Οι όγκοι εγκεφάλου του ανθρώπου είναι φαινοτυπικά και γονοτυπικά ετερογενείς. Υπάρχουν σημαντικά κενά στην κατανόηση των μοριακών οδών που εμπλέκονται στην γένεση και ανάπτυξη των νεοπλασμάτων αυτών, καθώς και στη βιολογική και κλινική συμπεριφορά τους. Δεδομένου ότι: α) υπάρχει ένας αυξανόμενος όγκος πληροφοριών σχετικά με την εμπλοκή των υποδοχέων νευροτροφινών Trks (υποδοχείς κινάσης τυροσίνης) στην παθογένεια των νεοπλασμάτων του ΚΝΣ, β) οι νευροτροφίνες μπορούν να ρυθμίζουν τη γονιδιακή έκφραση στο νευρικό σύστημα μέσω του μεταγραφικού παράγοντα STAT-5 με μηχανισμό ανεξάρτητο της ενεργοποίησης της κινάσης JAK-2, γ) η οδός μεταγωγής σήματος JAK-2/STAT-5 ενεργοποιείται από την ερυθροποιητίνη (Epo) (μέσω δέσμευσής της με τον υποδοχέα της EpoR) η οποία πρόσφατα έχει θεωρηθεί ως παράγοντας-κλειδί της αύξησης των όγκων λόγω των αντιαποπτωτικών και αγγειογενετικών ιδιοτήτων και δυνητικός στόχος ογκολογικών θεραπευτικών στρατηγικών, δ) η Epo διαντιδρά με τον παράγοντα αγγειογένεσης VEGF ενδυναμώνοντας την αγγειοδραστικότητά του και συχνά οι δύο αυτοί αναπτυξιακοί παράγοντες συνεκφράζονται, ε) ερευνητικά δεδομένα υποδεικνύουν ένα δυνητικό ρόλο του άξονα VEGF/JAK-2/ STAT-5 στην αγγειογένεση στον καρκίνο και στ) σε πολλά νεοπλάσματα, τα κύτταρα του όγκου καθώς και τα μακροφάγα του στρώματος εκφράζουν τους παράγοντες λεμφαγγειογένεσης VEGF-C και VEGF-D οι οποίοι μέσω του υποδοχέα τους VEGFR-3 (υποδοχέας κινάσης τυροσίνης) έχει βρεθεί ότι προάγουν την αγγειογένεση στα νεοπλάσματα αυτά, ο στόχος της παρούσας εργασίας είναι η μορφολογική μελέτη της έκφρασης των υποδοχέων κινάσης τυροσίνης Trks (υποδοχείς νευροτροφινών) και VEGFR-3 και η συσχέτισή τους με την οδό μεταγωγής σήματος EpoR/ JAK-2/ STAT-5 στα νεοπλάσματα του εγκεφάλου στον άνθρωπο. Για την ανίχνευση των Trks, EpoR, JAK-2, STAT-5 και VEGFR-3, χρησιμοποιήθηκε η ανοσοϊστοχημική μέθοδος σε διαδοχικές τομές ιστού πάχους 4μm, μονιμοποιημένου σε φορμόλη και εγκλεισμένου σε παραφίνη. Χρησιμοποιήθηκαν ειδικά αντισώματα έναντι των προς μελέτη πρωτεϊνών. Εξετάσθηκαν συνολικά 92 όγκοι εγκεφάλου (50 αστροκυτώματα: 5 πιλοκυτταρικά αστροκυττώματα WHO grade I, 6 διάχυτα αστροκυττώματα WHO grade II, 10 αναπλαστικά αστροκυττώματα. WHO grade III και 29 πολύμορφα γλοιοβλαστώματα. WHO grade IV, 8 ολιγοδενδρογλοιώματα, 6 επενδυμώματα, 5 μυελοβλαστώματα και 23 μηνιγγιώματα). Επιπλέον, στη μελέτη συμπεριλήφθηκαν τομές ιστού φυσιολογικού εγκεφάλου. Στην παρούσα εργασία, η πλειονότητα των αστροκυττωμάτων ανεξαρτήτως βαθμού κακοήθειας, έδειξε μέτρια έως έντονη κυτταροπλασματική ανοσοδραστικότητα για τους υποδοχείς TrkA (57%), TrkB (56%) και TrkC (46%). Όλα τα ολιγοδενδρογλοιώματα και τα επενδυμώματα που εξετάσθηκαν ήταν αρνητικά για τους υποδοχείς Trk ενώ έκφραση των υποδοχέων ανιχνεύθηκε σε μικρό ποσοστό των μυελοβλαστωμάτων. Στις ανοσοθετικές περιοχές των όγκων, το τοίχωμα των αγγείων ήταν έντονα θετικό για τον υποδοχέα TrkB. Σε ένα σημαντικό ποσοστό αστροκυττωμάτων (41%), επενδυμωμάτων (33%) και μηνιγγιωμάτων (48%) ανιχνεύθηκε έκφραση του EpoR, ενώ τα ολιγοδενδρογλοιώματα και τα μυελοβλαστώματα που εξετάσθηκαν ήταν αρνητικά. Συνέκφραση των JAK-2/STAT-5 ανιχνεύθηκε στο 39% των αστροκυττωμάτων, στο 43% των ολιγοδενδρογλοιωμάτων, στο 50% των επενδυμωμάτων και σε όλα (100%) τα μυελοβλαστώματα που συμπεριλήφθηκαν στη μελέτη. Η πλειονότητα των μηνιγγιωμάτων έδειξε ασθενή έως μηδενική έκφραση των πρωτεινών JAK-2 και STAT-5. Σε κάποιους όγκους, ανιχνεύθηκε έκφραση της πρωτείνης STAT-5 ενώ ήταν αρνητικοί για την κινάση JAK-2. Επίσης, βρέθηκαν όγκοι JAK-2- ανοσοθετικοί/ EpoR-ανοσοαρνητικοί. Στα ενδοθηλιακά κύτταρα των αγγείων των όγκων ανιχνεύθηκε έκφραση των EpoR, JAK-2 και/ή STAT-5. Η μελέτη της έκφρασης του VEGFR-3 έδειξε την καθολική σχεδόν έκφραση του υποδοχέα στο ενδοθήλιο των αγγείων, στους όγκους εγκεφάλου που εξετάσθηκαν, καθώς και στο τοίχωμα μεγαλύτερων αγγείων εκτός της περιοχής των όγκων. Επίσης, σε κάποιες περιπτώσεις, παρατηρήθηκε έκφραση του υποδοχέα σε νεοπλασματικά κύτταρα. Στα αστροκυτταρικά γλοιώματα, η έκφραση των pan-Trk, TrkB και TrkC σχετίζεται στατιστικά σημαντικά με την έκφραση STAT-5 ενώ δεν υπάρχει στατιστικά σημαντική συσχέτιση της έκφρασης του υποδοχέα TrkA με την έκφραση των JAK-2 και STAT-5, καθώς και της έκφρασης των Trks με την έκφραση της κινάσης JAK-2. Στα αστροκυτταρικά γλοιώματα, η έκφραση JAK-2 σχετίζεται στατιστικά σημαντικά με την έκφραση STAT-5, ενώ η έκφραση των JAK-2 και STAT-5 δεν σχετίζεται σημαντικά με την έκφραση EpoR. Στα επενδυμώματα υπάρχει στατιστικά σημαντική συσχέτιση μεταξύ της έκφρασης JAK-2, STAT-5 και EpoR. Επίσης, στα μυελοβλαστώματα υπάρχει στατιστικά σημαντική συσχέτιση μεταξύ της έκφρασης JAK-2 και STAT-5. Σε σημαντικό ποσοστό των εξετασθέντων όγκων –ιδιαίτερα των γλοιωμάτων- συνεκφράζονται οι υποδοχείς EpoR και VEGFR-3 στο ενδοθήλιο και στα λεία μυικά κύτταρα των αγγείων. Συγκεκριμένα, έκφραση και των δύο υποδοχέων στο τοίχωμα των αγγείων του όγκου, ανιχνεύθηκε, στο 58% των αστροκυτταρικών γλοιωμάτων, στο 67% των ολιγοδενδρογλοιωμάτων, στο 50% των επενδυμωμάτων, στο 20% των μυελοβλαστωμάτων και στο 33% των μηνιγγιωμάτων. Επίσης συνέκφραση των υποδοχέων TrkB και VEGFR-3 στο ενδοθήλιο των αγγείων των όγκων ανιχνεύθηκε στο 57% των αστροκυτταρικών γλοιωμάτων. Η έκφραση στο ενδοθήλιο των αγγείων των όγκων (α) του υποδοχέα TrkB στην πλειονότητα των TrkB-ανοσοθετικών όγκων, (β) των EpoR, JAK-2 και/ή STAT-5 σε αρκετούς όγκους ανεξάρτητα της ανοσοθετικότητας των νεοπλασματικών κυττάρων για τις πρωτεΐνες αυτές και (γ) του VEGFR-3 σχεδόν σε όλους του εξετασθέντες όγκους, οδηγεί στο συμπέρασμα ότι οι παραπάνω παράγοντες πιθανόν συνεργάζονται στην αγγειογενετική διαδικασία στους όγκους εγκεφάλου. Η παρούσα μελέτη απέδειξε την παρουσία των: Trks, EpoR, JAK-2, STAT-5 και VEGFR-3 σε σημαντικό ποσοστό των όγκων εγκεφάλου στον άνθρωπο. Είναι απαραίτητο να διενεργηθούν λειτουργικές μελέτες των σηματοδοτικών οδών που προκύπτουν από την ενεργοποίηση των Trks, EpoR και VEGFR-3, προκειμένου να αποσαφηνισθούν οι πιθανές διαντιδράσεις αυτών των οδών στη διαδικασία της ογκογένεσης, γεγονός που θα μπορούσε να οδηγήσει στο σχεδιασμό νέων θεραπευτικών στρατηγικών για την αποτελεσματική αντιμετώπιση των όγκων εγκεφάλου στον άνθρωπο. / Brain tumors are phenotypically and genotypically heterogeneous. Significant gaps exist in current understanding of the molecular pathways involved in the genesis, progression, and biological and clinical behavior of brain tumors. Considering that : a) there is a growing amount of evidence implicating the neurotophin receptors Trks (receptor tyrosine kinases) in the pathogenesis of CNS tumors, b) neurotrophins may regulate neuronal gene expression via transcription factor STAT-5 in a JAK-2 independent manner, c) the JAK-2/STAT-5 signaling pathway is activated by Epo (recently characterized as a key factor for tumor growth) through its receptor EpoR, d) Epo is known to interact synergistically with vascular endothelial growth factor (VEGF), a potent angiogenic factor, and enhance its vascular activity, and these two growth factors, are often co-expressed, e) recent data suggest a potential role for a VEGF/JAK-2/STAT-5 axis in tumor angiogenesis and f) in many tumors, VEGF-C and -D are produced by tumor cells as well as by tumor-associated macrophages and through their receptor VEGFR-3 are involved in tumor angiogenesis and growth, the aim of this thesis is the morphological study of the expression patterns of the receptor tyrosine kinases Trks (neurotrophin receptors) and VEGFR-3 and their correlation with the EpoR/ JAK-2/ STAT-5 signaling pathway in human brain tumors. Immunohistochemistry was performed on formalin-fixed, paraffin-embedded, 4μm thick serial sections using the anti-Mouse/ Rabbit Poly HRP IHC Detection kit (CHEMICON International, Inc.). Antibodies against the Trk receptors, EpoR, JAK-2, STAT-5 and VEGFR-3, were used. A total of 92 brain tumors (50 astrocytic gliomas: 5 pilocytic astrocytomas; WHO grade I, 6 diffuse fibrillary astrocytomas; WHO grade II, 10 anaplastic astrocytomas; WHO grade III and 29 glioblastomas multiforme; WHO grade IV, 8 oligodendrogliomas, 6 ependymomas, 5 medulloblastomas, and 23 meningiomas) were included in this study. Normal human brain tissue was obtained postmortem (2 males). The present study demonstrated moderate to strong, granular cytoplasmic immunoreactivity in the majority of astrocytomas, for TrkA (57%), TrkB (56%) and TrkC receptors (46%), independently of grade. All the oligodendrogliomas and the ependymomas examined, were Trk immunonegative while a small percentage of medulloblastomas exhibited Trk immunopositivity. The endothelium of tumor vessels, in the immunopositive areas of the tumors, showed conspicuous immunoreactivity for TrkB receptor. A significant percentage of astrocytomas (41%), ependymomas (33%) and meningiomas (48%) displayed EpoR immunoreactivity. Oligodendrogliomas and medulloblastomas were EpoR- immunonegative. JAK-2/STAT-5 co-expression was detected in 39% of astrocytomas, 43% of oligodendrogliomas, 50% of ependymomas and in all (100%) the medulloblastomas examined. In contrast, most of the meningiomas showed weak or no immunoreactivity for JAK-2 and STAT-5 proteins. Some tumors exhibited STAT-5 immunoreactivity being JAK-2-immunonegative and others were JAK-2-immunopositive being EpoR- immunonegative. In some tumors - independently of EpoR immunoreactivity in tumors cells- the endothelium of tumor capillaries as well as florid angioproliferative changes and/or proliferations of smooth muscle cells showed conspicuous immunoreactivity for EpoR. Furthermore, endothelial cells of some tumor vessels showed JAK-2 and/or STAT-5 immunoreactivity. The present study demonstrated the almost catholic VEGFR-3 expression in the endothelium of tumor vessels in the brain tumor specimens examined, as well as in the smooth muscle cells in peritumoral vessels. In some tumors, the tumor cells expressed VEGFR-3receptor. In astrocytic gliomas, pan-Trk, TrkB and TrkC expression was significantly correlated with STAT-5 expression but not with JAK-2 whereas TrkA expression was not significantly correlated with either JAK-2 or STAT-5 expression. In astrocytic gliomas, JAK-2 expression was significantly correlated with STAT-5 expression whereas JAK-2 and STAT-5 expression were not significantly correlated with EpoR expression. In ependymomas, strong relationship between JAK-2, STAT-5 and EpoR expression was confined. Furthermore, in medulloblastomas, strong relationship between JAK-2 and STAT-5 expression was detected. A significant percentage of astrocytomas (58%), oligodendrogliomas (67%), ependymomas (50%), medulloblastomas (20%) and meningiomas (33%), displayed EpoR and VEGFR-3 co-expression in tumor vessels. Additionally, TrkB and VEGFR-3 co-expression was detected in the endothelium of tumor capillaries in 57% of the astrocytomas examined. The above results indicate the existence of a ligand (other than Epo)-dependent or independent JAK-2 activation that leads to the constitutive activation of STAT-5 as well as the existence of at least one mechanism, other than the Trk - dependent gene induction by STAT-5 that results to the latter’s constitutive activation in these tumors. Furthermore, the finding of EpoR, JAK-2 and/or STAT-5 immunoreactivity in endothelial cells of tumor vessels, supports the ongoing notion of an angiogenic role of Epo in tumor neovascularization. The presence of TrkB, EpoR, JAK-2, STAT-5 and VEGFR-3 in the endothelium of tumor vessels in the brain tumors specimens included in this study, implicate these factors as possible critical players in the process of angiogenesis. The present study demonstrates the expression of Trks, EpoR, JAK-2, STAT-5 and VEGFR-3 in a significant percentage of human brain tumors. Functional studies of the Trks, EpoR and VEGFR-3-activated signaling pathways, are necessary in order to clarify the meaning of a possible cross-talking between these pathways in the process of oncogenesis, the deep understanding of which, could lead to innovative new strategies for drug targeting to human brain tumors.

Το γλοιοβλάστωμα αποτελεί έναν από τους πιο θανατηφόρους τύπους καρκίνου για τον άνθρωπο δεδομένου ότι ο μέσος όρος επιβίωσης είναι 12-15 μήνες. Η συμβατική θεραπεία με τα κλασσικά χημειοθεραπευτικά σχήματα δεν έχει αποδώσει ιδιαιτέρως θετικά αποτελέσματα. Η εξέλιξη της μοριακής βιολογίας έχει «ρίξει φως» στην διερεύνηση και κατανόηση αρκετών μηχανισμών της κυτταρικής λειτουργίας που αφορούν τη μετανάστευση, τον πολλαπλασιασμό και την απόπτωση των κυττάρων. Στο γλοιοβλάστωμα έχει παρατηρηθεί αυξημένη δραστηριότητα πολλών υποδοχέων αυξητικών παραγόντων στην επιφάνεια των κυττάρων όπως ο EGFR, ο PDGFR και ο VEGFR. Ταυτόχρονα, υπάρχουν και άλλα μόρια επιφανείας με ιδιαίτερο ενδιαφέρον όπως οι ιντεγκρίνες λόγω της ιδιότητας τους να καθορίζουν τη μετανάστευση. Στη νέα εποχή των αναστολέων κινάσης τυροσίνης οι οποίοι δρουν έναντι των υποδοχέων των αυξητικών παραγόντων και θεωρούνται πολλά υποσχόμενα μικρά μόρια, πρέπει να διερευνηθεί αν μπορούν να έχουν θέση στην αντιμετώπιση του γλοιοβλαστώματος. Αρχικά έγινε εκτίμηση της επίδρασης των αναστολέων sunitinib και lapatinib ξεχωριστά αλλά και σε συνδυασμό, στο πολλαπλασιασμό και στο κυτταρικό θάνατο των κυττάρων γλοιβλαστώματος U87 και M059K σε συγκεντρώσεις 0,01, 0,1, 1 και 10μΜ. Για το σκοπό αυτό χρησιμοποιήθηκε η μέθοδος του 3-[4,5-dimethylthiazol-2-yl]-2,5 διμεθυλθειαζόλο βρωμιδίου και το ολοκληρωμένο σύστημα ανίχνευσης αννεξίνης V/προπιδίου (annexin V/propidium iodide), αντίστοιχα. Για τη διαδικασία της μετανάστευσης εφαρμόστηκε η μέθοδος μελέτης του χημειοτακτισμού. Η έκφραση μεταλλοπρωτεϊνασών MM-2 και MMP-9 εκτιμήθηκε με τη μέθοδο του ζυμογραφήματος. Περαιτέρω έγινε διερεύνηση της πιθανής εμπλοκής των φαρμάκων στο σχηματισμό συμπλόκων EGFR-υπομονάδα β1 ιντεγκρινών, PDGFR- υπομονάδα β3 ιντεγκρινών και VEGFR- υπομονάδα β3 ιντεγκρινών. Η μελέτη της δημιουργίας των συμπλόκων των β υπομονάδων των ιντεγκρινών με τους υποδοχείς αυξητικών παραγόντων έγινε χρησιμοποιώντας τη μέθοδο της ανοσοκατακρήμνισης και της ανάλυσης κατά Western. Τα αποτελέσματα επαληθεύτηκαν και με τη μέθοδο του ανοσοφθορισμού. Με την ίδια μέθοδο μελετήθηκε και η επίδραση των φαρμάκων στη φωσφορυλιωμένη μορφή της FAK. Τα πειραματικά δεδομένα έδειξαν ότι και οι δύο αναστολείς sunitinib και lapatinib, μείωσαν τον πολλαπλασιασμό με δοσοεξαρτώμενο τρόπο 48 ώρες μετά την προσθήκη τους στα κύτταρα είτε μεμονωμένα είτε σε συνδυασμό. Τα αποτελέσματα της αναστολής του πολλαπλασιασμού συμβάδιζαν με τα αποτελέσματα της απόπτωσης όπου το ποσοστό των αποπτωτικών κυττάρων αυξήθηκε. Περαιτέρω η μετανάστευση των κυττάρων εμφανίστηκε μειωμένη μετά την προσθήκη των φαρμάκων είτε μεμονωμένα είτε σε συνδυασμό. Η έκφραση των μεταλλοπρωτεϊνασών MMP-2 και MMP-9 δεν επηρεάστηκε στα κύτταρα U87 μετά την προσθήκη και των 2 φαρμάκων. Αντίθετα, στα κύτταρα M059K το sunitinib αλλά και ο συνδυασμός του με το lapatinib ελαττώσαν την έκφραση των MMPs 48 ώρες μετά τη προσθήκη τους στο θρεπτικό μέσο. Στη συνέχεια βρέθηκε ότι το lapatinib μπορεί να αναστείλει την δημιουργία συμπλόκου του EGFR με την υπομονάδα β1 των ιντεγκρινών, έως και 30 λεπτά μετά την προσθήκη του φαρμάκου στα κύτταρα. Αντίστοιχα το sunitinib μπορεί να αναστέλλει το σχηματισμό συμπλόκου της υπομονάδας β3 των ιντεγκρινών με τον VEGFR εντός δύο ωρών από την προσθήκη των φαρμάκων, χωρίς επίδραση όμως στον σχηματισμό των συμπλόκων PDGFR – υπομονάδα β3 ιντεγκρίνης. Αυτά τα αποτελέσματα επιβεβαιώθηκαν και με την χρήση ανοσοφθορισμού. Συνοψίζοντας, οι δύο αναστολείς κινάσης τυροσίνης, sunitinib και lapatinib κατάφεραν να επιδείξουν αξιόλογα αποτελέσματα στις παραμέτρους του πολλαπλασιασμού και της μετανάστευσης των κυττάρων γλοιοβλαστώματος. Τα αποτελέσματα της έρευνας είναι πρωτοποριακά διότι, αναφορικά με την μετανάστευση στο γλοίωμα, αυτή φαίνεται να αναστέλλεται αποτελεσματικότερα με τον συνδυασμό των δύο φαρμάκων πιθανά μέσω του μηχανισμού διαταραχής της δημιουργίας του συμπλόκου ιντεγκρίνης- υποδοχέας αυξητικού παράγοντα. / Glioblastoma is considered to be one of the most fatal among the malignancies in human with median survival between 12-15 months. The conventional chemotherapy cannot change the fate of these patients. Recent advances in molecular biology have shed light in the various mechanisms recruited by malignant cells in order to proliferate, metastasize and escape apoptosis. Studies in glioblastoma have already shown up-regulation in the function of tyrosine kinase receptors such as EGFR, PDGFR and VEGFR. Besides this, in the more recent years, research supports the significant role of integrins in the migration process of glioblastoma cells. In the new era of tyrosine kinase inhibitors (TKIs), where their main mechanism of action is by blocking various growth factor receptors, it has to be determined a possible contribution in the fight against glioblastoma. Initially, it was estimated a possible effect of sunitinib and lapatinib applied either alone or in combination, on U87 and M059K glioma cells’ proliferation and apoptosis using doses of 0,01 μM, 0,1 μM, 1μM and 10 μM. The proliferation was estimated using the 3-[4,5-dimethylthiazol-2-yl]-2,5 dimethyltetrazolium bromide assay and apoptosis using annexin V/propidium iodide detection assay. Migration assay was performed using Boyden chamber assay. The release of MMP-2 and MMP-9 into the culture medium of U87 and M059K cells was measured by zymography. Furthermore, a possible implication of the tested agents in the formation of EGFR-integrin β1 complex, VEGFR-integrin β3 and PDGFR-integrin β3 complexes formation was studied. Immunoprecipitation and western blot analysis were used for studying the complex formation of EGFR, PDGFR and VEGFR with integrins. Validation of the results was made using immunofluorescence assay. Also, similar experiments were performed for the effect of sunitinib and lapatinib in FAK phosphorylation. The results showed that both tested agents decreased cell proliferation in a dose-dependent manner 48 h after their application in both cell lines either alone or in combination. The results in cell proliferation were in line with the increase in apoptotic cells after their treatment with the tested agents. Furthermore, the ability of U87 and M059K cells to migrate was inhibited either by each agent alone or in combination. Both agents did not affect MMP-2 and MMP-9 levels in U87 cells, however, MMPs levels were decreased in M059K cells, 48h after their treatment with sunitinib either alone or in combination with lapatinib. Additionally, a time course study for the effect of lapatinib on EGFR-integrin β1 complex revealed an inhibition in complex formation up to 30 min after agent application. Likewise, sunitinib inhibited complex formation of VEGFR-integrin β3 complex within 2h after its application without affecting PDGFR-integrin β3 complex. The previously-described interruption of complexes formation was confirmed with an immunofluorescence assay. Summarizing the results, sunitinib and lapatinib exerted significant effects on glioblastoma cell proliferation, apoptosis and migration. The preliminary results of the current study are the first to support the implication of a dual anti-EGFR/HER-2 agent, lapatinib and a multi-targeted agent, sunitinib in glioma cells migration, through a mechanism implying interruption of growth factor receptor - integrin complexes formation.