Dissertação (mestrado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro de Ciências Físicas e Matemáticas, Programa de Pós-Praduação em Química, Florianópolis, 2014 / Made available in DSpace on 2015-05-19T04:05:41Z (GMT). No. of bitstreams: 1 333308.pdf: 2483116 bytes, checksum: 9bc13a8ec635182c0a3f52919af77c62 (MD5) Previous issue date: 2014 / Muitos estudos têm sido realizados com o ácido desoxirribonucleico interagindo com pequenas moléculas, entre estas os compostos de coordenação que podem atuar como miméticos de enzimas presentes nos organismos vivos. Com essa finalidade, foram avaliados a clivagem e a interação do DNA com uma série de cinco compostos de Co2+ com ligantes N-doadores tetradentados: Co(TPA)Cl]ClO4, [Co(6-MeTPA)Cl]ClO4, [Co(6-Me2TPA)Cl]ClO4, [Co(BPQA)Cl]ClO4, e [Co(BQPA)Cl]ClO4. O DNA plasmidial pBSK II foi utilizado como modelo na técnica de eletroforese em gel de agarose. Foram realizados ensaios variando a concentração dos complexos para avaliar o efeito na atividade de clivagem, ensaios de cinética para comparar atividade com outros complexos da literatura, ensaios com inibidores de espécies reativas de oxigênio e ensaios com atmosfera de argônio com o intuito de verificar se o mecanismo de clivagem é hidrolítico ou oxidativo, ensaio com o ligante de sulco menor: distamicina e o ligante de sulco maior: verde de metila com o proposito de verificar a dependência da ligação com os sulcos e ensaios na presença de perclorato de lítio para verificar o efeito das interações eletrostáticas. Os cinco complexos são ativos frente a clivagem do DNA plasmidial, em concentrações na ordem de micromolar. Os complexos devem atuar por um mecanismo hidrolítico e são muito sensíveis ao efeito da força iônica. Nos ensaios cinéticos foram obtidos valores de kcat entre 0,98 h-1 a 6,02h-1, para pH 7,0 e valores de kcat entre 1,99 h-1 e 16,8 h-1 para pH 9,0, correspondendo a valores que aumentam a velocidade de reação na ordem de 108 a 109 comparados à hidrólise não catalisada do DNA. Também foram realizados ensaios com eletroforese com gel de poliacrilamida de alta resolução, como modelo utilizado foi uma sequência de 49 nucleotídeos. Foi verificado que os compostos [Co(6-MeTPA)Cl] e [Co(BPQA)Cl] clivam o DNA em todos os nucleotídeos formando produtos com terminal 3´-PO32-, sem gerar produtos típicos de mecanismos oxidativos.<br> / Abstract: Many studies have been conducted with the deoxyribonucleic acid interacting with small molecules, within them coordination compounds which may act as enzyme mimics in living organisms.For this purpose cleavage and interaction with DNA were evaluated for a series of five Co(II) compounds with tetradentate N-donor ligands: [Co(TPA)Cl]+, [Co(6-MeTPA)Cl]+, [Co(6-Me2TPA)Cl]+ [Co(BPQA)Cl]+ and [Co(BQPA)Cl]+. The plasmid DNA pBSK II was used as substrate in gel electrophoresis assays were performed varying the concentration of the complex, kinetic assays to assess DNA cleavage, trials with inhibitors of reactive oxygen species, trials with argon, assays with DNA groove binders and assays in the presence of lithium perchlorate to verify the effect of electrostatic interactions. The five complexes are active against the cleavage of plasmid DNA at concentrations on the order of micromolar.Complexes may act by a hydrolytic mechanism, are very sensitive to ionic strength effect. In kinetic experiments were obtained values of kcatbetween0,98 h-1to 6,02 h-1for pH 7.0 and values of kcat between 1,99 h-1to 16,8 h-1for pH9.0, corresponding to values that increase the reaction rate about108 to 109compared to spontaneous hydrolysis of DNA. Assays using high resolution polyacrylamide gel electrophoresis were made, the model used was a sequence of 49 nucleotides, it has been found that the compounds [Co (6-MeTPA) Cl] and [Co (BPQA) Cl] cleave DNA at all nucleotides forming products with 3'-PO32- termini without generating products of oxidative mechanism.

Dissertação (mestrado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro de Ciências Físicas e Matemáticas, Programa de Pós-Graduação em Química, Florianópolis, 2015. / Made available in DSpace on 2015-09-15T04:08:35Z (GMT). No. of bitstreams: 1 334289.pdf: 1843746 bytes, checksum: e5da958e00b18037414cca2111320c49 (MD5) Previous issue date: 2015 / O estudo de moléculas sintéticas ou biológicas que possam interagir e clivar o DNA de forma específica se faz essencial na busca por novas aplicações biotecnológicas, na descoberta de terapias antitumorais menos invasivas ou no auxílio a um melhor entendimento dos mecanismos de ação do DNA. O presente trabalho teve como objetivo investigar a interação e clivagem de DNA por três complexos binucleares de cobre, cuja síntese foi inspirada no sítio ativo da enzima catecol oxidase: [Cu2(2-X-4,6-bis(di-2-picolilamino)-1,3,5-triazina], onde X= cloro (1), butanodiamina (2) ou N-metilpirenilbutanodiamina (3), de modo a relacionar as alterações estruturais de 2 e 3 a possíveis ganhos na atividade em relação ao complexo 1. Complexos contendo centros binucleares de cobre são amplamente descritos na literatura como nucleases artificiais eficientes, dessa forma, a atividade catalítica dos complexos foi avaliada. Os complexos apresentaram bons resultados de clivagem de DNA plasmidial, sob condições brandas e tempos de reação moderados. As constantes catalíticas (kcat) apresentadas foram de 0,0611; 0,1526 e 0,1702 h-1 para 1, 2 e 3, respectivamente, indicando que a adição de butanodiamina e pireno está relacionado a um aumento na atividade dos complexos. Os valores de kM obtidos corroboram os valores de kcat observados e sugerem um aumento na afinidade DNA/complexo de 1 para 3, já que os valores decrescem conforme a relação 1 > 2 > 3. O mecanismo de clivagem parece ser de caráter misto, apesar de apresentar uma forte componente oxidativa, e ensaios com bloqueadores de sulco e de dicroísmo circular indicam que os três complexos têm preferência pelo sulco menor do DNA. Ensaios de clivagem direta de alta resolução, com sondas marcadas com fluoresceína (FAM), forneceram informações sobre o mecanismo de ação dos complexos no DNA e indicam que o complexo 2 é capaz de clivar de forma específica regiões do tipo hairpin.<br> / Abstract : The study of synthetic or biological molecules able to interact and cleave DNA in a specific way is essential in the search for new biotechnological applications, discovery of less invasive anti-tumor therapies or to help in the elucidation of the mechanisms of action toward DNA. The present work aimed to investigate the DNA interaction and cleavage by three copper(II) binuclear complexes, whose synthesis was inspired in the active site of the enzyme catechol oxidase: [Cu2(2-X-4,6-bis(di-2-picolylamino)-1,3,5-triazi ne], where X= chloro (1), diaminobutane (2) or N-methylpyrenyldiamino butane (3), trying to relate structural changes of 2 and 3 with possible activity gains in comparison to complex 1. Complexes containing a dinuclear center of copper are largely described as efficient synthetic nucleases in literature, thereby, the catalytic activity of the complexes was evaluated. The complexes showed good results for plasmid DNA cleavage under mild conditions and moderate time of reaction. The rate of cleavage reaction (kcat) was 0,0611; 0,1526 e 0,1702 h-1 for 1, 2 e 3, respectively, indicating that the addition of diaminobutane and pyrene shows activities gains for the complexes. kM values obtained corroborates kcat values observed and suggests an enhancement of complex/DNA affinities from 1 to 3, since the values decreases accordingly. The reaction mechanism seems to be have oxidative and hydrolytic features and assays with groove binder and circular dichroism indicate that all the complexes have preference for the minor groove of DNA. Assays of high resolution direct-cleavage with probes 5?-labeled with fluorescein (FAM) provides information about the mechanism of action by the complexes upon DNA and indicated that complex 2 is capable to cleave DNA in the vicinity of a hairpin structure.

SOMBRA, Carla Maria Lima. Biomonitoramento genotóxico e genético como indicador de risco à saúde por exposição ao urânio de residentes dos municípios de Monte Alegre, Prainha e Alenquer no estado do Pará. 2009. 96 f. Dissertação (Mestrado em Farmacologia) - Universidade Federal do Ceará. Faculdade de Medicina, Fortaleza, 2009. / Submitted by denise santos (denise.santos@ufc.br) on 2012-03-07T15:26:51Z No. of bitstreams: 1 2009_dis_cmlsombra.pdf: 1392819 bytes, checksum: 8fd513bea0a95bdd949d552162270985 (MD5) / Approved for entry into archive by Eliene Nascimento(elienegvn@hotmail.com) on 2012-03-08T11:26:34Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2009_dis_cmlsombra.pdf: 1392819 bytes, checksum: 8fd513bea0a95bdd949d552162270985 (MD5) / Made available in DSpace on 2012-03-08T11:26:34Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2009_dis_cmlsombra.pdf: 1392819 bytes, checksum: 8fd513bea0a95bdd949d552162270985 (MD5) Previous issue date: 2009 / Radiation is considered a risk factor for the development of several types of cancers caused by damage into the DNA molecule and is of extreme importance, therefore, the monitoring of human populations exposed to it. The municipality of Monte Alegre in the state of Pará in Brazil has one of the largest uranium mining areas of the world, which extends to the neighboring municipalities of Prainha and Alenquer. This work assessed the genotoxic potential of exposure to uranium in rocks found in dwellings in individuals from the municipalities of Monte Alegre, Prainha and Alenquer through the alkaline comet assay in peripheral blood lymphocytes and the determination of the frequencies of polymorphisms in DNA repair genes XRCC1 and XRCC3 and in carcinogen-metabolism gene GSTM1 through direct DNA sequencing. The analysis of the alkaline comet assay indicated that there was no statistically significant difference between the Damage Indexes (DIs) of Monte Alegre (DI = 32.01 ± 1.57), Prainha (DI = 45.80 ± 1.12) and Alenquer (DI = 44.30 ± 0.62) and of the negative control (DI = 42.00 ± 5.75) (p > 0.05). Through direct DNA sequencing, there were polymorphisms in XRCC1 and XRCC3 genes in regions of introns and exons. In XRCC1 gene, the variant allele frequencies for Arg194Trp polymorphism in Monte Alegre, Prainha and Alenquer populations were 12%, 13% and 7%, and for Arg399Gln, 28%, 30% and 32% respectively. In XRCC3 gene, the frequencies of the variant allele of Thr241Met polymorphism found in Monte Alegre, Prainha and Alenquer populations were, respectively, 28%, 13% and 33%. For GSTM1 gene, the frequencies obtained for the absence of this gene were 36%, 31% and 40%, respectively to Monte Alegre, Prainha and Alenquer populations. In general, the absence frequencies of GSTM1 gene and of allelic frequencies in XRCC1 and XRCC3 exons were statistically similar among the three municipalities and were in agreement with frequencies obtained in other studies with Brazilian populations. As a conclusion, among the populations studied, there was no increased incidence of DNA damage by exposure to uranium, which can be explained by the low radiation in these locations and that the allelic frequencies of polymorphisms found in the DNA repair genes XRCC1 and XRCC3, and the absence frequencies of GSTM1 gene did not differ from those in populations from other regions of Brazil. Thus, in the studied area, possibly there is no tendency to the development of cancer induced by exposure to uranium. / A radiação ionizante é considerada um fator de risco para o desenvolvimento de diversos tipos de neoplasias pelos danos causados à molécula de DNA, sendo de extrema importância, portanto, o monitoramento de populações humanas expostas a ela. O município de Monte Alegre no estado do Pará apresenta uma das maiores áreas de mineração do urânio do mundo, que se estende aos municípios vizinhos de Prainha e Alenquer. Este trabalho teve como objetivos a avaliação do potencial genotóxico do urânio presente em rochas nas residências de indivíduos dos municípios de Monte Alegre, Prainha e Alenquer através do ensaio do cometa alcalino em linfócitos periféricos e a determinação das freqüências de polimorfismos nos genes de reparo do DNA XRCC1 e XRCC3 e no gene de metabolização GSTM1 através de seqüenciamento direto de DNA. Na análise do cometa alcalino, não houve diferença estatisticamente significante entre os Índices de Dano (IDs) das populações de Monte Alegre (ID = 32,01 ± 1,57), Prainha (ID = 45,80 ± 1,12) e Alenquer (ID = 44,30 ± 0,62) e o do controle negativo (ID = 42,00 ± 5,75) (p > 0,05). Através do seqüenciamento direto de DNA, observou-se a presença de polimorfismos nos genes XRCC1 e XRCC3 em regiões de íntrons e de éxons. No gene XRCC1, as freqüências alélicas variantes para o polimorfismo Arg194Trp nas populações de Monte Alegre, Prainha e Alenquer foram 12%, 13% e 7% e, para Arg399Gln, 28%, 30% e 32%, respectivamente. No gene XRCC3, as freqüências do alelo variante do polimorfismo Thr241Met encontradas nas populações de Monte Alegre, Prainha e Alenquer foram, respectivamente, 28%, 13% e 33%. Em relação ao gene GSTM1, as freqüências obtidas de ausência do gene apresentaram os valores de 36%, 31% e 40%, respectivamente às populações de Monte Alegre, Prainha e Alenquer. No geral, todas as freqüências alélicas nos éxons dos genes XRCC1 e XRCC3 e de ausência do gene GSTM1 foram estatisticamente semelhantes entre os três municípios e se mostraram em concordância com freqüências obtidas em outros estudos com populações brasileiras. Conclui-se que, dentre as populações estudadas, não houve aumento da incidência de dano ao DNA pela exposição ao urânio, o que pode se explicar pela baixa radiação nessas localidades. Além disso, as freqüências alélicas dos polimorfismos encontrados nos genes de reparo XRCC1 e XRCC3, assim como as de ausência do gene de metabolização GSTM1 não diferiram das encontradas em populações de outras regiões do Brasil. Desse modo, nas regiões estudadas, possivelmente não existe tendência ao desenvolvimento de câncer induzido pela exposição ao urânio.

BARROS, Francisco Washington Araújo. Estudo do potencial anticâncer de novos derivados acridínicos sintéticos em modelos experimentais in vitro. 2010. 139 f. Dissertação (Mestrado em Farmacologia) - Universidade Federal do Ceará. Faculdade de Medicina, Fortaleza, 2010. / Submitted by denise santos (denise.santos@ufc.br) on 2012-03-27T13:36:44Z No. of bitstreams: 1 2010_dis_fwabarros.pdf: 13241178 bytes, checksum: e06546c078af5823915b1be26bf86536 (MD5) / Approved for entry into archive by Eliene Nascimento(elienegvn@hotmail.com) on 2012-03-27T15:59:15Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2010_dis_fwabarros.pdf: 13241178 bytes, checksum: e06546c078af5823915b1be26bf86536 (MD5) / Made available in DSpace on 2012-03-27T15:59:15Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2010_dis_fwabarros.pdf: 13241178 bytes, checksum: e06546c078af5823915b1be26bf86536 (MD5) Previous issue date: 2010 / Acridines are planar aromatic polycyclic molecules that have the ability to progress in nuclear DNA. Many of its representatives have antibacterial, antiparasitic and antitumor. This study evaluated the cytotoxic potential of 22 new acridine compounds in strains of human tumor cells. Among these, four compounds [5-(acridin-9-yl-methilene)-3-(4-methyl-benzyl)-thiazolidine-2,4-dione, AC4; 5-(acridin-9-yl-methilene)-3-(4-bromine-benzyl)-thiazolidine-2,4-dione, AC7; 5-(acridin-9-yl-methilene)-3-(4-chloro-benzyl)-thiazolidine-2,4-dione, AC10; and 5-(acridin-9-yl-methilene)-3-(4-fluor-benzyl)-thiazolidine-2,4-dione, AC23] were active, especially in HCT-8 (colon) and SF-296 (glioblastoma), with IC50 values ranging from 2.3 to 5.3 mg / mL. The compounds were selective for tumor cells, provided they do not inhibit (IC50 > 25 µg/mL) cell proliferation monocucleares human peripheral blood (CMSPH) and were not able to induce DNA damage to these cells. None of the compounds showed hemolytic activity against erythrocytes of mice (EC50 > 200 µg/mL), suggesting a cytotoxicity by more specific mechanisms. In order to determine the mechanism involved in the selective cytotoxicity of compounds was carried out a sequence of in vitro experiments, using the line HCT-8 as a model. The cells were treated in different concentrations of compounds (2.5, 5 and 10 µg/mL) for 12 and 24 hours. All compounds were able to reduce the viability test (trypan blue) and proliferation (BrdU assay) of HCT-8 cells after treatment. Induction of apoptosis by acridine derivatives was determined by flow cytometry (membrane integrity, DNA fragmentation and internucleosomal transmembrane potential) and morphological analysis of cellular changes (ethidium bromide/acridine orange, and hematoxylin-eosin). The analysis by flow cytometry showed that the compounds evaluated promoted mitochondrial depolarization, which shows the activation of apoptosis by intrinsic pathway in HCT-8 cells. In the analysis of screening in 3 different mutant strains of Saccharomyces cerevisiae, it was observed that the line Top1Δ (without topoisomerase I) showed resistance to acridine compounds tested at a concentration of 50 µg/mL. In addition, the acridines partially inhibited the relaxation of DNA by topoisomerase I, suggesting that the compounds AC4, AC7, AC10, AC23 has the potential antiproliferative partly related to inhibition of catalytic activity of this enzyme. These data indicate the potential anticancer compounds tested. / Acridinas são moléculas policíclicas aromáticas planares que possuem a capacidade de intercalar no DNA nuclear. Muitos dos seus representantes apresentam propriedades antibacterianas, antiparasitárias e antitumorais. O presente estudo avaliou o potencial citotóxico de 22 novos compostos acridínicos em linhagens de células tumorais humanas. Dentre esses, quatro compostos [5-(acridin-9-il-metileno)-3-(4-metil-benzil)-tiazolidina-2,4-diona, AC4; 5-(acridin-9-il-metileno)-3-(4-bromo-benzil)-tiazolidina-2,4-diona, AC7; 5-(acridin-9-il-metileno)-3-(4-cloro-benzil)-tiazolidina-2,4-diona, AC10; e 5-(acridin-9-il-metileno)-3-(4-flúor-benzil)-tiazolidina-2,4-diona, AC23] foram ativos, especialmente em HCT-8 (cólon) e SF-296 (glioblastoma), com valores de CI50 variando de 2,3 a 5,3 µg/mL. Os compostos apresentaram seletividade para células tumorais, desde que não inibiram (IC50 > 25 µg/mL) a proliferação de células monocucleares de sangue periférico humano (CMSPH), bem como, não foram capazes de induzir dano ao DNA dessas células. Nenhum dos compostos mostrou atividade hemolítica contra eritrócitos de camundongos (EC50 > 200 µg/mL), o que sugere uma citotoxicidade por mecanismos mais específicos. A fim de determinar o mecanismo envolvido na citotoxicidade seletiva dos compostos, foi realizada uma seqüência de experimentos in vitro, usando a linhagem HCT-8 como modelo. As células foram tratadas em diferentes concentrações dos compostos (2,5; 5 e 10 µg/mL) por 12 e 24 horas. Todos os compostos foram capazes de reduzir a viabilidade (teste do azul de tripan) e a proliferação (ensaio do BrdU) de células HCT-8 após o tratamento. A indução de apoptose pelos derivados acridínicos foi determinada por citometria de fluxo (integridade da membrana, fragmentação do DNA internucleosomal e potencial transmembrânico) e por análise morfológica das alterações celulares (brometo de etídeo/laranja de acridina e hematoxilina/eosina). A análise por citometria de fluxo revelou que os compostos avaliados promoveram despolarização mitocondrial, o qual evidencia a ativação da apoptose pela via intrínseca nas células HCT-8. Na análise do screening em 3 diferentes linhagens mutantes de Saccharomyces cerevisiae, foi observado que a linhagem Top1Δ (sem topoisomerase I) mostrou moderada resistência aos compostos acridínicos testados na concentração de 50 µg/mL. Além disso, as acridinas inibiram parcialmente o relaxamento do DNA por topoisomerase I, sugerindo que os compostos AC4, AC7, AC10, AC23 tem o potencial antiproliferativo, em parte, relacionado a inibição da atividade catalítica desta enzima. Esses dados apontam o potencial anticâncer dos compostos testados.

As proteínas E2 promoter binding factor (E2F) estão presentes em quase todos os organismos eucarióticos e são essenciais para o controle de muitos processos celulares, como a progressão do ciclo celular, divisão celular, replicação do DNA, e apoptose. A família E2F compreende dois tipos diferentes de proteínas: os E2F típicos e os E2F atípicos, que diferem estruturalmente e possuem funções específicas. Desde a descoberta desta família gênica muitos estudos focaram nos seus aspectos funcionais, porém a história evolutiva desta família gênica estava fracamente entendida em plantas. Nossas descobertas sugerem que os E2F típicos são mais similares a proteína ancestral que os E2F atípicos (DEL). As proteínas E2F surgiram logo após a emergência das espécies eucarióticas, enquanto as proteínas DEL parecem ter surgido antes da separação entre fungos, metazoários e plantas. As proteínas DEL provavelmente emergiram por uma duplicação parcial do gene que codificava a proteína E2F ancestral. Nossos dados também sugerem que a divergência entre E2Fs ativadores e repressores emergiu duas vezes durante a evolução, uma na linhagem embriófita de plantas e outra na linhagem metazoária. Os E2Fs típicos possuem membros que são reguladores positivos para os seus genes alvo e dados recentes estabeleceram um link entre a resposta a danos ao DNA e genes E2F específicos em células de mamíferos, porém o envolvimento da família genica E2F na sinalização ao reparo de DNA em plantas ainda permanece desconhecido. Nós estudamos o envolvimento dos genes E2F em resposta a dano genotóxico em plantas de arroz e Arabidopsis thaliana. Foram conduzidos experimentos com plântulas de arroz e arabidopsis usando UV-B e MMS (Methyl Methanesulfonate) como fonte de danos genotóxicos. Em resposta a estes estresses E2F ativadores específicos aumentaram sua expressão relativa quando comparados com plantas em condições controle. Os resultados obtidos nos experimentos de estresse genotóxicos nos levaram a sugerir que membros específicos da família E2F de arroz e arabidopsis estão envolvidos com as respostas ao dano de DNA. / The E2 promoter binding factor (E2F) proteins are present in almost all eukaryotic organisms and are essential to control several cellular processes, such as the cell cycle progression, cell division, DNA replication, and apoptosis. The E2F family comprises two different types of proteins: the typical E2Fs and atypical E2Fs, which differ structurally and have specific functions. Since the discovery of this gene family several studies have focused on the functional aspects, but the evolutionary history of this gene family was poorly understood in plants. Our findings suggest that typical E2F is more similar to the ancestral protein than atypical E2F (DEL). The E2F proteins arose early after the emergence of the eukaryotic species, while DEL proteins appear to have arisen after the separation of fungi, metazoan and plants. The DEL proteins probably emerged through a partial duplication from the gene that encodes the ancient E2F protein. Our data also suggest that the divergence of the E2Fs between activators and repressors emerged twice during evolution, once in the embryophyte lineage and another in the metazoan lineage. The typical E2Fs has members that are positive regulators for their target genes and recent data have established a link between response to DNA damage and specific E2F genes in mammalian cells, but the involvement of the E2F gene family in the signaling of DNA repair in plants still unknown. We studied the involvement of E2F genes in response to genotoxic damage in rice and Arabidopsis thaliana plants. Experiments were conducted with rice and A. thaliana plantlets using UV-B and MMS (Methyl Methanesulfonate) as genotoxic damage souce. In response to these stresses specific activator E2F genes increased their relative expression compared to plants in control condition. The results obtained in the genotoxic stress experiments lead us to suggest that specific members of the E2F family of rice and arabidopsis are involved with responses to DNA damage.

O DNA sofre constantes ataques de agentes que podem causar danos estruturais em uma ou em ambas as cadeias. Os agentes mutagênicos bifuncionais, amplamente utilizados como quimioterápicos, produzem uma lesão do tipo ponte intercadeia (ICL), que consiste numa ligação covalente entre as duas cadeias do DNA. As ICLs causam o bloqueio da replicação e da transcrição do DNA, e sua resolução pode levar à formação de quebras-duplas (DSBs). A célula utiliza vários mecanismos para reparar ICLs, entre os quais está a proteína Pso2, cuja transcrição é ativada especificamente após a indução desta lesão na célula. Visando à melhor caracterização da função da Pso2p na reparação de ICLs, buscou-se neste trabalho a identificação de proteínas interativas com Pso2p, através do sistema dois-híbridos em levedura. Entre as proteínas de fusão isoladas, a cinase Sak1 despertou grande interesse. Verificou-se que Sak1p interage com o domínio C-terminal β-CASP de Pso2p, além de fosforilar Pso2p in vitro. Ainda, Pso2p e Sak1p apresentaram interação epistática após tratamento com agentes indutores de ICLs. A partir desses resultados, investigou-se a interação dos genes que codificam para estas proteínas com outros genes da resposta a danos no DNA. Verificou-se que YKU70 não interage geneticamente com PSO2 após tratamento com 8-metoxipsoraleno fotoativado (8-MOP+UVA) e mostarda nitrogenada (HN2). As interações observadas após tratamento com 8-MOP+UVA para os genes do complexo MRX indicam que Mre11p (produto do gene MRE11) compete pelo mesmo substrato com as proteínas Pso2 e Sak1, mas atuam em vias diferentes de reparação de ICLs. Para o gene RAD50, constatou-se interação epistática com PSO2 e SAK1, apontando para a participação das proteínas Rad50, Pso2 e Sak1 na mesma via de reparação de ICLs. O gene XRS2, por sua vez, interagiu de forma não epistática com SAK1, indicando que as respectivas proteínas atuam em vias e substratos diferentes durante a reparação de ICLs. Por outro lado, constatou-se que não há interação genética de TEL1 e TOR1 com o gene PSO2 após tratamento com 8-MOP+UVA, sugerindo que as cinases Tel1 e Tor1 não participam da sinalização para a reparação de ICLs na via que inclui Pso2p. Com estes resultados, nós mostramos que a cinase Sak1 é importante para a atuação da nuclease Pso2 na reparação de quebras duplas no DNA. Conforme o modelo proposto neste trabalho, esta interação possivelmente seja necessária para ativar a função endonucleásica da proteína Pso2, recentemente identificada, para permitir a abertura de estruturas do tipo hairpin (grampo), que se formam no DNA em consequência de ICLs. / DNA is often threatened by agents that may cause structural damage on one or both strands. Bifunctional mutagenic agents that are largely used as chemotherapeutics, produce a serious damage, namely interstrand crosslink (ICL), that covalently link both DNA strands. The formation of ICLs blocks DNA replication and transcription, and their processing may cause double strand-breaks (DSBs). Cells utilize many mechanisms to repair ICLs, including the Pso2 protein, which transcription is induced specifically after the formation of this lesion in DNA. In this study, we aimed to extend the characterization of Pso2 function in ICL repair trough the identification of interacting proteins, using the two-hybrid system (THS) in yeast. In addition, the genetic interaction of PSO2 with genes involved in early stages of ICL repair was also investigated. Among the fusion proteins isolated by THS, Sak1 kinase has raised great interest for further investigation. The results showed that Sak1p interacts with the C-terminal β-CASP domain of Pso2p and is able to phosphorylate Pso2p in vitro. Pso2p and Sak1p showed epistatic interaction after treatment with ICL-inducing agents. Based on these results, we investigated the interaction of PSO2 and SAK1 genes with other genes involved in DNA DSB repair. We found that YKU70 does not interact with PSO2 after treatments with photoactivated (8-methoxypsoralen) 8-MOP+UVA and nitrogen mustard (HN2). The interactions observed for MRX genes after treatment with 8-MOP+UVA indicate that Mre11p (product of MRE11 gene) competes with Pso2p and Sak1p for the same substrate, but act in different ICL repair pathways. XRS2 gene, in turn, showed an additive interaction with SAK1 indicating that the respective proteins act in different substrates and pathways during ICL repair. On the other hand, RAD50 presents epistatic interaction with PSO2 and SAK1 genes, pointing to the participation of Rad50, Pso2 and Sak1 proteins in the same pathway for ICL repair, in exponentially growing S. cerevisiae cells. Regarding to the TEL1 and TOR1 genes, it was found no genetic interaction with PSO2 gene after exposure to 8-MOP+UVA, suggesting that Tel1 and Tor1 kinases do not participate in signaling for ICL repair in the pathway which Pso2 nuclease acts. Considering these results, we showed that Sak1 kinase plays an important role in contribution to Pso2 nuclease in the repair of ICL-induced DSBs. According to the proposed model in this work, this interaction is possibly necessary to activate Pso2 endonucleolytic activity, recently identified to the opening of hairpin structures, which are formed as a result of the DNA ICLs.

O ditelureto difenila (DTDF) é um protótipo para o desenvolvimento de novas moléculas biologicamente ativas. Estudos prévios caracterizaram o efeito citotóxico dessa molécula em fibroblastos de pulmão de hamster chinês (células V79) mas os mecanismos relacionados à redução da viabilidade pelo DTDF são pouco conhecidos. Portanto, neste trabalho foi investigado o tipo de morte celular provocada pelo DTDF, sua influência no ciclo celular e sua possível interação com enzimas topoisomerases empregando células V79 e a levedura Saccharomyces cerevisiae como modelos biológicos de estudo. Conforme esperado, houve redução da viabilidade celular após o tratamento DTDF observada pelo ensaio MTT. A análise morfológica por coloração diferencial mostrou ocorrência de células apoptóticas e necróticas. Um aumento da atividade da enzima caspase 3/7 confirma a indução de apoptose pelo DTDF. Foi observada parada na progressão do ciclo celular na fase S e em sub-G1. A interação com topoisomerases foi verificada pelo teste de micronúcleo (MN) em células V79 onde foi verificado um possível potencial intercalante do DPDT. Linhagens de levedura deficientes em Top1p apresentaram maior tolerância ao DTDF em relação à linhagem selvagem, sugerindo que a interação com a enzima pode estar envolvida na toxicidade do DTDF. A sensibilidade ao DTDF encontrada na linhagem top3Δ indica que Top3p pode participar na reparação das lesões do DNA induzidas por este composto. Os nossos resultados sugerem que a diminuição da viabilidade celular pode ser atribuída à interação do DTDF com enzimas topoisomerases, levando a formação de quebras no DNA com consequente parada no ciclo celular e morte celular por apoptose/necrose. / The diphenyl ditelluride (DPDT) is a prototype for the development of new biologically active molecules. In previous studies, this organotelluride has shown an elevated cytotoxicity in lung fibroblast cell line derived from Chinese hamster (V79 cells), but the mechanisms for reduction of cell viability still remain unknown. Therefore, in this study we investigate the type of cell death induced by DPDT, the influence on cell cycle and its possible interaction with topoisomerase enzymes using V79 cells and the Saccharomyces cerevisiae yeast as biological models of study. As expected, there was a reduction in cell viability after DPDT treatment observed by MTT assay. Morphological analysis showed significant elevation in apoptotic and necrotic cells. An increase of caspase 3/7 activity confirms the apoptosis induction by DPDT. The arrest in the progression of the cell cycle in S phase and in sub-G1 was observed. The interaction with DNA topoisomerases was verified by the micronucleus test (MN) in V79 cells, which showed a possible intercalating potential of DPDT. Yeast strain deficient in Top1p showed higher tolerance to DPDT in relation to the wild type isogenic strain, suggesting that the interaction with this enzyme could be involved in the toxicity of DPDT. The sensitivity to DPDT found in top3Δ strain indicates that Top3p could participate in the repair of DNA lesions induced by this compound. Our results suggest that the decrease in cell viability can be attributed to interaction of DPDT with topoisomerases enzymes, leading to formation of DNA breakage and consequent cell cycle arrest and cell death by apoptosis / necrosis.

Doxorrubicina (DOX) é um agente importante na terapia antitumoral. Seu mecanismo de ação inclui inibição de topoisomerase II, formação de radicais livres e adutos de DNA. O reparo por excisão de nucleotídeos (NER) atua removendo lesões que distorcem a dupla hélice do DNA, como as induzidas por UV e agentes químicos. Linhagens celulares deficientes em NER são mais sensíveis às antraciclinas. Porém, pouco se sabe sobre os processos celulares que permitem sobrevivência celular destas linhagens após o tratamento com esta classe de drogas. Neste trabalho verificou-se a resposta celular às lesões induzidas por DOX em linhagens celulares de fibroblastos humanos proficientes (MRC5) e deficientes em NER (CSB, XPA, XPC e XPD). Para esta finalidade foram realizados os ensaios de MTT, anexina-V, laranja de acridina e SA-b-galactosidase. Além disso, a dinâmica do ciclo celular e PDT (population doubling time) foram determinados após 72 horas de tratamento com DOX. Os resultados indicam que as linhagens deficientes em NER são mais sensíveis à DOX e morrem de maneira dose-dependente, principalmente por apoptose. Na análise do ciclo celular, a linhagem proficiente MRC5 e a linhagem deficiente em XPA apresentaram maior porcentagem de células na fase G2/M. No entanto, as linhagens CSB e XPD não apresentaram aumento relevante. Quando a linhagem XPD foi complementada com gene XPD funcional uma parada em G2 foi observada apenas em baixas doses de DOX. No ensaio PDT, houve um aumento do número de horas necessárias para a duplicação das células MRC5 e XPA tratadas com DOX, enquanto células CSB e XPD não mostraram uma mudança relevante no tempo necessário para a duplicação celular. Isto indica que estas células prosseguem através do ciclo celular, mesmo após o tratamento com DOX. No ensaio de SA-b-galactosidase, as linhagens MRC5, XPA e XPC entraram em senescência após tratamento com DOX, enquanto CSB e XPD não foram induzidas neste processo. Estes resultados foram confirmados por análise de Western Blot, onde as células CSB e XPD não apresentam diferença nos níveis de expressão de p21 e p16 (marcadores de senescência), em resposta ao tratamento com DOX. Em conjunto com a parada em G2/M e indução da senescência, as células MRC5 e XPA mostraram um aumento na coloração com laranja de acridina, indicando o processo de autofagia, enquanto que as células CSB e XPD não demonstraram este aumento. Um indício importante vem de estudos recentes que ligam a autofagia com o início da senescência. Assim, autofagia e senescência podem ser parte do mesmo processo fisiológico, conhecido como transição autofagia-senescência. Tomados em conjunto, os nossos resultados sugerem que a autofagia e senescência tendem a ocorrer em paralelo, e que autofagia pode ser necessária para o fenótipo senescente. Além disso, pode-se inferir uma participação ativa do NER no reparo de lesões induzidas pela DOX. Assim, NER eficiente após o tratamento com DOX parece ser essencial para a sobrevivência da célula. Por outro lado, o recrutamento de fatores da via de NER (CSB e XPD) parece ser necessário para a indução de respostas celulares específicas, tais como a transição autofagia-senescência. / Doxorubicin (DOX) is an important agent in cancer therapy and its mechanism of action includes topoisomerase II-poisoning, free radicals release and DNA adducts formation.The nucleotide excision repair (NER) participates in the removal of lesions that distort the double helix of DNA induced by UV and chemicals. Cell lines deficient in NER are more sensitive to anthracyclines, however little is known about the cellular processes that permit cell survival after treatment with these drugs. In this work we verified the cellular response to DOX induced lesions in human fibroblasts cell lines proficient (MRC5) and deficient in NER (CSB, XPA, XPC and XPD). For this purpose we performed MTT, Annexin-V, Acridine orange and SA-b-galactosidase assays. In addition, the cell cycle dynamics and PDT (population doubling time) was determined after 72h DOX treatment. The results indicate that cell lines deficient in NER are more sensitive to anthracyclines and die in a dose dependent manner mainly by apoptosis. In the cell cycle analysis, a proficient MRC5 and XPA deficient cell lines showed a higher percentage of cells in G2/M phase. In contrast, CSB and XPD cells showed no relevant increase. When XPD cells were complemented with functional XPD gene a G2 arrest was observed just at low doses of DOX. In PDT assay, there was an increased number of hours required for doubling in MRC5 and XPA cells treated with DOX, whereas CSB and XPD lines did not show a relevant change in time required for cell duplication. This indicates that these cells proceed through the cell cycle even after treatment with DOX. In SA-b- galactosidase assay, MRC5, XPA and XPC lines entered in senescence after DOX treatment, while CSB and XPD do not induced in this process. These results were confirmed by Western Blot analysis where CSB and XPD cells do not exhibit difference in p21 and p16 expression levels (senescence markers) in response to treatment DOX. Along with the G2/M arrest and senescence induction, MRC5 and XPA cells showed an increase in acridine orange staining, indicating autophagy process, whereas CSB and XPD cells do not demonstrate this increase. An important clue comes from recent studies linking autophagy with the onset of senescence. Thus, autophagy and senescence may be part of the same physiological process, known as the autophagy-senescence transition. Taken together, our findings suggest that autophagy and senescence tend to occur in parallel, and that autophagy may be required for the senescent phenotype. Furthermore, we can infer an active involvement of NER in the repair of DOX-induced lesions. Thus, efficient NER following treatment with DOX seems to be essential for cell survival. On the other hand, recruitment of NER pathway factors (CSB and XPD) seems to be necessary for induction of specific cellular responses such as autophagy-senescence transition.

Com o intuito de compreender a natureza da variação conformacional em polieletrólitos, que leva ao importante fenômeno da desnaturação do DNA, propomos um conjunto de modelos complementares para a descrição das principais interações entre as espécies envolvidas. Investigamos, primeiramente, a ocorrência de desnaturação como função da densidade de sal em solução, aumento da temperatura e da constituição específica da cadeia de DNA em termos da concentração de pares de base Guanina e Citosina (GC). O modelo é construído a partir das teorias de Debye-Hückel, Bjerrum, Manning e Flory, com a interação atrativa entre as fitas que formam a dupla hélice descrita como função da densidade de pares de base GC. Um modelo semelhante foi empregado para o estudo das interações entre cadeias de DNA e moléculas de Ciclodextrina, que vem, ultimamente, sendo investigada para transporte de fármacos no interior das células. Ainda com interesse em propriedades físicas de polieletrólitos, propomos uma análise do efeito de associação de moléculas intercalantes em poliíons. / In this work, we propose a model to describe some relevant physical transitions observed experimentally in solutions containing polyelectrolytes and others molecules. Our focus is the DNA denaturation phenomena, that is studied using an analytic model based on Debye-H¨uckel, Bjerrum, Manning and Flory theories. The atractive interaction between the double strands that form the double helix structure is written as a function of salt density, temperature changes and the Guanine-Cytosine concentration. A similar model was employed to study the interaction between DNA chains and Cyclodextrin molecules, that has been investigated to drug delivery to into the cells. Concerned about polyelectrolytes physical properties, we propose an analysis of intercalating molecules association to DNA that causes interesting conformational effects including the denaturation.

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