο, που υλοποιείται στα πλαίσια του ευρωπαϊκού ερευνητικού προγράμματος TUMOR (Transatlantic Tumour Model Repositories, FP7-ICT-2009-5-247754). Το μοντέλο υλοποιείται σε γλώσσα προγραμματισμού C++. / In the present thesis, a clinically oriented, multiscale, discrete simulation model of cancer free growth and response to chemotherapy and/or radiotherapy is presented and investigated. Two versions of the model have been implemented: the spatial and the non spatial approach. The spatial model concerns the spatiotemporal evolution of solid tumours, whereas the non spatial model can be applied in the case of non solid cancers, as well as solid tumours, when no emphasis is put on the spatial features of a tumour evolution. The research work has been focused on the paradigms of early breast cancer treated with the single agent epirubicin, primary lung cancer treated with various combinations of cisplatin, gemcitabine, vinorelbin and docetaxel and glioblastoma multiforme treated with combined modality treatment using radiation and chemotherapy with temozolomide. The goal is to end up with a reliable simulation system able to assist clinicians in selecting the most appropriate therapeutic pattern, extracted from several candidate therapeutic schemes in the context of patient individualized treatment optimization. The model incorporates the biological mechanisms of cell cycling, quiescence, recruitment (reentry into the cell cycle), differentiation and death. It is based on the well documented assumption that tumour sustenance is due to the existence of cancer stem cells, i.e. cells which have the ability to preserve their own population, as well as give birth to cells that follow the path towards terminal differentiation. Furthermore, the mechanism of action, pharmacokinetics and pharmacodynamics of all considered agents have been bibliographically studied and incorporated into the model. Finally, the model has been developed to support and incorporate individualized clinical data such as imaging data (e.g. CT, MRI, PET slices, possibly fused), including the definition of the tumour contour and internal tumour regions (proliferating, necrotic), histopathologic (e.g., type of tumour) and genetic data (e.g., gene expression). An exhaustive and in-depth examination of the model behaviour with respect to the variation of its input parameters has been performed, in order to determine the impact of its parameters, guarantee a biologically relevant virtual tumour behaviour and enlighten aspects of the interplay and possible interdependencies of the biological mechanisms modeled. Finally, the model has been quantitativily validated and adaptated in the framework of the ACGT (Advancing Clinicogenomic Trials on Cancer, FP6-2005-IST-026996), ContraCancrum (Clinically Oriented Cancer Multilevel Modelling, FP7-ICT-2007-2-223979) and P-medicine (From data sharing and integration via VPH models to Personalized medicine, FP7-ICT-2009-6-270089) European Commission-funded projects by exploiting real clinical data. In the present thesis, the clinical adaptation of the model focuses on breast cancer, lung cancer and glioblastoma multiforme clinical cases. Moreover, various versions of the model have been uploaded to the EU cancer model repository developed by the TUMOR (Transatlantic Tumour Model Repositories, FP7-ICT-2009-5-247754) European Commission-funded project. The model has been developed in the C++ programming language.