Passiflora é um gênero neotropical que apresenta uma grande variabilidade floral e foliar, o que dificulta enormemente sua classificação taxonômica. A característica mais marcante do gênero é a corona de filamentos em suas flores. Para melhor entender a taxonomia de Passiflora, foram analisadas sete regiões de seu DNA, englobando os genomas plastidial, mitocondrial e nuclear de 104 espécies. Essas espécies incluem 19 dos 23 subgêneros da classificação morfológica antiga e todos os quatro subgêneros da classificação mais recente, também baseada em caracteres externos. Os resultados corroboraram a proposta mais recente, que divide o gênero em quatro subgêneros (Astrophea, Decaloba, Deidamioides e Passiflora), com a adição de mais um, Tryphostemmatoides. Os três subgêneros com o número de espécies mais representativo (Astrophea, Decaloba e Passiflora) formam grupos monofiléticos estatisticamente bem fundamentados. No entanto, Deidamioides não é monofilético em todas as análises e marcadores, enquanto que Tryphostemmatoides é representado por apenas uma espécie. Foram também estudadas as prováveis datas de surgimento de Passiflora e sua diversificação nos três principais subgêneros, através do estudo de quatro regiões do DNA, englobando também os três genomas, em 70 espécies. Verificou-se que o gênero Passiflora deve ter aparecido há cerca de 42 milhões de anos atrás (Ma); Decaloba parece ter sido o primeiro subgênero a se estabelecer (35 Ma), enquanto que os subgêneros Astrophea e Passiflora devem ter se diversificado há 24 Ma Estes dois subgêneros parecem ter tido uma radiação rápida em comparação a Decaloba, que possui árvores filogenéticas com comprimentos dos ramos significativamente maiores que os outros dois. As adaptações morfológicas a diferentes polinizadores devem ter sido as principais responsáveis pela radiação rápida. A herança organelar de dois subgêneros, Decaloba e Passiflora, foi investigada através de um e quatro híbridos interespecíficos, respectivamente. A herança foi estritamente materna para a mitocôndria e o cloroplasto em Decaloba, enquanto que no subgênero Passiflora ocorreu herança materna para o DNA mitocondrial e paterna para o DNA plastidial. Esses resultados reforçam os dados obtidos pela filogenia, no que se refere à diferenciação e diversificação dos subgêneros, pois há evidências de que a herança materna dos cloroplastos seja ancestral em plantas.

Uma significativa quantidade de proteínas vegetais apresenta-se compartimentalizada nas diversas estruturas celulares. A sua localização pode conduzir à elucidação do funcionamento dos processos biossintéticos e catabólicos e auxiliar na identificação de genes importantes. A fim de localizar produtos gênicos relacionados à resistência, foi utilizada a fusão de cDNAs de arroz (Oryza sativa L.) ao gene da proteína verde fluorescente (GFP). Os cDNAs foram obtidos a partir de uma biblioteca supressiva subtrativa de genes de arroz durante uma interação incompatível com o fungo Magnaporthe grisea. Estes cDNAs foram fusionados a uma versão intensificada de gfp e usados para transformar 500 plantas de Arabidopsis thaliana. Outras 50 plantas foram transformadas com o mesmo vetor, porém sem a fusão (vetor vazio). Foram obtidas aproximadamente 25.500 sementes oriundas das plantas transformadas com as fusões EGFP::cDNAs e 35.000 sementes das transformadas com o vetor vazio, produzindo, respectivamente, 750 e 800 plantas tolerantes ao herbicida glufosinato de amônio. Após a seleção, segmentos foliares das plantas foram analisados por microscopia de fluorescência, visando o estabelecimento do padrão de localização de EGFP. Foram observadas 18 plantas transformadas com a fusão EGFP::cDNAs e 16 plantas transformadas com o vetor vazio apresentando expressão detectável de GFP. Uma planta transformada com uma fusão EGFP::cDNA apresentou localização diferenciada da fluorescência, notadamente nas células guarda dos estômatos e nos tricomas. Após seqüenciamento do cDNA fusionado, foi verificado que esta planta apresentava uma inserção similar a uma seqüência codificante de uma quinase, uma classe de enzimas envolvidas na transdução de sinais em resposta à infecção por patógenos. / A significant amount of plant proteins is compartmentalized in different cellular structures. The location of such proteins is essential to understand the function of biosynthetic and catabolic processes and also to help the identification of important genes. To identify the location of gene products related to resistance, rice (Oryza sativa) cDNAs were fused to a gene coding a GFP protein (green fluorescent protein). The cDNAs were obtained from a suppressive subtractive library of rice plants during an incompatible interaction with Magnaporthe grisea fungus. The cDNAs were fused to an enhanced version of gfp and they were used to transform 500 Arabidopsis thaliana plants, yielding 25.500 T1 seeds. Other 50 plants were transformed with the same vector, but without the EGFP::cDNA fusion (empty vector), yielding 35.000 T1 seeds. Seven hundred and fifty and 800 plants were generated from T1 seeds of the EGFP::cDNA fusions and empty vector transformations, respectively. Following herbicide selection, detached leaves were analyzed under a fluorescence microscope to evaluate the pattern of EGFP localization. It was observed that 18 plants transformed with EGFP:cDNA fusion and 16 plants transformed with empty vector showed detectable EGFP accumulation. One plant transformed with EGFP::cDNA showed a unique localization of the fluorescent signal. In this plant, the EGFP expression was predominantly visible at the stomata guard cells and trichomes. After, cDNA sequencing, the cDNA from this plant has shown insert similarity to kinase protein sequence, an enzyme class frequently related to signal transduction in response to pathogenic infections.

This thesis deals with possibilities of isolation DNA yeasts genus Brettanomyces from wine with following identification using PCR. Fourteen wine samples with assumption of occurrence Brettanomyces were analysed. The literary section describes characteristic of yeasts Brettanomyces and their impact on wine. Further is described principle of PCR and use of this method in detection of Brettanomyces. Four different methods of isolation DNA directly from wine were tested. Wine samples were analysed using of five different primers by PCR. In this work were tested designed probe and primers for identification of Brettanomyces by real-time PCR.

A resposta de células eucarióticas após exposição a estresse genotóxico é a ativação de uma intrincada rede de sensores, transdutores e efetores envolvidos em vias de reparação de DNA e controle de ciclo celular. Para garantir a fidelidade dessas vias regulatórias, existem mecanismos celulares evolutivamente conservados, chamados pontos de checagem, que monitoram a estrutura dos cromossomos, coordenando reparação de DNA e progressão do ciclo celular, controlando a capacidade da célula em parar o ciclo celular como resposta a danos no DNA, concedendo tempo para que ocorra a reparação. Os processos de reparação de danos no DNA são bem estabelecidos, porém, a sinalização para ativação de parada de ciclo celular na resposta a estas lesões é menos conhecida. A proteína Kin3 é uma serina treonina cinase de Saccharomyces cerevisiae estruturalmente relacionada à NIMA, um regulador mitótico descrito inicialmente no fungo Aspergillus nidulans, o qual está envolvido na regulação da progressão da fase G2/M e na organização de alguns eventos mitóticos. Como a maioria dos reguladores de ciclo celular é conservada, neste trabalho avaliou-se a função de Kin3p na resposta a danos no DNA. Nossos resultados demonstram que a deleção do gene KIN3 induz sensibilidade a cisplatina, doxorubicina, mustarda nitrogenada e MMS. Além disso, o mutante kin3 não apresenta uma parada de ciclo celular eficiente no ponto de checagem G2/M e uma diminuição da reparação das quebras no DNA após estes tratamentos, sugerindo que Kin3p possa estar envolvida no reconhecimento ou sinalização destas quebras. A expressão do gene KIN3 em resposta a estresse genotóxico está aumentada, assim como há um aumento da expressão da proteína codificada por este gene. O co-tratamento com cafeína, um inibidor das proteínas de sinalização de danos no DNA Mec1 e Tel1, induz um aumento da sensibilidade aos agentes genotóxicos no mutante kin3 e diminui a expressão do gene KIN3 na linhagem selvagem, sugerindo que a proteína Kin3 possa atuar em uma via de sinalização dependente de Mec1p/Tel1p. Na busca por esclarecimentos a respeito da via de atuação da proteína Kin3, avaliou-se a interação da mesma com as proteínas do complexo Mre11p/Rad50p/Xrs2p, já que previamente Mrellp tinha sido apontada como parceira molecular da proteína relacionada a NIMA de humanos Nek1. Nossos resultados de interação in vitro utilizando o sistema duplo híbrido, demonstraram que a proteína Kin3 interage com cada uma das proteínas do complexo MRX. Esta interação foi confirmada pela epistasia entre os mutantes kin3Δ e mrelΔl, rad50Δ ou xrs2Δ em ensaios de sensibilidade a cisplatina, mustarda nitrogenada e 8-MOP foto-ativado. A expressão do gene KIN3, que como mencionada anteriormente está aumentada na resposta a estresse genotóxico na linhagem selvagem, também está aumentada nos mutantes do complexo MRX, demonstrado que a ativação do gene KIN3 independe da formação do complexo MRX. O conjunto de dados apresentados nesta tese demonstra, pela primeira vez, o envolvimento da proteína Kin3 na resposta a agentes indutores de adutos no DNA, em uma via dependente de Tel1p/Mec1p, através da interação com o complexo MRX. Embora, o progresso no entendimento dos mecanismos de detecção, sinalização e reparação de danos no DNA tem sido grande, muitos detalhes moleculares ainda esperam por respostas e o estudo de novas proteínas pode ser importante para o entendimento destas lacunas. / The eukaryotic cells response to genotoxic stress is the activation of an intricate network of sensors, transducers and effectors involved in DNA repair pathways and cell cycle control. These regulatory pathways must be quite faithful. To reach this fidelity, there are cellular mechanisms evolutively conserved, called cell cycle checkpoints, which monitor the structure of chromosomes and coordinate DNA repair, cell cycle progression by controlling the cell's ability to stop the cell cycle in response to DNA damage, providing time for repair to occur. The DNA damage repair mechanisms are well established. However, the signaling for cell cycle arrest activation in response to these lesions is less well known. Kin3 protein is a serine/threonine kinase of the budding yeast Saccharomyces cerevisiae that is related to the NIMA (Never-In Mitosis, gene A) protein of Aspergillus nidulans, which is involved in the response to DNA damage, regulation of G2/M phase progression and is important for orderly mitotic events. Since the majority of cell cycle regulators are conserved throughout the eukaryotic domain, in this work we show that KIN3 gene deficient cells present sensitivity and fail to arrest properly at G2/M-phase checkpoint in response to the DNA damage inducing agents MMS, cisplatin, doxorubicin and nitrogen mustard, suggesting that Kin3 can be involved in DNA strand breaks recognition or signaling. In addition, there is an increase in KIN3 gene expression in response to the mutagenic treatment, which was confirmed by the increase of Kin3 protein. We also showed that co-treatment with caffeine, a Mec1 and Tel1 signaling DNA damage proteins inhibitor, induces a slight increase in the susceptibility to genotoxic agents in kin3Δ cells and abolishes KIN3 gene expression in wild-type strain, suggesting that Kin3 protein can play a role in Tel1/Mec1-dependent pathway activation induced after genotoxic stress. In search for understanding the Kin3 action mechanism in DNA damage response, we evaluated the interaction of this protein with each component of Mre11/Rad50/Xrs2 complex, since Mre11 had previously been identified as Nek1 (NIMA-related human protein) molecular partner. Taking into account that the phenotype of Kin3-deficient cells is rather similar to Nek1-deficient cells and that the MRX complex is highly conserved, we show that the Kin3 protein interacts with each protein of the MRX complex using a two-hybrid assay. These results were confirmed by the epistasis observed between KIN3 and MRX in the sensitivity to cisplatin, nitrogen mustard and photo-activated 8-methoxypsoralen. The KIN3 gene expression was upregulated in the wild type strain after mutagenic stress, in the same way, is also increased in MRX mutants demonstrated that KIN3 gene activation is independent of MRX complex formation. The data presented in this thesis demonstrate, for the first time, the involvement of Kin3 DNA adducts damage response in Tel1/Mec1 dependent pathway, by MRX complex interaction. Although progress in understanding the mechanisms of detection, signaling and repair of DNA damage has been increased, many molecular details are still waiting for answers and the study of new proteins may be important for the understanding of these gaps.

As Nek são proteínas cinases humanas evolutivamente conservadas e estruturalmente relacionadas à NIMA, um regulador mitótico descrito em Aspergillus nidulans. A Nek1, uma das onze isoformas das Neks identificadas em mamíferos, parece estar envolvida na etiologia da Doença Policística do Rim (PKD) em humanos, pois sua deleção em animais causa uma síndrome semelhante à PKD. Além disso, existem evidências sobre sua participação no reparo ao DNA em resposta à radiação ionizante e sobre sua interação com proteínas envolvidas em rotas de reparo e na regulação do ciclo celular de mamífero, mas pouco se sabe sobre seu papel na fisiologia das células de mamíferos. O objetivo deste estudo foi avaliar o papel da Nek1 no reparo de DNA. A sensibilidade dae linhagens celulares aos agentes genotóxicos foram testados pelo ensaio cometa em pH alcalino e também por meio do ensaio de proliferação celular MTT. Para isso, utilizamos a linhagem de rim Hek293t e de glioma humano U87. Essas células foram silenciadas através de um sistema lentiviral estável que usa a proteína fluorescente verde (GFP) como marcador. A seleção das linhagens Nek-negativas foi feita por isolamento de colônias GFP-positivas. As células utilizadas como controle nesse trabalho também expressavam GFP além da Nek1. As células foram testadas com os agentes indutores de danos ao DNA metil-metanosulfonato, peróxido de hidrogênio e cisplatina. Os resultados mostraram o retardo no reparo de células silenciadas tratadas com peróxido de hidrogênio e metil-metanosulfonato. Após o tratamento com cisplatina, o DNA das células silenciadas apresentou um padrão de migração diferente, característico de lesões do tipo ligações cruzadas (crosslink). Esse aspecto permaneceu até 4 horas após a exposição à cisplatina, quando o aspecto de cauda começou a tornar-se mais predominante entre as células observadas. Nosso estudo também mostrou maior sensibilidade da linhagem silenciada em relação à selvagem quando tratadas com esses três agentes por 24, 48 e 72 h de tratamento. Portanto, nossos resultados indicam que a ausência da Nek1 provoca alterações no reparo normal de danos ao DNA e aumento da sensibilidade ao estresse genotóxico, mas aparentemente ela não é essencial para a sinalização do reparo, uma vez que, mesmo com o retardo, as células acabam conseguindo reparar o dano causado. Esses efeitos podem estar ocorrendo devido a uma deficiência nas vias de reparo de quebras no DNA que são realizadas por mecanismos de recombinação. Por outro lado, a Nek1 poderia estar atuando no reparo DNA lesado indiretamente através da regulação do ciclo celular, uma vez que a ocorrência de uma lesão no material genético pode alterar o ciclo celular, causando uma parada. Ainda é cedo para afirmar se a Nek1 está atuando diretamente no controle do ciclo celular ou em rotas de reparo ou até mesmo nas duas. Entender como essa proteína funciona in vivo pode auxiliar no estudo da etiologia da Doença Policística do Rim bem como no entendimento de patologias associadas a lesões no material genético. / NIMA related kinases (Neks) are evolutionarily conserved proteins structurally related to the Aspergillus nidulans mitotic regulator NIMA. The Nek1, one of the eleven isoforms of the Neks identified in mammals, seems to be involved in the etiology of the polycystic kidney disease (PKD) in humans because the deletion of Nek1 in animals causes a disease like PKD. Moreover, there are evidences about its participation in DNA repair in response to ionizing radiation and about its interaction with proteins involved in routes of repair and the mammals cell cycle regulation, but little is known about its role in the human cells physiology. The aim of this study was evaluating a possible role of Nek1 in the DNA repair. The sensitivity of the lines to genotoxic agents were tested by comet assay in alkaline pH and also by cell proliferation MTT assay of. For this, we used human embryonic kidney Hek293t of and human glioma U87 cell lines. These cells were silenced by a system that uses lentiviral vector with a green fluorescent protein (GFP) as a marker. The selection of the Nek negative cells lines was made by isolation of colonies GFP positive. The cells used as a control in this work also expressed GFP. The cells were treated by hydrogen peroxide, methyl-methanesulphonate and cisplatin. The results showed a delay in the silenced cells repair when treated with hydrogen peroxide and methyl-methanesulphonate. After the treatment with cisplatin, the silenced cells DNA presented a different pattern of migration, typical of the type of crosslink damage. This aspect remained up to 4 hours after exposure to cisplatin, when the appearance of tail began to become predominant in the cells observed. Our study also showed greater silenced line sensitivity to the wild when treated with the three agents by 24, 48 and 72h of treatment. Our results indicate that the Nek1 absence causes changes in the normal DNA damage repair and increased sensitivity to genotoxic stress, but apparently it is not essential for repair signaling because, even with delay, cells still repair the DNA damages. These effects may be occurring due to a deficiency in the process of DNA breaks repair that are held by recombination mechanisms. Meanwhile, Nek1 could be acting in DNA damage repair indirectly through the regulation of the cell cycle, since the occurrence of an injury in the genetic material can change the cell cycle, causing a stop. It is too early to say whether the Nek1 is working directly in the control of cell cycle or in routes for the repair or even in both. Understanding how this protein works in vivo can assist in the study of the etiology of PKD and in the understanding of diseases associated with lesions in the genetic material.

Os roedores sigmodontíneos formam grupo diverso tanto em relação ao número de espécies quanto aos aspectos ecológicos e adaptativos, apresentando taxonomia complexa com muitos aspectos filogenéticos não resolvidos. O DNA barcoding é uma abordagem padronizada que visa à identificação de amostras em nível específico. Neste estudo sequências de dois marcadores moleculares mitocondriais, citocromo b (CYTB) e citocromo c oxidase subunidade 1 (COI), e do nuclear Interphotoreceptor Retinoid Binding Protein (IRBP) foram obtidos para 322 amostras de tecido e analisadas com sequências do Genbank por métodos probabilísticos e de distância genética para avaliar as relações filogenéticas entre os táxons e a utilidade do COI para discriminar espécies. Os diferentes métodos empregados para analisar os genes separadamente e concatenados foram congruentes de modo geral, recuperando os mesmos clados com altos valores de suporte. Utilizando-se o COI foi possível determinar em nível de espécie 12 amostras com identificações errôneas, 30 indeterminadas, 21 que estavam identificadas apenas em nível genérico e um novo táxon. As tribos descritas em estudos anteriores (Abrothrichini, Akodontini, Ichthyomyini, Oryzomyini, Phyllotini, Reithrodontini, Sigmodontini, Thomasomyini, Wiedomyini) foram recuperadas utilizando-se os três marcadores, todavia apresentaram baixo suporte na maioria das análises. As análises de distancia intra-específica indica que a maior parte das espécies possui o barcoding-gap, isto é, uma distancia intra-específica menor do que a inter-especifica. Portanto, este estudo demonstra que a abordagem do DNA barcoding é útil para delimitar a grande maioria das espécies de roedores sigmodontíneos, mas sugere-se usar tal abordagem juntamente com procedimentos adicionais de sistemática e taxonomia em uma abordagem integrativa. / Sigmodontine rodents comprise a speciose and diverse group in ecological and adaptive aspects presenting complex taxonomy with many aspects unresolved. DNA barcoding is standardized approach which aims to identify samples in specific level. In this study sequences of two mitocondrial markers, cytochrome b (CYTB) and cytochrome c oxidase subunit I (COI), and nuclear Interphotoreceptor Retinoid Binding Protein (IRBP) were obtained for 322 tissue samples and analyzed with Genbank sequences by probabilistic and genetic distance methods to assess phylogenetic relationships between taxa and COI utility to discriminate species. The different methods used to analyze gene separately and concatenated agree in general, recovering the same species with high support values. Species were identified to 12 samples misidentified, 30 which species were undetermined, 21 which were identified only in genus level and one new species. Tribes described in preview studies were recovered, however showed low support in most analyses. DNA barcoding approach is useful to distinguish between species, but should be used cautiously with additional procedures in a systematic and taxonomic in an integrative approach.

A diferenciação entre espécies e subespécies de pectobactérias e outras bactérias fitopatogênicas é feita, basicamente, por testes bioquímicos e fisiológicos. Através de arranjos, macro e micro, de sondas de DNA, uma matriz, semelhante á gerada pelos resultados dos testes bioquímicos e fisiológicos, poderia ser construída e utilizada na identificação das estirpes. Para isto, há a necessidade da seleção de sondas de características a nível de gênero, espécie e subespécie. Como as sondas são obtidas por PCR, o objetivo desta pesquisa foi selecionar oligonucleotídeos iniciadores baseados em características fenotípicas e genotípicas. A maioria dos oligonucleotídeos iniciadores selecionados gerou produto, diferindo o padrão de amplificação entre os oligonucleotídeos iniciadores e entre as espécies ou subespécies de pectobactérias. Alguns não produziram fragmentos e outros geraram muitos produtos inespecíficos. Os oligonucleotídeos iniciadores 149LF/L1r amplificaram o DNA de todas as Pectobacterium spp., enquanto Y1/Y2 amplificaram o DNA apenas da espécie P. carotovorum. ADE1/ADE2 gerou produto apenas com a espécie P. chrysanthemi. Y45/Y46 e ECA1F/ECA1R são específicos para a subespécie P. carotovorum subsp. atrosepticum. Outros oligonucleotídeos iniciadores amplificam o DNA de alguns indivíduos dentro da espécie ou subespécie, como RdgF/RdgR e PnlF/PnlR com P. carotovorum, Br1F/L1R e HrpNF/HrpNR com P. caratovorum subsp. brasiliensis e CytR-RdF/CytR-BR com P. carotovorum subsp. atrosepticum. A análise do coeficiente de similaridade da matriz gerada mostrou uma alta similaridade entre as estirpes de cada subespécie, com exceção de P. carotovorum subsp. carotovorum que mostrou uma alta variabilidade. Estes resultados indicam que esta estratégia gera uma matriz que pode ser utilizada no cálculo do coeficiente de similaridade e auxiliar na identificação de estirpes de pectobactérias. / The differences among species and subspecies of pectobacteria and other phytopathogenic bacteria are identified mainly by biochemical and physiological methods. Through arrays (macro and micro) of DNA probes, a matrix, similar to one generated by the results of biochemical and physiological tests, could be built and used to identify strains. To accomplish this, it is necessary to choose probes associated to characteristics at genus, species and subspecies levels. As probes are obtained by PCR, the objective of this research was to select primers based on phenotypic and genotypic traits. Most selected primers amplified the bacterial DNA, giving a distinct pattern to species and subspecies. However, some primers produced no bands or non-specific ones. Primers 149LF/L1r amplified DNA from all Pectobacterium spp., while ADE1/ADE2 generated band only with the DNA of P. chrysanthemi. Y45/Y46 and ECA1F/ECA1R are specific to P. carotovorum subsp. atrosepticum. Other primers amplified DNA of some strains inside of a specific species or subspecies: RdgF/RdgR and PnlF/PnlR to P. carotovorum, Br1F/L1R and HrpNF/HrpNR to P. carotovorum subsp. brasiliensis, and CytR-RdF/CytR-BR to P. carotovorum subsp. atrosepticum. The analysis of the similarity coefficient of the matrix revealed a high level of similarity among the strains of each subspecies, with the except to P. carotovorum subsp. carotovorum. These results indicate that this strategy can be used to create a matrix for the calculation of a similarity coefficient which could be used to identify all major strains of pectobacteria.

A quimioterapia é uma das principais estratégias no tratamento do câncer. No entanto, muitos tumores apresentam resistência, tornando o tratamento parcial ou totalmente ineficaz. Existem alguns mecanismos que podem estar relacionados ao desenvolvimento desse perfil de resistência, sendo o mais estudado o aumento do efluxo das drogas através de proteínas de membrana celular. Por outro lado, uma alteração nas vias de reparo de DNA também contribui para a resistência tumoral, uma vez que as lesões são removidas antes mesmo de se tornarem citotóxicas para as células, reduzindo assim a efetividade do quimioterápico. Dentre as vias de reparo de DNA, a via do Reparo por Excisão de Nucleotídeos (NER) é uma das mais versáteis, e há estudos que demonstram seu envolvimento em resposta às lesões geradas por antraciclinas. Sendo assim, o objetivo deste trabalho foi avaliar a contribuição dos mecanismos de resposta à dano no DNA, bem como da via NER, na resistência à Mitoxantrona (MXT), um análogo de antraciclinas, na linhagem celular de leucemia HL-60/MX2. Para isso, analisou-se a sobrevivência celular, pelo método de exclusão por azul de tripan, o perfil de ciclo celular e a fosforilação da histona H2AX (γH2AX), por citometria de fluxo, além da análise de expressão gênica da via NER e proteínas de efluxo por qPCR. Os resultados indicam um perfil de resposta diferente entre a linhagem resistente e a linhagem sensível, observado pelo teste de sobrevivência e pelos diferentes perfis de ciclo celular e fosforilação de H2AX. Além disso, a análise de expressão gênica demonstra um aumento na expressão de genes da via NER, como ERCC1 já antes do tratamento e XPA após os tratamentos, na linhagem resistente. Estes resultados demonstram portanto envolvimento desta via de reparo de DNA na resistência tumoral da linhagem HL- 60/MX2. / Chemotherapy is one of the main cancer treatment strategies; however, tumors can show resistance, which makes the treatment partial or totally inefficient. Among the mechanisms that may be related to the resistant profile, the most studied is increased drug efflux through ABC transporter permeases. On the other hand, altered DNA repair pathways may contribute to cancer resistance, since the lesions are removed before they become toxic to cells, which reduces chemotherapy effectiveness. Among DNA repair pathways, Nucleotide Excision Repair (NER) is one of the most versatile, and there are studies showing its involvement in removal of anthracyclines-induced lesions. Thus, our aim was to evaluate the contribution of DNA damage response mechanisms, focusing on NER, to the resistance to Mitoxantrone (MXT), an anthracycline analog, using the mitoxantrone-resistant leukemia cell line HL-60/MX2 as a model. After treatment with MXT and Etoposide (ETO), a topoisomerase II inhibitor, cell survival was assessed by trypan blue exclusion method; cell cycle profile and H2AX histone phosphorylation (γH2AX) were evaluated by flow cytometry; and gene expression levels of NER and efflux proteins were determined by RT-qPCR. Results indicate a different response between the resistant HL-60/MX2 and the sensitive HL-60 cells, as observed in the survival assay, cell cycle, and H2AX phosphorylation profile. Furthermore, in the resistant cells, RTqPCR analysis showed an increase in the expression of NER genes, with ERCC1 expression increased before treatments, and XPA after the treatments. Therefore, our results indicate the contribution of NER machinery in the resistance of leukemia cells to Mitoxantrone.

No description available.

No description available.