A quimioterapia é uma das principais estratégias no tratamento do câncer. No entanto, muitos tumores apresentam resistência, tornando o tratamento parcial ou totalmente ineficaz. Existem alguns mecanismos que podem estar relacionados ao desenvolvimento desse perfil de resistência, sendo o mais estudado o aumento do efluxo das drogas através de proteínas de membrana celular. Por outro lado, uma alteração nas vias de reparo de DNA também contribui para a resistência tumoral, uma vez que as lesões são removidas antes mesmo de se tornarem citotóxicas para as células, reduzindo assim a efetividade do quimioterápico. Dentre as vias de reparo de DNA, a via do Reparo por Excisão de Nucleotídeos (NER) é uma das mais versáteis, e há estudos que demonstram seu envolvimento em resposta às lesões geradas por antraciclinas. Sendo assim, o objetivo deste trabalho foi avaliar a contribuição dos mecanismos de resposta à dano no DNA, bem como da via NER, na resistência à Mitoxantrona (MXT), um análogo de antraciclinas, na linhagem celular de leucemia HL-60/MX2. Para isso, analisou-se a sobrevivência celular, pelo método de exclusão por azul de tripan, o perfil de ciclo celular e a fosforilação da histona H2AX (γH2AX), por citometria de fluxo, além da análise de expressão gênica da via NER e proteínas de efluxo por qPCR. Os resultados indicam um perfil de resposta diferente entre a linhagem resistente e a linhagem sensível, observado pelo teste de sobrevivência e pelos diferentes perfis de ciclo celular e fosforilação de H2AX. Além disso, a análise de expressão gênica demonstra um aumento na expressão de genes da via NER, como ERCC1 já antes do tratamento e XPA após os tratamentos, na linhagem resistente. Estes resultados demonstram portanto envolvimento desta via de reparo de DNA na resistência tumoral da linhagem HL- 60/MX2. / Chemotherapy is one of the main cancer treatment strategies; however, tumors can show resistance, which makes the treatment partial or totally inefficient. Among the mechanisms that may be related to the resistant profile, the most studied is increased drug efflux through ABC transporter permeases. On the other hand, altered DNA repair pathways may contribute to cancer resistance, since the lesions are removed before they become toxic to cells, which reduces chemotherapy effectiveness. Among DNA repair pathways, Nucleotide Excision Repair (NER) is one of the most versatile, and there are studies showing its involvement in removal of anthracyclines-induced lesions. Thus, our aim was to evaluate the contribution of DNA damage response mechanisms, focusing on NER, to the resistance to Mitoxantrone (MXT), an anthracycline analog, using the mitoxantrone-resistant leukemia cell line HL-60/MX2 as a model. After treatment with MXT and Etoposide (ETO), a topoisomerase II inhibitor, cell survival was assessed by trypan blue exclusion method; cell cycle profile and H2AX histone phosphorylation (γH2AX) were evaluated by flow cytometry; and gene expression levels of NER and efflux proteins were determined by RT-qPCR. Results indicate a different response between the resistant HL-60/MX2 and the sensitive HL-60 cells, as observed in the survival assay, cell cycle, and H2AX phosphorylation profile. Furthermore, in the resistant cells, RTqPCR analysis showed an increase in the expression of NER genes, with ERCC1 expression increased before treatments, and XPA after the treatments. Therefore, our results indicate the contribution of NER machinery in the resistance of leukemia cells to Mitoxantrone.

A quimioterapia é uma das principais estratégias no tratamento do câncer. No entanto, muitos tumores apresentam resistência, tornando o tratamento parcial ou totalmente ineficaz. Existem alguns mecanismos que podem estar relacionados ao desenvolvimento desse perfil de resistência, sendo o mais estudado o aumento do efluxo das drogas através de proteínas de membrana celular. Por outro lado, uma alteração nas vias de reparo de DNA também contribui para a resistência tumoral, uma vez que as lesões são removidas antes mesmo de se tornarem citotóxicas para as células, reduzindo assim a efetividade do quimioterápico. Dentre as vias de reparo de DNA, a via do Reparo por Excisão de Nucleotídeos (NER) é uma das mais versáteis, e há estudos que demonstram seu envolvimento em resposta às lesões geradas por antraciclinas. Sendo assim, o objetivo deste trabalho foi avaliar a contribuição dos mecanismos de resposta à dano no DNA, bem como da via NER, na resistência à Mitoxantrona (MXT), um análogo de antraciclinas, na linhagem celular de leucemia HL-60/MX2. Para isso, analisou-se a sobrevivência celular, pelo método de exclusão por azul de tripan, o perfil de ciclo celular e a fosforilação da histona H2AX (γH2AX), por citometria de fluxo, além da análise de expressão gênica da via NER e proteínas de efluxo por qPCR. Os resultados indicam um perfil de resposta diferente entre a linhagem resistente e a linhagem sensível, observado pelo teste de sobrevivência e pelos diferentes perfis de ciclo celular e fosforilação de H2AX. Além disso, a análise de expressão gênica demonstra um aumento na expressão de genes da via NER, como ERCC1 já antes do tratamento e XPA após os tratamentos, na linhagem resistente. Estes resultados demonstram portanto envolvimento desta via de reparo de DNA na resistência tumoral da linhagem HL- 60/MX2. / Chemotherapy is one of the main cancer treatment strategies; however, tumors can show resistance, which makes the treatment partial or totally inefficient. Among the mechanisms that may be related to the resistant profile, the most studied is increased drug efflux through ABC transporter permeases. On the other hand, altered DNA repair pathways may contribute to cancer resistance, since the lesions are removed before they become toxic to cells, which reduces chemotherapy effectiveness. Among DNA repair pathways, Nucleotide Excision Repair (NER) is one of the most versatile, and there are studies showing its involvement in removal of anthracyclines-induced lesions. Thus, our aim was to evaluate the contribution of DNA damage response mechanisms, focusing on NER, to the resistance to Mitoxantrone (MXT), an anthracycline analog, using the mitoxantrone-resistant leukemia cell line HL-60/MX2 as a model. After treatment with MXT and Etoposide (ETO), a topoisomerase II inhibitor, cell survival was assessed by trypan blue exclusion method; cell cycle profile and H2AX histone phosphorylation (γH2AX) were evaluated by flow cytometry; and gene expression levels of NER and efflux proteins were determined by RT-qPCR. Results indicate a different response between the resistant HL-60/MX2 and the sensitive HL-60 cells, as observed in the survival assay, cell cycle, and H2AX phosphorylation profile. Furthermore, in the resistant cells, RTqPCR analysis showed an increase in the expression of NER genes, with ERCC1 expression increased before treatments, and XPA after the treatments. Therefore, our results indicate the contribution of NER machinery in the resistance of leukemia cells to Mitoxantrone.

A quimioterapia é uma das principais estratégias no tratamento do câncer. No entanto, muitos tumores apresentam resistência, tornando o tratamento parcial ou totalmente ineficaz. Existem alguns mecanismos que podem estar relacionados ao desenvolvimento desse perfil de resistência, sendo o mais estudado o aumento do efluxo das drogas através de proteínas de membrana celular. Por outro lado, uma alteração nas vias de reparo de DNA também contribui para a resistência tumoral, uma vez que as lesões são removidas antes mesmo de se tornarem citotóxicas para as células, reduzindo assim a efetividade do quimioterápico. Dentre as vias de reparo de DNA, a via do Reparo por Excisão de Nucleotídeos (NER) é uma das mais versáteis, e há estudos que demonstram seu envolvimento em resposta às lesões geradas por antraciclinas. Sendo assim, o objetivo deste trabalho foi avaliar a contribuição dos mecanismos de resposta à dano no DNA, bem como da via NER, na resistência à Mitoxantrona (MXT), um análogo de antraciclinas, na linhagem celular de leucemia HL-60/MX2. Para isso, analisou-se a sobrevivência celular, pelo método de exclusão por azul de tripan, o perfil de ciclo celular e a fosforilação da histona H2AX (γH2AX), por citometria de fluxo, além da análise de expressão gênica da via NER e proteínas de efluxo por qPCR. Os resultados indicam um perfil de resposta diferente entre a linhagem resistente e a linhagem sensível, observado pelo teste de sobrevivência e pelos diferentes perfis de ciclo celular e fosforilação de H2AX. Além disso, a análise de expressão gênica demonstra um aumento na expressão de genes da via NER, como ERCC1 já antes do tratamento e XPA após os tratamentos, na linhagem resistente. Estes resultados demonstram portanto envolvimento desta via de reparo de DNA na resistência tumoral da linhagem HL- 60/MX2. / Chemotherapy is one of the main cancer treatment strategies; however, tumors can show resistance, which makes the treatment partial or totally inefficient. Among the mechanisms that may be related to the resistant profile, the most studied is increased drug efflux through ABC transporter permeases. On the other hand, altered DNA repair pathways may contribute to cancer resistance, since the lesions are removed before they become toxic to cells, which reduces chemotherapy effectiveness. Among DNA repair pathways, Nucleotide Excision Repair (NER) is one of the most versatile, and there are studies showing its involvement in removal of anthracyclines-induced lesions. Thus, our aim was to evaluate the contribution of DNA damage response mechanisms, focusing on NER, to the resistance to Mitoxantrone (MXT), an anthracycline analog, using the mitoxantrone-resistant leukemia cell line HL-60/MX2 as a model. After treatment with MXT and Etoposide (ETO), a topoisomerase II inhibitor, cell survival was assessed by trypan blue exclusion method; cell cycle profile and H2AX histone phosphorylation (γH2AX) were evaluated by flow cytometry; and gene expression levels of NER and efflux proteins were determined by RT-qPCR. Results indicate a different response between the resistant HL-60/MX2 and the sensitive HL-60 cells, as observed in the survival assay, cell cycle, and H2AX phosphorylation profile. Furthermore, in the resistant cells, RTqPCR analysis showed an increase in the expression of NER genes, with ERCC1 expression increased before treatments, and XPA after the treatments. Therefore, our results indicate the contribution of NER machinery in the resistance of leukemia cells to Mitoxantrone.

Assim como o número de casos de câncer vem aumentando em nível global, a busca por abordagens terapêuticas visando uma maior eficácia com um menor poder de causar efeitos prejudiciais aos pacientes também vem crescendo. As antraciclinas e antracenodionas, as quais tem como exemplos, doxorrubicina (DOX) e mitoxantrona (MTX), respectivamente, são fármacos utilizados na quimioterapia em diversas neoplasias incluindo tumores sólidos e não sólidos tais como de mama, leucemias, linfomas, sarcomas etc. Embora sejam eficazes ao que se propõem, o tratamento com estas moléculas pode acarretar em efeitos secundários, tais como arritmias e insuficiência cardíaca. Estas drogas além de interagirem com o ferro e apresentarem capacidade de gerar espécies reativas de oxigénio (ROS), apresentam como principal mecanismo a inibição da enzima topoisomerase 2 (Top2). Os inibidores de PARP-1 emergiram como uma nova alternativa para tratar determinados tipos de neoplasias em que a letalidade sintética possa ser explorada. Além disto, já foi relatado que a toxicidade cardíaca induzida por DOX seja influenciada pela atividade de PARP-1. O objetivo desta tese foi, portanto, avaliar a influência da inibição de PARP-1 na toxicidade cardíaca de DOX e MTX em células cardíacas. Células foram incubadas durante 24h com DOX ou MTX na presença ou na ausência de inibidor de PARP-1. Ensaios de viabilidade, apoptose e genotoxicidade e foram realizados. Além disso, a fosforilação de proteínas envolvidas na resposta a danos no DNA (ATM, MRE-11 e H2AX) foram avaliadas por western blot e imunofluorescência. Os resultados demonstraram que a inibição de PARP-1, apesar de diminuir a concentração de ROS, diminui a viabilidade de células H9c2 tratadas com DOX ou MTX por aumentar a geração de quebras duplas no DNA induzida por estes fármacos. / As the number of people with cancer are globally increasing, the search for therapeutic approaches that increases efficiency decreasing harmful effects to patients is also growing, giving rise to cardio-oncology. Anthracyclines, e.g., doxorubicin (DOX), and anthracenediones, e.g., mitoxantrone (MTX), are drugs used in the chemotherapy of several cancer types, including solid and non-solid malignancies such as breast cancer, leukemia, lymphomas, and sarcomas. Although they are effective in tumor therapy, treatment with these two drugs may lead to side effects such as arrhythmia and heart failure. These drugs interact with iron to generate reactive oxygen species (ROS), target topoisomerase 2 (Top2), and impair mitochondria. PARP-1 inhibitors have emerged as a new alternative for treating certain types of malignancies in which the synthetic lethality can be exploited. Furthermore, it has been reported that DOX-induced cardiac cardiotoxicity is influenced by PARP-1 activity. The main goal of this thesis was, therefore, to evaluate PARP-1 inhibition influence in cardiac toxicity of DOX and MTX in cardiac cells. Cells were incubated for 24h with MTX or DOX in presence or absence of PARP-1 inhibitor. Viability, oxidative stress and genotoxicity assays have been conducted. Furthermore, phosphorylation of proteins involved in response to DNA damage (ATM, H2AX and MRE-11) were evaluated by western blot and immunofluorescence. Results demonstrated that inhibition of PARP-1, although decreasing ROS generation, decreases H9c2 cells viability after DOX or MTX by increasing DNA double strand break generation induced by these drugs.

Assim como o número de casos de câncer vem aumentando em nível global, a busca por abordagens terapêuticas visando uma maior eficácia com um menor poder de causar efeitos prejudiciais aos pacientes também vem crescendo. As antraciclinas e antracenodionas, as quais tem como exemplos, doxorrubicina (DOX) e mitoxantrona (MTX), respectivamente, são fármacos utilizados na quimioterapia em diversas neoplasias incluindo tumores sólidos e não sólidos tais como de mama, leucemias, linfomas, sarcomas etc. Embora sejam eficazes ao que se propõem, o tratamento com estas moléculas pode acarretar em efeitos secundários, tais como arritmias e insuficiência cardíaca. Estas drogas além de interagirem com o ferro e apresentarem capacidade de gerar espécies reativas de oxigénio (ROS), apresentam como principal mecanismo a inibição da enzima topoisomerase 2 (Top2). Os inibidores de PARP-1 emergiram como uma nova alternativa para tratar determinados tipos de neoplasias em que a letalidade sintética possa ser explorada. Além disto, já foi relatado que a toxicidade cardíaca induzida por DOX seja influenciada pela atividade de PARP-1. O objetivo desta tese foi, portanto, avaliar a influência da inibição de PARP-1 na toxicidade cardíaca de DOX e MTX em células cardíacas. Células foram incubadas durante 24h com DOX ou MTX na presença ou na ausência de inibidor de PARP-1. Ensaios de viabilidade, apoptose e genotoxicidade e foram realizados. Além disso, a fosforilação de proteínas envolvidas na resposta a danos no DNA (ATM, MRE-11 e H2AX) foram avaliadas por western blot e imunofluorescência. Os resultados demonstraram que a inibição de PARP-1, apesar de diminuir a concentração de ROS, diminui a viabilidade de células H9c2 tratadas com DOX ou MTX por aumentar a geração de quebras duplas no DNA induzida por estes fármacos. / As the number of people with cancer are globally increasing, the search for therapeutic approaches that increases efficiency decreasing harmful effects to patients is also growing, giving rise to cardio-oncology. Anthracyclines, e.g., doxorubicin (DOX), and anthracenediones, e.g., mitoxantrone (MTX), are drugs used in the chemotherapy of several cancer types, including solid and non-solid malignancies such as breast cancer, leukemia, lymphomas, and sarcomas. Although they are effective in tumor therapy, treatment with these two drugs may lead to side effects such as arrhythmia and heart failure. These drugs interact with iron to generate reactive oxygen species (ROS), target topoisomerase 2 (Top2), and impair mitochondria. PARP-1 inhibitors have emerged as a new alternative for treating certain types of malignancies in which the synthetic lethality can be exploited. Furthermore, it has been reported that DOX-induced cardiac cardiotoxicity is influenced by PARP-1 activity. The main goal of this thesis was, therefore, to evaluate PARP-1 inhibition influence in cardiac toxicity of DOX and MTX in cardiac cells. Cells were incubated for 24h with MTX or DOX in presence or absence of PARP-1 inhibitor. Viability, oxidative stress and genotoxicity assays have been conducted. Furthermore, phosphorylation of proteins involved in response to DNA damage (ATM, H2AX and MRE-11) were evaluated by western blot and immunofluorescence. Results demonstrated that inhibition of PARP-1, although decreasing ROS generation, decreases H9c2 cells viability after DOX or MTX by increasing DNA double strand break generation induced by these drugs.

Assim como o número de casos de câncer vem aumentando em nível global, a busca por abordagens terapêuticas visando uma maior eficácia com um menor poder de causar efeitos prejudiciais aos pacientes também vem crescendo. As antraciclinas e antracenodionas, as quais tem como exemplos, doxorrubicina (DOX) e mitoxantrona (MTX), respectivamente, são fármacos utilizados na quimioterapia em diversas neoplasias incluindo tumores sólidos e não sólidos tais como de mama, leucemias, linfomas, sarcomas etc. Embora sejam eficazes ao que se propõem, o tratamento com estas moléculas pode acarretar em efeitos secundários, tais como arritmias e insuficiência cardíaca. Estas drogas além de interagirem com o ferro e apresentarem capacidade de gerar espécies reativas de oxigénio (ROS), apresentam como principal mecanismo a inibição da enzima topoisomerase 2 (Top2). Os inibidores de PARP-1 emergiram como uma nova alternativa para tratar determinados tipos de neoplasias em que a letalidade sintética possa ser explorada. Além disto, já foi relatado que a toxicidade cardíaca induzida por DOX seja influenciada pela atividade de PARP-1. O objetivo desta tese foi, portanto, avaliar a influência da inibição de PARP-1 na toxicidade cardíaca de DOX e MTX em células cardíacas. Células foram incubadas durante 24h com DOX ou MTX na presença ou na ausência de inibidor de PARP-1. Ensaios de viabilidade, apoptose e genotoxicidade e foram realizados. Além disso, a fosforilação de proteínas envolvidas na resposta a danos no DNA (ATM, MRE-11 e H2AX) foram avaliadas por western blot e imunofluorescência. Os resultados demonstraram que a inibição de PARP-1, apesar de diminuir a concentração de ROS, diminui a viabilidade de células H9c2 tratadas com DOX ou MTX por aumentar a geração de quebras duplas no DNA induzida por estes fármacos. / As the number of people with cancer are globally increasing, the search for therapeutic approaches that increases efficiency decreasing harmful effects to patients is also growing, giving rise to cardio-oncology. Anthracyclines, e.g., doxorubicin (DOX), and anthracenediones, e.g., mitoxantrone (MTX), are drugs used in the chemotherapy of several cancer types, including solid and non-solid malignancies such as breast cancer, leukemia, lymphomas, and sarcomas. Although they are effective in tumor therapy, treatment with these two drugs may lead to side effects such as arrhythmia and heart failure. These drugs interact with iron to generate reactive oxygen species (ROS), target topoisomerase 2 (Top2), and impair mitochondria. PARP-1 inhibitors have emerged as a new alternative for treating certain types of malignancies in which the synthetic lethality can be exploited. Furthermore, it has been reported that DOX-induced cardiac cardiotoxicity is influenced by PARP-1 activity. The main goal of this thesis was, therefore, to evaluate PARP-1 inhibition influence in cardiac toxicity of DOX and MTX in cardiac cells. Cells were incubated for 24h with MTX or DOX in presence or absence of PARP-1 inhibitor. Viability, oxidative stress and genotoxicity assays have been conducted. Furthermore, phosphorylation of proteins involved in response to DNA damage (ATM, H2AX and MRE-11) were evaluated by western blot and immunofluorescence. Results demonstrated that inhibition of PARP-1, although decreasing ROS generation, decreases H9c2 cells viability after DOX or MTX by increasing DNA double strand break generation induced by these drugs.

A mitoxantrona (MXT) é um antineoplásico utilizado no tratamento de tumores como leucemias, linfoma não-Hodgkin e câncer de mama e próstata. Ela é classificada como uma antracenodiona, sendo um análogo estrutural das antraciclinas, como a doxorrubicina (DOX), cujo mecanismo de ação é baseado na inibição da enzima topoisomerase II (Topo II), através da formação dos complexos estabilizados Topo II-DNA. As antraciclinas e a MXT também são capazes de formar lesões do tipo adutos, pontes intercadeias de DNA (interstrand crosslink – ICL) e espécies reativas de oxigênio (ERO). Estudos têm demonstrado que a via de reparo por excisão de nucleotídeos (Nucleotide Excision Repair – NER) está envolvido na remoção de lesões no DNA induzidas pela DOX. Considerando as similaridades estruturais e de mecanismo de ação entre a MXT e a DOX, o objetivo deste trabalho foi avaliar a influência da via NER na citotoxicidade da MXT, a fim de elucidar possíveis mecanismos envolvidos na resistência tumoral a esta droga. Os resultados encontrados demonstraram que células deficientes na via NER (XPA, XPD, XPC e CSB) apresentam elevada sensibilidade a MXT comparadas a células proficientes em reparo (MRC5). Apesar disso, células CSB (deficientes na subvia associada à transcrição - Transcription coupled – TCR-NER) são mais sensíveis a MXT que células XPC (deficientes na subvia de reparo global do genoma – Global genome repair – GGR-NER) e também apresentam diferenças no perfil de ciclo celular, síntese de DNA e formação dos complexos Topo II-DNA após tratamento com MXT. Células XPC, da mesma forma que as células proficientes MRC5 apresentam parada de ciclo celular em G2/M, recuperação da síntese de DNA e sinal semelhante para formação dos complexos Topo II-DNA, enquanto células CSB apresentam acúmulo de células na fase S, diminuição na síntese de DNA e sinal mais intenso para formação dos complexos Topo II-DNA. Além disso, a complementação das células CSB com a proteína CSB recuperou a resistência das células a MXT e também diminuiu a intensidade do sinal dos complexos Topo II-DNA. Estes resultados indicaram que a via NER está envolvida na resistência das células ao tratamento com MXT e que a proteína CSB ou a subvia TCR-NER tem um papel chave no processamento dos complexos Topo II-DNA. / Mitoxantrone (MXT) is an antineoplastic drug used in treatment of tumors like leukemia, non-Hodgkin lymphoma and breast and prostate cancer. It is classified as an anthracenedione, being a structural analogue of anthracyclines, like doxorubicin (DOX), which action mechanism is based on topoisomerase II (Topo II) inhibition and formation of stabilized Topo II-DNA complexes. Anthracyclines and MXT also can form lesions like DNA adducts, interstrand crosslinks (ICL) and reactive oxygen species (ROS). Studies have shown that nucleotide excision repair (NER) pathway is involved in removal of lesions induced by DOX. Due to structural and action mechanism similarities between MXT and DOX, the aim of this work was to evaluate the influence of NER pathway in cytotoxicity of MXT, in order to elucidate possible mechanisms involved in tumor resistance to this drug. The results demonstrated that NER-deficient cells (XPA, XPD, XPC and CSB) show high sensitivity to MXT compared to repair proficient cells (MRC5). However, CSB cells (deficient in Transcription coupled repair – TCR) were more sensitive to MXT than XPC cells (deficient in Global genome repair – GGR) and also showed differences in cell cycle, DNA synthesis and Topo II-DNA complexes formation upon MXT treatment. XPC cells, in the same way as MRC5 proficient cells present G2/M cell cycle arrest, DNA synthesis recovery and similar signal for Topo II-DNA complexes formation, while CSB cells present accumulation of cells in S phase, reduced DNA synthesis and a more intense signal for Topo II-DNA complexes formation. Moreover, CSB cells complementation recovery MXT-resistance and also diminished Topo II-DNA complexes signal intensity. These results indicate that NER pathway is involved in cells resistance to MXT treatment and that CSB protein or TCR-NER sub pathway has a key role in processing of MXT induced Topo II-DNA complexes.

A mitoxantrona (MXT) é um antineoplásico utilizado no tratamento de tumores como leucemias, linfoma não-Hodgkin e câncer de mama e próstata. Ela é classificada como uma antracenodiona, sendo um análogo estrutural das antraciclinas, como a doxorrubicina (DOX), cujo mecanismo de ação é baseado na inibição da enzima topoisomerase II (Topo II), através da formação dos complexos estabilizados Topo II-DNA. As antraciclinas e a MXT também são capazes de formar lesões do tipo adutos, pontes intercadeias de DNA (interstrand crosslink – ICL) e espécies reativas de oxigênio (ERO). Estudos têm demonstrado que a via de reparo por excisão de nucleotídeos (Nucleotide Excision Repair – NER) está envolvido na remoção de lesões no DNA induzidas pela DOX. Considerando as similaridades estruturais e de mecanismo de ação entre a MXT e a DOX, o objetivo deste trabalho foi avaliar a influência da via NER na citotoxicidade da MXT, a fim de elucidar possíveis mecanismos envolvidos na resistência tumoral a esta droga. Os resultados encontrados demonstraram que células deficientes na via NER (XPA, XPD, XPC e CSB) apresentam elevada sensibilidade a MXT comparadas a células proficientes em reparo (MRC5). Apesar disso, células CSB (deficientes na subvia associada à transcrição - Transcription coupled – TCR-NER) são mais sensíveis a MXT que células XPC (deficientes na subvia de reparo global do genoma – Global genome repair – GGR-NER) e também apresentam diferenças no perfil de ciclo celular, síntese de DNA e formação dos complexos Topo II-DNA após tratamento com MXT. Células XPC, da mesma forma que as células proficientes MRC5 apresentam parada de ciclo celular em G2/M, recuperação da síntese de DNA e sinal semelhante para formação dos complexos Topo II-DNA, enquanto células CSB apresentam acúmulo de células na fase S, diminuição na síntese de DNA e sinal mais intenso para formação dos complexos Topo II-DNA. Além disso, a complementação das células CSB com a proteína CSB recuperou a resistência das células a MXT e também diminuiu a intensidade do sinal dos complexos Topo II-DNA. Estes resultados indicaram que a via NER está envolvida na resistência das células ao tratamento com MXT e que a proteína CSB ou a subvia TCR-NER tem um papel chave no processamento dos complexos Topo II-DNA. / Mitoxantrone (MXT) is an antineoplastic drug used in treatment of tumors like leukemia, non-Hodgkin lymphoma and breast and prostate cancer. It is classified as an anthracenedione, being a structural analogue of anthracyclines, like doxorubicin (DOX), which action mechanism is based on topoisomerase II (Topo II) inhibition and formation of stabilized Topo II-DNA complexes. Anthracyclines and MXT also can form lesions like DNA adducts, interstrand crosslinks (ICL) and reactive oxygen species (ROS). Studies have shown that nucleotide excision repair (NER) pathway is involved in removal of lesions induced by DOX. Due to structural and action mechanism similarities between MXT and DOX, the aim of this work was to evaluate the influence of NER pathway in cytotoxicity of MXT, in order to elucidate possible mechanisms involved in tumor resistance to this drug. The results demonstrated that NER-deficient cells (XPA, XPD, XPC and CSB) show high sensitivity to MXT compared to repair proficient cells (MRC5). However, CSB cells (deficient in Transcription coupled repair – TCR) were more sensitive to MXT than XPC cells (deficient in Global genome repair – GGR) and also showed differences in cell cycle, DNA synthesis and Topo II-DNA complexes formation upon MXT treatment. XPC cells, in the same way as MRC5 proficient cells present G2/M cell cycle arrest, DNA synthesis recovery and similar signal for Topo II-DNA complexes formation, while CSB cells present accumulation of cells in S phase, reduced DNA synthesis and a more intense signal for Topo II-DNA complexes formation. Moreover, CSB cells complementation recovery MXT-resistance and also diminished Topo II-DNA complexes signal intensity. These results indicate that NER pathway is involved in cells resistance to MXT treatment and that CSB protein or TCR-NER sub pathway has a key role in processing of MXT induced Topo II-DNA complexes.

A mitoxantrona (MXT) é um antineoplásico utilizado no tratamento de tumores como leucemias, linfoma não-Hodgkin e câncer de mama e próstata. Ela é classificada como uma antracenodiona, sendo um análogo estrutural das antraciclinas, como a doxorrubicina (DOX), cujo mecanismo de ação é baseado na inibição da enzima topoisomerase II (Topo II), através da formação dos complexos estabilizados Topo II-DNA. As antraciclinas e a MXT também são capazes de formar lesões do tipo adutos, pontes intercadeias de DNA (interstrand crosslink – ICL) e espécies reativas de oxigênio (ERO). Estudos têm demonstrado que a via de reparo por excisão de nucleotídeos (Nucleotide Excision Repair – NER) está envolvido na remoção de lesões no DNA induzidas pela DOX. Considerando as similaridades estruturais e de mecanismo de ação entre a MXT e a DOX, o objetivo deste trabalho foi avaliar a influência da via NER na citotoxicidade da MXT, a fim de elucidar possíveis mecanismos envolvidos na resistência tumoral a esta droga. Os resultados encontrados demonstraram que células deficientes na via NER (XPA, XPD, XPC e CSB) apresentam elevada sensibilidade a MXT comparadas a células proficientes em reparo (MRC5). Apesar disso, células CSB (deficientes na subvia associada à transcrição - Transcription coupled – TCR-NER) são mais sensíveis a MXT que células XPC (deficientes na subvia de reparo global do genoma – Global genome repair – GGR-NER) e também apresentam diferenças no perfil de ciclo celular, síntese de DNA e formação dos complexos Topo II-DNA após tratamento com MXT. Células XPC, da mesma forma que as células proficientes MRC5 apresentam parada de ciclo celular em G2/M, recuperação da síntese de DNA e sinal semelhante para formação dos complexos Topo II-DNA, enquanto células CSB apresentam acúmulo de células na fase S, diminuição na síntese de DNA e sinal mais intenso para formação dos complexos Topo II-DNA. Além disso, a complementação das células CSB com a proteína CSB recuperou a resistência das células a MXT e também diminuiu a intensidade do sinal dos complexos Topo II-DNA. Estes resultados indicaram que a via NER está envolvida na resistência das células ao tratamento com MXT e que a proteína CSB ou a subvia TCR-NER tem um papel chave no processamento dos complexos Topo II-DNA. / Mitoxantrone (MXT) is an antineoplastic drug used in treatment of tumors like leukemia, non-Hodgkin lymphoma and breast and prostate cancer. It is classified as an anthracenedione, being a structural analogue of anthracyclines, like doxorubicin (DOX), which action mechanism is based on topoisomerase II (Topo II) inhibition and formation of stabilized Topo II-DNA complexes. Anthracyclines and MXT also can form lesions like DNA adducts, interstrand crosslinks (ICL) and reactive oxygen species (ROS). Studies have shown that nucleotide excision repair (NER) pathway is involved in removal of lesions induced by DOX. Due to structural and action mechanism similarities between MXT and DOX, the aim of this work was to evaluate the influence of NER pathway in cytotoxicity of MXT, in order to elucidate possible mechanisms involved in tumor resistance to this drug. The results demonstrated that NER-deficient cells (XPA, XPD, XPC and CSB) show high sensitivity to MXT compared to repair proficient cells (MRC5). However, CSB cells (deficient in Transcription coupled repair – TCR) were more sensitive to MXT than XPC cells (deficient in Global genome repair – GGR) and also showed differences in cell cycle, DNA synthesis and Topo II-DNA complexes formation upon MXT treatment. XPC cells, in the same way as MRC5 proficient cells present G2/M cell cycle arrest, DNA synthesis recovery and similar signal for Topo II-DNA complexes formation, while CSB cells present accumulation of cells in S phase, reduced DNA synthesis and a more intense signal for Topo II-DNA complexes formation. Moreover, CSB cells complementation recovery MXT-resistance and also diminished Topo II-DNA complexes signal intensity. These results indicate that NER pathway is involved in cells resistance to MXT treatment and that CSB protein or TCR-NER sub pathway has a key role in processing of MXT induced Topo II-DNA complexes.