As proteínas E2 promoter binding factor (E2F) estão presentes em quase todos os organismos eucarióticos e são essenciais para o controle de muitos processos celulares, como a progressão do ciclo celular, divisão celular, replicação do DNA, e apoptose. A família E2F compreende dois tipos diferentes de proteínas: os E2F típicos e os E2F atípicos, que diferem estruturalmente e possuem funções específicas. Desde a descoberta desta família gênica muitos estudos focaram nos seus aspectos funcionais, porém a história evolutiva desta família gênica estava fracamente entendida em plantas. Nossas descobertas sugerem que os E2F típicos são mais similares a proteína ancestral que os E2F atípicos (DEL). As proteínas E2F surgiram logo após a emergência das espécies eucarióticas, enquanto as proteínas DEL parecem ter surgido antes da separação entre fungos, metazoários e plantas. As proteínas DEL provavelmente emergiram por uma duplicação parcial do gene que codificava a proteína E2F ancestral. Nossos dados também sugerem que a divergência entre E2Fs ativadores e repressores emergiu duas vezes durante a evolução, uma na linhagem embriófita de plantas e outra na linhagem metazoária. Os E2Fs típicos possuem membros que são reguladores positivos para os seus genes alvo e dados recentes estabeleceram um link entre a resposta a danos ao DNA e genes E2F específicos em células de mamíferos, porém o envolvimento da família genica E2F na sinalização ao reparo de DNA em plantas ainda permanece desconhecido. Nós estudamos o envolvimento dos genes E2F em resposta a dano genotóxico em plantas de arroz e Arabidopsis thaliana. Foram conduzidos experimentos com plântulas de arroz e arabidopsis usando UV-B e MMS (Methyl Methanesulfonate) como fonte de danos genotóxicos. Em resposta a estes estresses E2F ativadores específicos aumentaram sua expressão relativa quando comparados com plantas em condições controle. Os resultados obtidos nos experimentos de estresse genotóxicos nos levaram a sugerir que membros específicos da família E2F de arroz e arabidopsis estão envolvidos com as respostas ao dano de DNA. / The E2 promoter binding factor (E2F) proteins are present in almost all eukaryotic organisms and are essential to control several cellular processes, such as the cell cycle progression, cell division, DNA replication, and apoptosis. The E2F family comprises two different types of proteins: the typical E2Fs and atypical E2Fs, which differ structurally and have specific functions. Since the discovery of this gene family several studies have focused on the functional aspects, but the evolutionary history of this gene family was poorly understood in plants. Our findings suggest that typical E2F is more similar to the ancestral protein than atypical E2F (DEL). The E2F proteins arose early after the emergence of the eukaryotic species, while DEL proteins appear to have arisen after the separation of fungi, metazoan and plants. The DEL proteins probably emerged through a partial duplication from the gene that encodes the ancient E2F protein. Our data also suggest that the divergence of the E2Fs between activators and repressors emerged twice during evolution, once in the embryophyte lineage and another in the metazoan lineage. The typical E2Fs has members that are positive regulators for their target genes and recent data have established a link between response to DNA damage and specific E2F genes in mammalian cells, but the involvement of the E2F gene family in the signaling of DNA repair in plants still unknown. We studied the involvement of E2F genes in response to genotoxic damage in rice and Arabidopsis thaliana plants. Experiments were conducted with rice and A. thaliana plantlets using UV-B and MMS (Methyl Methanesulfonate) as genotoxic damage souce. In response to these stresses specific activator E2F genes increased their relative expression compared to plants in control condition. The results obtained in the genotoxic stress experiments lead us to suggest that specific members of the E2F family of rice and arabidopsis are involved with responses to DNA damage.

SOMBRA, Carla Maria Lima. Biomonitoramento genotóxico e genético como indicador de risco à saúde por exposição ao urânio de residentes dos municípios de Monte Alegre, Prainha e Alenquer no estado do Pará. 2009. 96 f. Dissertação (Mestrado em Farmacologia) - Universidade Federal do Ceará. Faculdade de Medicina, Fortaleza, 2009. / Submitted by denise santos (denise.santos@ufc.br) on 2012-03-07T15:26:51Z No. of bitstreams: 1 2009_dis_cmlsombra.pdf: 1392819 bytes, checksum: 8fd513bea0a95bdd949d552162270985 (MD5) / Approved for entry into archive by Eliene Nascimento(elienegvn@hotmail.com) on 2012-03-08T11:26:34Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2009_dis_cmlsombra.pdf: 1392819 bytes, checksum: 8fd513bea0a95bdd949d552162270985 (MD5) / Made available in DSpace on 2012-03-08T11:26:34Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2009_dis_cmlsombra.pdf: 1392819 bytes, checksum: 8fd513bea0a95bdd949d552162270985 (MD5) Previous issue date: 2009 / Radiation is considered a risk factor for the development of several types of cancers caused by damage into the DNA molecule and is of extreme importance, therefore, the monitoring of human populations exposed to it. The municipality of Monte Alegre in the state of Pará in Brazil has one of the largest uranium mining areas of the world, which extends to the neighboring municipalities of Prainha and Alenquer. This work assessed the genotoxic potential of exposure to uranium in rocks found in dwellings in individuals from the municipalities of Monte Alegre, Prainha and Alenquer through the alkaline comet assay in peripheral blood lymphocytes and the determination of the frequencies of polymorphisms in DNA repair genes XRCC1 and XRCC3 and in carcinogen-metabolism gene GSTM1 through direct DNA sequencing. The analysis of the alkaline comet assay indicated that there was no statistically significant difference between the Damage Indexes (DIs) of Monte Alegre (DI = 32.01 ± 1.57), Prainha (DI = 45.80 ± 1.12) and Alenquer (DI = 44.30 ± 0.62) and of the negative control (DI = 42.00 ± 5.75) (p > 0.05). Through direct DNA sequencing, there were polymorphisms in XRCC1 and XRCC3 genes in regions of introns and exons. In XRCC1 gene, the variant allele frequencies for Arg194Trp polymorphism in Monte Alegre, Prainha and Alenquer populations were 12%, 13% and 7%, and for Arg399Gln, 28%, 30% and 32% respectively. In XRCC3 gene, the frequencies of the variant allele of Thr241Met polymorphism found in Monte Alegre, Prainha and Alenquer populations were, respectively, 28%, 13% and 33%. For GSTM1 gene, the frequencies obtained for the absence of this gene were 36%, 31% and 40%, respectively to Monte Alegre, Prainha and Alenquer populations. In general, the absence frequencies of GSTM1 gene and of allelic frequencies in XRCC1 and XRCC3 exons were statistically similar among the three municipalities and were in agreement with frequencies obtained in other studies with Brazilian populations. As a conclusion, among the populations studied, there was no increased incidence of DNA damage by exposure to uranium, which can be explained by the low radiation in these locations and that the allelic frequencies of polymorphisms found in the DNA repair genes XRCC1 and XRCC3, and the absence frequencies of GSTM1 gene did not differ from those in populations from other regions of Brazil. Thus, in the studied area, possibly there is no tendency to the development of cancer induced by exposure to uranium. / A radiação ionizante é considerada um fator de risco para o desenvolvimento de diversos tipos de neoplasias pelos danos causados à molécula de DNA, sendo de extrema importância, portanto, o monitoramento de populações humanas expostas a ela. O município de Monte Alegre no estado do Pará apresenta uma das maiores áreas de mineração do urânio do mundo, que se estende aos municípios vizinhos de Prainha e Alenquer. Este trabalho teve como objetivos a avaliação do potencial genotóxico do urânio presente em rochas nas residências de indivíduos dos municípios de Monte Alegre, Prainha e Alenquer através do ensaio do cometa alcalino em linfócitos periféricos e a determinação das freqüências de polimorfismos nos genes de reparo do DNA XRCC1 e XRCC3 e no gene de metabolização GSTM1 através de seqüenciamento direto de DNA. Na análise do cometa alcalino, não houve diferença estatisticamente significante entre os Índices de Dano (IDs) das populações de Monte Alegre (ID = 32,01 ± 1,57), Prainha (ID = 45,80 ± 1,12) e Alenquer (ID = 44,30 ± 0,62) e o do controle negativo (ID = 42,00 ± 5,75) (p > 0,05). Através do seqüenciamento direto de DNA, observou-se a presença de polimorfismos nos genes XRCC1 e XRCC3 em regiões de íntrons e de éxons. No gene XRCC1, as freqüências alélicas variantes para o polimorfismo Arg194Trp nas populações de Monte Alegre, Prainha e Alenquer foram 12%, 13% e 7% e, para Arg399Gln, 28%, 30% e 32%, respectivamente. No gene XRCC3, as freqüências do alelo variante do polimorfismo Thr241Met encontradas nas populações de Monte Alegre, Prainha e Alenquer foram, respectivamente, 28%, 13% e 33%. Em relação ao gene GSTM1, as freqüências obtidas de ausência do gene apresentaram os valores de 36%, 31% e 40%, respectivamente às populações de Monte Alegre, Prainha e Alenquer. No geral, todas as freqüências alélicas nos éxons dos genes XRCC1 e XRCC3 e de ausência do gene GSTM1 foram estatisticamente semelhantes entre os três municípios e se mostraram em concordância com freqüências obtidas em outros estudos com populações brasileiras. Conclui-se que, dentre as populações estudadas, não houve aumento da incidência de dano ao DNA pela exposição ao urânio, o que pode se explicar pela baixa radiação nessas localidades. Além disso, as freqüências alélicas dos polimorfismos encontrados nos genes de reparo XRCC1 e XRCC3, assim como as de ausência do gene de metabolização GSTM1 não diferiram das encontradas em populações de outras regiões do Brasil. Desse modo, nas regiões estudadas, possivelmente não existe tendência ao desenvolvimento de câncer induzido pela exposição ao urânio.

BARROS, Francisco Washington Araújo. Estudo do potencial anticâncer de novos derivados acridínicos sintéticos em modelos experimentais in vitro. 2010. 139 f. Dissertação (Mestrado em Farmacologia) - Universidade Federal do Ceará. Faculdade de Medicina, Fortaleza, 2010. / Submitted by denise santos (denise.santos@ufc.br) on 2012-03-27T13:36:44Z No. of bitstreams: 1 2010_dis_fwabarros.pdf: 13241178 bytes, checksum: e06546c078af5823915b1be26bf86536 (MD5) / Approved for entry into archive by Eliene Nascimento(elienegvn@hotmail.com) on 2012-03-27T15:59:15Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2010_dis_fwabarros.pdf: 13241178 bytes, checksum: e06546c078af5823915b1be26bf86536 (MD5) / Made available in DSpace on 2012-03-27T15:59:15Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2010_dis_fwabarros.pdf: 13241178 bytes, checksum: e06546c078af5823915b1be26bf86536 (MD5) Previous issue date: 2010 / Acridines are planar aromatic polycyclic molecules that have the ability to progress in nuclear DNA. Many of its representatives have antibacterial, antiparasitic and antitumor. This study evaluated the cytotoxic potential of 22 new acridine compounds in strains of human tumor cells. Among these, four compounds [5-(acridin-9-yl-methilene)-3-(4-methyl-benzyl)-thiazolidine-2,4-dione, AC4; 5-(acridin-9-yl-methilene)-3-(4-bromine-benzyl)-thiazolidine-2,4-dione, AC7; 5-(acridin-9-yl-methilene)-3-(4-chloro-benzyl)-thiazolidine-2,4-dione, AC10; and 5-(acridin-9-yl-methilene)-3-(4-fluor-benzyl)-thiazolidine-2,4-dione, AC23] were active, especially in HCT-8 (colon) and SF-296 (glioblastoma), with IC50 values ranging from 2.3 to 5.3 mg / mL. The compounds were selective for tumor cells, provided they do not inhibit (IC50 > 25 µg/mL) cell proliferation monocucleares human peripheral blood (CMSPH) and were not able to induce DNA damage to these cells. None of the compounds showed hemolytic activity against erythrocytes of mice (EC50 > 200 µg/mL), suggesting a cytotoxicity by more specific mechanisms. In order to determine the mechanism involved in the selective cytotoxicity of compounds was carried out a sequence of in vitro experiments, using the line HCT-8 as a model. The cells were treated in different concentrations of compounds (2.5, 5 and 10 µg/mL) for 12 and 24 hours. All compounds were able to reduce the viability test (trypan blue) and proliferation (BrdU assay) of HCT-8 cells after treatment. Induction of apoptosis by acridine derivatives was determined by flow cytometry (membrane integrity, DNA fragmentation and internucleosomal transmembrane potential) and morphological analysis of cellular changes (ethidium bromide/acridine orange, and hematoxylin-eosin). The analysis by flow cytometry showed that the compounds evaluated promoted mitochondrial depolarization, which shows the activation of apoptosis by intrinsic pathway in HCT-8 cells. In the analysis of screening in 3 different mutant strains of Saccharomyces cerevisiae, it was observed that the line Top1Δ (without topoisomerase I) showed resistance to acridine compounds tested at a concentration of 50 µg/mL. In addition, the acridines partially inhibited the relaxation of DNA by topoisomerase I, suggesting that the compounds AC4, AC7, AC10, AC23 has the potential antiproliferative partly related to inhibition of catalytic activity of this enzyme. These data indicate the potential anticancer compounds tested. / Acridinas são moléculas policíclicas aromáticas planares que possuem a capacidade de intercalar no DNA nuclear. Muitos dos seus representantes apresentam propriedades antibacterianas, antiparasitárias e antitumorais. O presente estudo avaliou o potencial citotóxico de 22 novos compostos acridínicos em linhagens de células tumorais humanas. Dentre esses, quatro compostos [5-(acridin-9-il-metileno)-3-(4-metil-benzil)-tiazolidina-2,4-diona, AC4; 5-(acridin-9-il-metileno)-3-(4-bromo-benzil)-tiazolidina-2,4-diona, AC7; 5-(acridin-9-il-metileno)-3-(4-cloro-benzil)-tiazolidina-2,4-diona, AC10; e 5-(acridin-9-il-metileno)-3-(4-flúor-benzil)-tiazolidina-2,4-diona, AC23] foram ativos, especialmente em HCT-8 (cólon) e SF-296 (glioblastoma), com valores de CI50 variando de 2,3 a 5,3 µg/mL. Os compostos apresentaram seletividade para células tumorais, desde que não inibiram (IC50 > 25 µg/mL) a proliferação de células monocucleares de sangue periférico humano (CMSPH), bem como, não foram capazes de induzir dano ao DNA dessas células. Nenhum dos compostos mostrou atividade hemolítica contra eritrócitos de camundongos (EC50 > 200 µg/mL), o que sugere uma citotoxicidade por mecanismos mais específicos. A fim de determinar o mecanismo envolvido na citotoxicidade seletiva dos compostos, foi realizada uma seqüência de experimentos in vitro, usando a linhagem HCT-8 como modelo. As células foram tratadas em diferentes concentrações dos compostos (2,5; 5 e 10 µg/mL) por 12 e 24 horas. Todos os compostos foram capazes de reduzir a viabilidade (teste do azul de tripan) e a proliferação (ensaio do BrdU) de células HCT-8 após o tratamento. A indução de apoptose pelos derivados acridínicos foi determinada por citometria de fluxo (integridade da membrana, fragmentação do DNA internucleosomal e potencial transmembrânico) e por análise morfológica das alterações celulares (brometo de etídeo/laranja de acridina e hematoxilina/eosina). A análise por citometria de fluxo revelou que os compostos avaliados promoveram despolarização mitocondrial, o qual evidencia a ativação da apoptose pela via intrínseca nas células HCT-8. Na análise do screening em 3 diferentes linhagens mutantes de Saccharomyces cerevisiae, foi observado que a linhagem Top1Δ (sem topoisomerase I) mostrou moderada resistência aos compostos acridínicos testados na concentração de 50 µg/mL. Além disso, as acridinas inibiram parcialmente o relaxamento do DNA por topoisomerase I, sugerindo que os compostos AC4, AC7, AC10, AC23 tem o potencial antiproliferativo, em parte, relacionado a inibição da atividade catalítica desta enzima. Esses dados apontam o potencial anticâncer dos compostos testados.

As proteínas E2 promoter binding factor (E2F) estão presentes em quase todos os organismos eucarióticos e são essenciais para o controle de muitos processos celulares, como a progressão do ciclo celular, divisão celular, replicação do DNA, e apoptose. A família E2F compreende dois tipos diferentes de proteínas: os E2F típicos e os E2F atípicos, que diferem estruturalmente e possuem funções específicas. Desde a descoberta desta família gênica muitos estudos focaram nos seus aspectos funcionais, porém a história evolutiva desta família gênica estava fracamente entendida em plantas. Nossas descobertas sugerem que os E2F típicos são mais similares a proteína ancestral que os E2F atípicos (DEL). As proteínas E2F surgiram logo após a emergência das espécies eucarióticas, enquanto as proteínas DEL parecem ter surgido antes da separação entre fungos, metazoários e plantas. As proteínas DEL provavelmente emergiram por uma duplicação parcial do gene que codificava a proteína E2F ancestral. Nossos dados também sugerem que a divergência entre E2Fs ativadores e repressores emergiu duas vezes durante a evolução, uma na linhagem embriófita de plantas e outra na linhagem metazoária. Os E2Fs típicos possuem membros que são reguladores positivos para os seus genes alvo e dados recentes estabeleceram um link entre a resposta a danos ao DNA e genes E2F específicos em células de mamíferos, porém o envolvimento da família genica E2F na sinalização ao reparo de DNA em plantas ainda permanece desconhecido. Nós estudamos o envolvimento dos genes E2F em resposta a dano genotóxico em plantas de arroz e Arabidopsis thaliana. Foram conduzidos experimentos com plântulas de arroz e arabidopsis usando UV-B e MMS (Methyl Methanesulfonate) como fonte de danos genotóxicos. Em resposta a estes estresses E2F ativadores específicos aumentaram sua expressão relativa quando comparados com plantas em condições controle. Os resultados obtidos nos experimentos de estresse genotóxicos nos levaram a sugerir que membros específicos da família E2F de arroz e arabidopsis estão envolvidos com as respostas ao dano de DNA. / The E2 promoter binding factor (E2F) proteins are present in almost all eukaryotic organisms and are essential to control several cellular processes, such as the cell cycle progression, cell division, DNA replication, and apoptosis. The E2F family comprises two different types of proteins: the typical E2Fs and atypical E2Fs, which differ structurally and have specific functions. Since the discovery of this gene family several studies have focused on the functional aspects, but the evolutionary history of this gene family was poorly understood in plants. Our findings suggest that typical E2F is more similar to the ancestral protein than atypical E2F (DEL). The E2F proteins arose early after the emergence of the eukaryotic species, while DEL proteins appear to have arisen after the separation of fungi, metazoan and plants. The DEL proteins probably emerged through a partial duplication from the gene that encodes the ancient E2F protein. Our data also suggest that the divergence of the E2Fs between activators and repressors emerged twice during evolution, once in the embryophyte lineage and another in the metazoan lineage. The typical E2Fs has members that are positive regulators for their target genes and recent data have established a link between response to DNA damage and specific E2F genes in mammalian cells, but the involvement of the E2F gene family in the signaling of DNA repair in plants still unknown. We studied the involvement of E2F genes in response to genotoxic damage in rice and Arabidopsis thaliana plants. Experiments were conducted with rice and A. thaliana plantlets using UV-B and MMS (Methyl Methanesulfonate) as genotoxic damage souce. In response to these stresses specific activator E2F genes increased their relative expression compared to plants in control condition. The results obtained in the genotoxic stress experiments lead us to suggest that specific members of the E2F family of rice and arabidopsis are involved with responses to DNA damage.

As proteínas E2 promoter binding factor (E2F) estão presentes em quase todos os organismos eucarióticos e são essenciais para o controle de muitos processos celulares, como a progressão do ciclo celular, divisão celular, replicação do DNA, e apoptose. A família E2F compreende dois tipos diferentes de proteínas: os E2F típicos e os E2F atípicos, que diferem estruturalmente e possuem funções específicas. Desde a descoberta desta família gênica muitos estudos focaram nos seus aspectos funcionais, porém a história evolutiva desta família gênica estava fracamente entendida em plantas. Nossas descobertas sugerem que os E2F típicos são mais similares a proteína ancestral que os E2F atípicos (DEL). As proteínas E2F surgiram logo após a emergência das espécies eucarióticas, enquanto as proteínas DEL parecem ter surgido antes da separação entre fungos, metazoários e plantas. As proteínas DEL provavelmente emergiram por uma duplicação parcial do gene que codificava a proteína E2F ancestral. Nossos dados também sugerem que a divergência entre E2Fs ativadores e repressores emergiu duas vezes durante a evolução, uma na linhagem embriófita de plantas e outra na linhagem metazoária. Os E2Fs típicos possuem membros que são reguladores positivos para os seus genes alvo e dados recentes estabeleceram um link entre a resposta a danos ao DNA e genes E2F específicos em células de mamíferos, porém o envolvimento da família genica E2F na sinalização ao reparo de DNA em plantas ainda permanece desconhecido. Nós estudamos o envolvimento dos genes E2F em resposta a dano genotóxico em plantas de arroz e Arabidopsis thaliana. Foram conduzidos experimentos com plântulas de arroz e arabidopsis usando UV-B e MMS (Methyl Methanesulfonate) como fonte de danos genotóxicos. Em resposta a estes estresses E2F ativadores específicos aumentaram sua expressão relativa quando comparados com plantas em condições controle. Os resultados obtidos nos experimentos de estresse genotóxicos nos levaram a sugerir que membros específicos da família E2F de arroz e arabidopsis estão envolvidos com as respostas ao dano de DNA. / The E2 promoter binding factor (E2F) proteins are present in almost all eukaryotic organisms and are essential to control several cellular processes, such as the cell cycle progression, cell division, DNA replication, and apoptosis. The E2F family comprises two different types of proteins: the typical E2Fs and atypical E2Fs, which differ structurally and have specific functions. Since the discovery of this gene family several studies have focused on the functional aspects, but the evolutionary history of this gene family was poorly understood in plants. Our findings suggest that typical E2F is more similar to the ancestral protein than atypical E2F (DEL). The E2F proteins arose early after the emergence of the eukaryotic species, while DEL proteins appear to have arisen after the separation of fungi, metazoan and plants. The DEL proteins probably emerged through a partial duplication from the gene that encodes the ancient E2F protein. Our data also suggest that the divergence of the E2Fs between activators and repressors emerged twice during evolution, once in the embryophyte lineage and another in the metazoan lineage. The typical E2Fs has members that are positive regulators for their target genes and recent data have established a link between response to DNA damage and specific E2F genes in mammalian cells, but the involvement of the E2F gene family in the signaling of DNA repair in plants still unknown. We studied the involvement of E2F genes in response to genotoxic damage in rice and Arabidopsis thaliana plants. Experiments were conducted with rice and A. thaliana plantlets using UV-B and MMS (Methyl Methanesulfonate) as genotoxic damage souce. In response to these stresses specific activator E2F genes increased their relative expression compared to plants in control condition. The results obtained in the genotoxic stress experiments lead us to suggest that specific members of the E2F family of rice and arabidopsis are involved with responses to DNA damage.

Orientador: Ana Lúcia dos Anjos Ferreira / Resumo: Introdução: É desconhecido o papel do estresse oxidativo durante a evolução dacardiotoxicidade crônica induzida por múltiplas doses de doxorrubicina (DOX).Objetivo: Avaliar a evolução da cardiotoxicidade induzida por doxorrubicina pormeio da avaliação clínica, necropsia; análise morfológica, capacidade antioxidantetotal e lesão do DNA miocárdica. Primeiramente, foi estudado o efeito agudo deuma única dose de DOX e, posteriormente, avaliamos o efeito evolutivo de múltiplasdoses.Materiais e métodos: Utilizamos ratos Wistar machos (n=66) que foramrandomizados em 2 protocolos experimentais: 1) ratos foram sacrificados antes (-24h, n=8) e após (+24h, n=8) dose única de DOX (4mg/kg) a fim de determinar oefeito agudo da DOX; 2) ratos (n=58) receberam 4 injeções semanais de DOX(4mg/kg/semana) e foram sacrificados antes da primeira injeção (M0) e 1 semanadepois de cada administração (M1, M2, M3, M4) para determinar o efeito evolutivode cada uma das quatro doses da DOX. As avaliações realizadas foram: clínica,necropsia, estudo miocárdico morfológico (microscopia óptica), capacidadeantioxidante total (TAP, capacidade antioxidante) e lesão oxidativa do DNA (ensaiocometa).Resultados: No modelo agudo, não houve alteração no peso e nem nascaracterísticas clínicas ou de necropsia. Contudo, foi verificado aumento danecrose, desarranjo miofibrilar, diminuição da TAP e aumento da lesão oxidativado DNA após 24h da dose única de DOX (p<0,05). O estudo evolu... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Doutor

Embora há muito tempo se considere que alterações neurobiológicas tenham um papel central no transtorno bipolar (TB), os mecanismos moleculares ligados à sua fisiopatologia permanecem desconhecidos. A hipótese atual sugere que alterações nos circuitos cerebrais associados à regulação do humor e alterações em sistemas de sinalização intracelular associados à plasticidade e sobrevivência neuronal estão envolvidas no TB. Modelos animais são ferramentas úteis que nos permitem testar essas hipóteses e a resposta aos agentes farmacológicos. Um dos mais bem estabelecidos modelos animais de mania é o de hiperatividade induzida por psicoestimulantes. Portanto, o nosso objetivo inicial foi testar no modelo animal de mania, induzido por anfetamina, o envolvimento do dano ao DNA e do estresse oxidativo, bem como verficar o efeito do lítio e do valproato sobre esse modelo. Ainda no modelo animal, testamos se o dano ao DNA estaria envolvido também com o tratamento crônico e agudo de ratos jovens e adultos com metilfenidato. Nos pacientes com TB também avaliamos o dano ao DNA e proteínas, bem como a atividade do sistema antioxidante glutationa. No modelo animal de mania, observamos que a anfetamina é capaz de aumentar a atividade das enzimas antioxidantes, peroxidação lipídica e dano ao DNA. O lítio forneceu proteção ao dano recente ao DNA induzido pela anfetamina e o valproato apenas foi capaz de modular a atividade das enzimas antioxidantes superoxido dismutase (SOD) e catalase. No tratamento com metilfenitado, tanto os ratos jovens como os adultos também apresentaram dano recente ao DNA. Nos resultados em pacientes com TB podemos verificar que o dano permanente ao DNA não está aumentado, porém os pacientes com TB apresentam um aumento da frequência de apoptose. Verificamos ainda que o dano oxidativo a proteínas ocorre por nitração da tirosina, avaliado pelo imunoconteúdo de 3-nitrotirosina, e que este pode ativar a enzima glutationa-S-transferase, aumentada nos pacientes bipolares com maior tempo de doença, indicando um mecanismo compensatório envolvido. Esses resultados apontam para um envolvimento do dano ao DNA na fisiopatologia do TB e que esse pode ser modulado por rotas ativadas pelo estresse oxidativo. / Although neurobiological changes have long been considered to have a central role in bipolar disorder (BD), the molecular mechanisms related to the pathophysiology of this condition remain unknown. The current hypothesis suggests that alterations in neurochemistry could be associated with mood regulation and intracellular signaling systems linked to neuronal plasticity and survival are involved in BD. Animal models are useful tools that allow testing hypotheses and response to pharmacological agents. One of the most well established models of mania is psychostimulant-induced hyperactivity. Therefore, our initial objective was assessing DNA damage and oxidative stress in an animal model of amphetamine-induced mania, in addition to verifying the effect of lithium and valproate in this same model. Still in this paradigm we tested if DNA damage is also associated with acute and chronic methylphenidate exposure in young and adult rats. In patients with BD we also assessed DNA and protein damage, as well as activity of the glutathione antioxidant system. In the animal model of mania we observed that amphetamine can increase the activity of antioxidant enzymes, lipid peroxidation and DNA damage. Lithium provided protection against recent amphetamine-induced DNA damage and valproate was only able to modulate the activity of SOD antioxidant enzymes and catalase. Both young and adult rats displayed DNA damage after amphetamine exposure. In patients with BD, we observed that permanent DNA damage is not increased, but they present a higher frequency of apoptosis. It was also verified that oxidative damage to proteins ensues via thyrosine nitration, assessed by 3- nitrotyrosine immunocontent. Possibly this damage activates the GST enzyme, which levels are raised in patients with bipolar disorder with a longer disease evolution, indicating that a compensatory mechanism is implicated. This results point to the importance of DNA damage in the pathophysiology of bipolar disorder, which is possibly mediated by routes activated by oxidative stress.

Submitted by Manuella Pacífico de Freitas Segredo null (manusegredo@hotmail.com) on 2017-02-10T18:26:59Z No. of bitstreams: 1 Tese Doutoramento 16 dez 2016 - Manuella Segredo.pdf: 6088893 bytes, checksum: 8413963c281c359e0c9044c8b9243f10 (MD5) / Approved for entry into archive by Juliano Benedito Ferreira (julianoferreira@reitoria.unesp.br) on 2017-02-15T16:30:38Z (GMT) No. of bitstreams: 1 segredo_mpf_dr_bot.pdf: 6088893 bytes, checksum: 8413963c281c359e0c9044c8b9243f10 (MD5) / Made available in DSpace on 2017-02-15T16:30:38Z (GMT). No. of bitstreams: 1 segredo_mpf_dr_bot.pdf: 6088893 bytes, checksum: 8413963c281c359e0c9044c8b9243f10 (MD5) Previous issue date: 2017-01-23 / Introdução: É desconhecido o papel do estresse oxidativo durante a evolução da cardiotoxicidade crônica induzida por múltiplas doses de doxorrubicina (DOX). Objetivo: Avaliar a evolução da cardiotoxicidade induzida por doxorrubicina por meio da avaliação clínica, necropsia; análise morfológica, capacidade antioxidante total e lesão do DNA miocárdica. Primeiramente, foi estudado o efeito agudo de uma única dose de DOX e, posteriormente, avaliamos o efeito evolutivo de múltiplas doses. Materiais e métodos: Utilizamos ratos Wistar machos (n=66) que foram randomizados em 2 protocolos experimentais: 1) ratos foram sacrificados antes (- 24h, n=8) e após (+24h, n=8) dose única de DOX (4mg/kg) a fim de determinar o efeito agudo da DOX; 2) ratos (n=58) receberam 4 injeções semanais de DOX (4mg/kg/semana) e foram sacrificados antes da primeira injeção (M0) e 1 semana depois de cada administração (M1, M2, M3, M4) para determinar o efeito evolutivo de cada uma das quatro doses da DOX. As avaliações realizadas foram: clínica, necropsia, estudo miocárdico morfológico (microscopia óptica), capacidade antioxidante total (TAP, capacidade antioxidante) e lesão oxidativa do DNA (ensaio cometa). Resultados: No modelo agudo, não houve alteração no peso e nem nas características clínicas ou de necropsia. Contudo, foi verificado aumento da necrose, desarranjo miofibrilar, diminuição da TAP e aumento da lesão oxidativa do DNA após 24h da dose única de DOX (p<0,05). O estudo evolutivo mostrou prejuízo progressivo nos sinais clínicos, no peso corpóreo (R=-0,99; P=0,011) e nas alterações morfológicas miocárdicas (necrose: (R=1,00; P=0,004) de acordo com as doses de DOX. Contudo, foi observada melhora miocárdica progressiva tanto da TAP (R=0,95; P=0,049) como da lesão de DNA (SBs: R=-0,95; P=0,049). Além disso, a piora progressiva da necrose foi associada com a melhora progressiva tanto da lesão do DNA (SBs) (R=-0,97; P 0,027) como com a TAP (R=0,96; P=0,039). A Resumo 3 melhora progressiva da lesão do DNA (SBs) e da TAP também foram associadas (R=-0,98; P=0,018). A progressão da necrose foi associada à perda de peso corpóreo (R=- 0,98; P=0,024). A necropsia mostrou alterações (amolecimento cardíaco, ascite, derrame pleural, aderência entre órgãos e hidronefrose) a partir de M3. Conclusão: Dose única de DOX levou à desorganização, necrose, lesão no DNA e diminuição da TAP miocárdicos. O estudo evolutivo de múltiplas doses de DOX mostrou deterioração progressiva dos sinais clínicos, peso corpóreo e necrose de acordo com o aumento do número de doses de DOX. Contudo tal deterioração foi associada com a melhora da TAP e lesão oxidativa do DNA miocárdica. Nossos resultados sugerem que o dano oxidativo está associado apenas com a cardiotoxicidade induzida por uma única dose de DOX. É plausível que multiplas doses de DOX estejam associadas a aumento progressivo da resistência ao estresse oxidativo. / The mechanism of doxorubicin-induced cardiotoxicity remains controversial. Wistar rats (n=66) received doxorubicin (DOX) injections intraperitoneally and were randomly assigned to two experimental protocols: 1) rats (n=16 ) were killed before and 24 h after a single dose of DOX (4 mg/Kg-body-wt) to determine the DOX acute effect; 2) rats (n=60) received 4 injections of DOX (4 mg/Kg-bodywt/ week) and were killed before the first injection (M0) and 1 week after each injection (M1, M2, M3, M4) to determine the chronological effect. Cardiac total antioxidant performance (TAP), DNA damage and morphology analyses were done at each time point. Body weight, clinical signs and necropsia changes were also registered. DOX single dose was associated with increased cardiac disarrangement, necrosis and DNA damage [strand breaks (SBs) and oxidized pyrimidines], and decreased TAP. Single dose of DOX was not associated with changes in body weight, clinical signs and necropsy.The chronological study showed an effect of a cumulative dose on body weight (R - 0.99, P 0.011), necrosis (R 1.00, P 0.004), TAP (R 0.95, P 0.049), and DNA SBs (R - 0.95, P 0.049). DNA SBs damage was negatively associated with TAP (R - 0.98, P 0.018) and necrosis (R - 0.97, P 0.027). The necropsy showed abnormalities (heart softening, ascites, pleural effusion, adhesion between organs and hydronephrosis) from M3. Our results suggest that oxidative damage is associated with acute cardiotoxicity induced by a single DOX only. Increased resistance to the oxidative stress is plausible for the multiple dose of DOX.

Nek1 é uma serina/treonina quinase humana envolvida na ciliogênese, na resposta a danos ao DNA e na regulação do ciclo celular. Devido ao possível envolvimento dessa proteína em patologias como a Doença Policística do Rim (PKD), a Síndrome de Costelas Curtas e Polidáctilia tipo Majewski e no desenvolvimento de tumores, muitos estudos tem sido feitos buscando entender a via de atuação dessa quinase nas células. Em vista disso, o objetivo desse trabalho foi avaliar o papel da Nek1 em resposta a danos ao DNA, principalmente gerados por agentes indutores de Crosslinks (ICLs), como cisplatina, buscando localizar a Nek1 nas vias de sinalização conhecidas e identificar proteínas que interagem com essa quinase. Para isto, foi utilizado um modelo de silenciamento estável de Nek1 por shRNAi na linhagem celular humana Hek293t. Essas células, quando comparadas à linhagem selvagem expressando a proteína, apresentaram um reparo deficiente de lesões induzidas por cisplatina e ausência de quebras de dupla fita através do ensaio cometa, confirmado pelos baixos níveis de fosforilação da histona H2AX. Entretanto, análises com outro agente indutor de ICLs, Nimustina (ACNU), demonstrou que a Nek1 parece atuar nos mecanismos envolvidos no reparo de lesões induzidas por cisplatina. Isso sugere que essa proteína possa estar agindo no reconhecimento da lesão do DNA e até mesmo regulando vias checagem de ciclo celular, uma vez que a linhagem silenciada apresentou modificações no ciclo celular e na sinalização de Chk1 e Chk2, após a exposição com cisplatina. Além disso, essas células também apresentaram alterações na sinalização das proteínas envolvidas no reparo de ICLs, BRCA1 e FANCD2. O estudo de interação proteica por espectrometria de massas destacou algumas proteínas de reparo, como proteínas da via de Fanconi, e principalmente moléculas relacionadas com o processo de ubiquitinação, sugerindo que este pode ser o mecanismo pelo qual essa molécula está atuando e integrando diferentes sistemas. Esse conjunto de dados indica o papel da Nek1 como uma proteína sensora de danos que atua no início das vias de reparo, regulando diferentes moléculas e interagindo em distintos processos celulares como controle do ciclo celular, reparo e morte. / Nek1 is a human serine/threonine protein kinase involved in ciliogenesis, DNA damage response and cell cycle regulation. Because of its possible involvement in human diseases such as Polycystic Kidney Disease (PKD), Short-Rib Polydactyly Syndrome Type Majewski and development of tumors, many studies have been done to understand how this kinase acts in cells. Therefore, the objective of this study was to evaluate a role for Nek1 in response to DNA damage, mainly generated by agents that induce crosslinks (ICLs), such as cisplatin, identifying pathways in which participate and how proteins interact with this kinase. To accomplish that, a stable silencing of Nek1 by shRNAi in human cell line Hek293t was employed. These cells, when compared to the wild type, showed a deficient repair of lesions induced by cisplatin and absence of double strand breaks, when analysed by comet assay and, confirmed by low levels of histone H2AX phosphorylation. However, analysis with another inducing ICLs agent, Nimustine (ACNU) demonstrated that Nek1 seems to act on mechanisms involved in repair of lesions induced by cisplatin. It suggesting that this protein might be acting on the recognition of DNA damage and even regulating checkpoint pathways, since the silenced strain showed changes in cell cycle and in signaling of Chk1 and Chk2 after exposure to cisplatin. Moreover, these cells also showed changes in signaling of proteins involved in the repair of ICLs FANCD2 and BRCA1. The study of protein interaction by mass spectrometry highlighted some repair proteins, like Fanconi pathway proteins, and protein involved in the ubiquitin-related process, suggesting a possible mechanism of action and integration with different systems. This dataset indicates the role of Nek1 as a DNA damage sensor protein that acts at the beginning of the repair pathways regulating and interacting with distinct molecules in different cellular processes such as cell cycle control, repair and death.

FARIAS, I. R. Analise da expressão dos genes de reparo da lesão de fita dupla do DNA de trabalhadores rurais expostos a agrotóxicos. 2017. 101 f. Dissertação (Mestrado em Ciências Médicas) - Faculdade de Medicina, Universidade Federal do Ceará, Fortaleza, 2017. / Submitted by Ivone Sousa (ppgcm.ufc@gmail.com) on 2017-09-11T14:16:57Z No. of bitstreams: 1 2017_dis_irfarias.pdf: 2060772 bytes, checksum: d6a3cd5cc4fbd9571605d6446c4af485 (MD5) / Approved for entry into archive by Erika Fernandes (erikaleitefernandes@gmail.com) on 2017-09-11T16:01:22Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2017_dis_irfarias.pdf: 2060772 bytes, checksum: d6a3cd5cc4fbd9571605d6446c4af485 (MD5) / Made available in DSpace on 2017-09-11T16:01:22Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2017_dis_irfarias.pdf: 2060772 bytes, checksum: d6a3cd5cc4fbd9571605d6446c4af485 (MD5) Previous issue date: 2017-02-17 / The need to increase the demand for food produced brought with it an incorporation of technical-scientific development in agriculture and became a justification for the use of some chemicals in order to obtain a higher production through the manipulation of organic factors. The damage caused by high levels of toxicity of pesticides in a greater number of cases of cancers in farmers, making studies of the mechanisms of action involved and the damages that can cause human health of extreme relevance. In order to maintain a genomic integrity and its human stability around 150 genes involved in our DNA repair mechanisms. These errors when a DNA tape (DSBs) can be corrected by two types of mechanism, a Homologous Recombination (HR) and a Joint of Non-Homologous Extremities (NHEJ). Problems in DNA tape repair mechanisms in response to various types of damage caused by exposure to agrochemicals by farmers may trigger the accumulation of genetic genes and / or a deregulation of cell growth, leading to genomic instability and neoplastic development. The aim of the present study was to analyze genetic genetics by genetic cytogenetics by gene expression using the real-time PCR technique using ATM, BRCA1, BRCA2, XRCC5, XRCC6, RAD51 and LIG4 genes, belonging to the double-stranded DNA repair mechanism. This analysis was based on 90 cases of rural workers exposed to pesticides in the region of the Chapada do Apodi, in Limoeiro do Norte, and 10 samples from healthy individuals as control. With this study, it was possible to identify the ATM, LIG4 and XRCC5 genes presented the level of expression significant for a time variable of exposure to agrochemicals and for a variable groups of farmers, the genes LIG4, XRCC5 and XRCC6 presented the level of expression Para as variables Smoke and alcohol levels; expression levels of the XRCC5 and XRCC6 genes were still significant for a variable use of EPIs; the BRCA2 gene presented significance of expression for a variable karyotype; finally, gene XRCC6 a variable type of contact with pesticide. These results support the importance of ATM, BRCA1, BRCA2, XRCC5, XRCC6 and LIG4 genes in the maintenance of genomic stability, promoting a better understanding of the cellular mechanisms influenced by exposure to pesticides. / A necessidade do aumento na demanda de alimentos produzidos trouxe consigo a incorporação do desenvolvimento técnico-científico à agricultura e passou a ser justificativa para a utilização de alguns produtos químicos com o objetivo de obter uma maior produção por meio da manipulação de fatores orgânicos. Os danos que são acarretados devido aos níveis elevados de toxicidade dos agrotóxicos vem sendo uma das maiores causas de cânceres em agricultores, tornando-se de extrema relevância os estudos nos mecanismos de ação envolvidos e os danos que podem vir a causar à saúde humana. Afim de manter a integridade genômica e sua estabilidade os seres humanos possuem em torno de 150 genes envolvidos diretamente nos mecanismos de reparo de DNA. Estes danos quando acometem a dupla fita de DNA (DSBs) podem ser corrigidos por dois tipos de mecanismo, a Recombinação Homóloga (HR) e a Junção de Extremidades Não Homólogas (NHEJ). Problemas nos mecanismos de reparo de dupla fita de DNA como resposta a diversos tipos de danos acarretados pela exposição a agrotóxicos por agricultores pode desencadear o acúmulo de alterações genéticas e/ou a desregulação do crescimento celular, levando à instabilidade genômica e desenvolvimento neoplásico. Portanto, o presente estudo tem por objetivo analisar as alterações genéticas, por citogenética clássica por bandeamento G, e a expressão genica, por meio da técnica de PCR em tempo real, dos genes ATM, BRCA1, BRCA2, XRCC5, XRCC6, RAD51 e LIG4, pertencentes ao mecanismo de reparo de fita dupla do DNA. Essa análise baseou-se em 90 casos de trabalhadores rurais expostos a agrotóxicos da região da Chapada do Apodi, em Limoeiro do Norte, e 10 amostras de indivíduos saudáveis como controle. Com esse estudo, foi possível identificar que: os genes ATM, LIG4 e XRCC5 apresentaram o nível de expressão significativo para a variável tempo de exposição aos agrotóxicos e para a variável grupos de agricultores, os genes LIG4, XRCC5 e XRCC6 apresentaram o nível de expressão significativa para as variáveis fumo e álcool; os níveis de expressão dos genes XRCC5 e XRCC6 foram ainda significativos para a variável uso de EPIs; o gene BRCA2 apresentou significância de expressão para a variável cariótipo, por fim, o gene XRCC6 apresentou nível de expressão significativo para a variável tipo de contato com agrotóxico. Estes resultados suportam a importância dos genes ATM, BRCA1, BRCA2, XRCC5, XRCC6 e LIG4 na manutenção da estabilidade genômica promovendo um melhor entendimento dos mecanismos celulares influenciados pela exposição a agrotóxicos.