Zur Klärung der Frage, welche Rolle die Annexinen-homologen alpha-Giardine 14 und 19 tatsächlich im Lebenszyklus des humanpathogenen Darmparasits Giardia lamblia einnehmen, wurden verschiedene molekularbiologische und biochemische Untersuchungen durchgeführt. Die Untersuchungen im Falle des alpha14-Giardins ergaben, dass das Protein nur in gewissen Regionen der membranumgebenen Bereiche der Flagellen als Perlenschnur-ähnliche Verdickungen vorlag. Zusätzlich konnte sowohl eine Assoziation mit den Mikrotubuli des Axonems als auch mit der Plasmamembran nachgewiesen werden. Bei der Fahndung nach direkten Interaktionspartnern des alpha14 belegten verschiedene Methoden eine Wechselwirkung zwischen der Ankyrin-Domäne einer Ser/Thr-Kinase und dem alpha14. Auch konnte eine Phosphorylierung des Giardins eindeutig bestätigt werden. Weitere Eigenschaften des alpha14 waren die Fähigkeit der Oligomerisierung als auch die Bindung an Glykosaminoglykane. Infolgedessen könnte das alpha14-Giardin eine durch Phosphorylierung regulierte MAP-Funktion übernehmen und somit eine wichtige Rolle für die Dynamik oder Mobilität der Flagellen spielen. Das Hauptziel der im Falle des alpha19-Giardin durchgeführten Untersuchungen war die erste biochemische Charakterisierung des Proteins. Nach Bestätigung der Expression des alpha19-Giardins konnte mit Hilfe eines spezifischen Antikörpers das Protein ausschließlich in den ventralen Flagellen von G. lamblia nachgewiesen werden. Im Weiteren wurde für das alpha19 der typischen Annexin-Charakter sowie eine Phosphorylierung bestätigt. Das Vorkommen des alpha19-Giardins in der Membranfraktion des G. lamblia-Rohextraktes sowie die Solubilisierung des Proteins durch Zugabe eines Detergenz gaben erste Hinweise auf eine Fettsäuremodifikation des N-Terminus des Proteins, in dem ein Sequenzmotiv für eine Myristoylierung vorliegt. Folglich könnte das Protein an membrandynamischen Prozessen innerhalb der ventralen Flagellen beteiligt sein.

Der Intestinalparasit Entamoeba histolytica exprimiert während seines gesamten Lebenszyklus zwei Cysteinpeptidase-Inhibitoren der Chagasin-Familie (EhICP1 und EhICP2). Beide EhICPs inhibieren die peptidolytische Aktivität von E. histolytica-Zellextrakten und der humanen Peptidasen Cathepsin B und L unterschiedlich effektiv. Innerhalb der Trophozoiten von E. histolytica sind die EhICPs in verschiedenen Kompartimenten lokalisiert, EhICP1 im Cytosol und EhICP2 in Vesikeln, wo es mit verschiedenen lysosomalen Hydrolasen und mit phagocytierten Partikeln kolokalisiert. Im Vergleich zu den amöbialen Peptidasen liegen die EhICPs im molaren Unterschuss innerhalb der Zellen vor. Außerdem ist die Produktion und Lokalisationen der Peptidasen sowie der verschiedenen physiologische Prozesse, an denen die EhCPs beteiligt sind, unabhängig von der Expression der ehicp-Gene. Die erhaltenen Ergebnisse lassen darauf schließen, dass EhICP1 die Zelle vor versehentlich aus undicht gewordenen Lysosomen freigesetzten Peptidasen schützt, während EhICP2 an housekeeping-Prozessen, wie der Kontrolle der Prozessierung von Peptidasen, beteiligt sein könnte. Neben der Charakterisierung der Cysteinpeptidase-Inhibitoren aus E. histolytica bildeten Untersuchungen an einem Annexin-homologen Protein aus Giardia lamblia, einem anderen Intestinalparasiten, einen weiteren Schwerpunkt der hier vorgestellten Arbeit. Das Annexin-homologe alpha-19-Giardin nimmt unter allen Annexinen eine Sonderstellung dahingehend ein, als dass es als bisher einzig bekanntes Annexin ein N-terminales Signal für eine Doppelacylierung besitzt. Mit Hilfe von verschiedenen Expressionssystemen konnte hier experimentell belegt werden, dass alpha-19-Giardin tatsächlich als Substrat für eine Myristoyl- sowie für eine Palmitoyltransferase fungiert, und diese Modifikation die Membranassoziation des Proteins bewirkt.

Giardia duodenalis é um protozoário entérico de distribuição mundial responsável por causar a giardíase em uma grande variedade de mamíferos, incluindo os humanos. É considerada uma espécie complexa, no qual os isolados podem ser classificados em sete agrupamentos genéticos distintos apesar de serem morfologicamente indistinguíveis. O presente trabalho teve como objetivo avaliar a variabilidade genotípica de isolados de G. duodenalis provenientes de humanos naturalmente infectados, residentes em cidades do litoral de São Paulo, na Baixada Santista. A caracterização molecular de 43 isolados pelo seqüenciamento parcial de genes codificadores da enzima glutamato-desidrogenase (gdh) e da proteína beta-giardina (bg) mostrou que o assemblage B da G. duodenalis é o mais freqüente na região litorânea, ocorrendo em 53,5% (n=23) das amostras, sendo o assemblage A identificado em 34,8% (n=15). A maioria das seqüências obtidas pelo gene gdh se mostrou polimórfica, caracterizada por picos duplos de nucleotídeos em algumas posições em cromatograma e quando a análise dos dois genes foi combinada cinco isolados apresentaram identidades diferentes. A esses fenômenos duas explicações são atribuídas, infecção mista ou heterozigose de seqüência alélica. As análises filogenéticas mostraram que o gene bg é mais conservado que o gene gdh, não sendo capaz de discriminar os sub-agrupamentos que constituem os Assemblages do parasita. Com base nos resultados apresentados podemos concluir que a participação de genótipos zoonóticos é relevante na epidemiologia das giardíases nos indivíduos residentes das cidades litorâneas do estado de São Paulo e que estudos de caracterização molecular da G. duodenalis são indispensáveis para melhor conhecimento da epidemiologia desta infecção. / Giardia duodenalis is an enteric protozoa of global distribution responsible for causing giardiasis in a wide range of mammals including humans. Is considered complex specie in which the isolates can be classified in different genetic groups despite to be morphologically indistinguishable. The purpose of this study was evaluating the genetic variability of G. duodenalis isolates from humans naturally infected residents in the coast cities of Sao Paulo, in Baixada Santista. The molecular characterization of 43 isolates using the gene encoding glutamate-desidrogenasi enzyme (gdh) and beta-giardin protein (bg) showed that the assemblage B is the most common in the coast region, occurring in 53.5% (n=23) samples, the assemblage A was identified in 34.8% (n=15). Most sequences obtained by the gdh gene showed polymorphism, characterized for double peaks of nucleotides in some chromatogram positions and when the analysis of two genes was combined five isolates were differently identified. For this phenomena can be attributed two explanations, mixed infections or heterozygosis allelic sequence. The phylogenetic analysis showed that bg gene is more conserved than gdh gene, not being able to discriminate the sub-groups of parasite assemblages. Based on the presented results we can conclude the participation of zoonotic genotypes is important in the epidemiology of giardiasis in residents of the coast cities of Sao Paulo state and molecular characterization studies of G. duodenalis are essential for better understanding the epidemiology of this infection.

Giardia duodenalis é um protozoário entérico de distribuição mundial responsável por causar a giardíase em uma grande variedade de mamíferos, incluindo os humanos. É considerada uma espécie complexa, no qual os isolados podem ser classificados em sete agrupamentos genéticos distintos apesar de serem morfologicamente indistinguíveis. O presente trabalho teve como objetivo avaliar a variabilidade genotípica de isolados de G. duodenalis provenientes de humanos naturalmente infectados, residentes em cidades do litoral de São Paulo, na Baixada Santista. A caracterização molecular de 43 isolados pelo seqüenciamento parcial de genes codificadores da enzima glutamato-desidrogenase (gdh) e da proteína beta-giardina (bg) mostrou que o assemblage B da G. duodenalis é o mais freqüente na região litorânea, ocorrendo em 53,5% (n=23) das amostras, sendo o assemblage A identificado em 34,8% (n=15). A maioria das seqüências obtidas pelo gene gdh se mostrou polimórfica, caracterizada por picos duplos de nucleotídeos em algumas posições em cromatograma e quando a análise dos dois genes foi combinada cinco isolados apresentaram identidades diferentes. A esses fenômenos duas explicações são atribuídas, infecção mista ou heterozigose de seqüência alélica. As análises filogenéticas mostraram que o gene bg é mais conservado que o gene gdh, não sendo capaz de discriminar os sub-agrupamentos que constituem os Assemblages do parasita. Com base nos resultados apresentados podemos concluir que a participação de genótipos zoonóticos é relevante na epidemiologia das giardíases nos indivíduos residentes das cidades litorâneas do estado de São Paulo e que estudos de caracterização molecular da G. duodenalis são indispensáveis para melhor conhecimento da epidemiologia desta infecção. / Giardia duodenalis is an enteric protozoa of global distribution responsible for causing giardiasis in a wide range of mammals including humans. Is considered complex specie in which the isolates can be classified in different genetic groups despite to be morphologically indistinguishable. The purpose of this study was evaluating the genetic variability of G. duodenalis isolates from humans naturally infected residents in the coast cities of Sao Paulo, in Baixada Santista. The molecular characterization of 43 isolates using the gene encoding glutamate-desidrogenasi enzyme (gdh) and beta-giardin protein (bg) showed that the assemblage B is the most common in the coast region, occurring in 53.5% (n=23) samples, the assemblage A was identified in 34.8% (n=15). Most sequences obtained by the gdh gene showed polymorphism, characterized for double peaks of nucleotides in some chromatogram positions and when the analysis of two genes was combined five isolates were differently identified. For this phenomena can be attributed two explanations, mixed infections or heterozygosis allelic sequence. The phylogenetic analysis showed that bg gene is more conserved than gdh gene, not being able to discriminate the sub-groups of parasite assemblages. Based on the presented results we can conclude the participation of zoonotic genotypes is important in the epidemiology of giardiasis in residents of the coast cities of Sao Paulo state and molecular characterization studies of G. duodenalis are essential for better understanding the epidemiology of this infection.

Made available in DSpace on 2016-01-26T12:51:36Z (GMT). No. of bitstreams: 1 juarezeliassantosjunior_dissert.pdf: 1690383 bytes, checksum: 9dd87174c2d25f09841337ec79d6968f (MD5) Previous issue date: 2010-11-25 / Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico / The parasite Giardia duodenalis, responsible for giardiasis, is commonly found in intestines of mammals, including man, currently considered to be important public health. Molecular research showed that G. duodenalis presents seven genotypes: A, B, C, D, E, F and G. Only genotypes A, which owns the subgenotypes A1 and A2 and B were detected in humans but also in other mammalian hosts. Objective: Evaluate the genotypic frequency of this parasite in humans in the Northwest region and to correlate the presence of diarrhea and their genotypes. Material and Method: Fecal samples were collected in the city of São José do Rio Preto (n = 150) and Araçatuba (n = 154), Northwest of São Paulo, Brazil. The parasitologic diagnosis was done by light microscopy and genotyping of β-Giardin gene by PCR-RFLP. Results: The subgenotype A1 was the most prevalent, however, the subgenotype A2 more frequent in Araçatuba. Genotype B was not found. No significant result was observed between significant stool consistency and subgenotype detected. Conclusion: The distribution of these genotypes may be related to host-parasite interactions in several areas and may influence the clinical and epidemiologic each region. Keywords: 1. Molecular epidemiology; 2. Gene β-giardin; 3. Giardiasis; 4. Northwest of São Paulo. / O parasito Giardia duodenalis, responsável pela giardíase, é comumente encontrado no intestino de mamíferos, inclusive o homem, sendo de importância em saúde pública. Pesquisas moleculares evidenciaram que Giardia duodenalis apresenta sete genótipos: A, B, C, D, E, F e G. Apenas o genótipo A, que possui os subgenótipos A1 e A2, e B foram detectados em humanos, mas também em outros hospedeiros mamíferos. Objetivo: Avaliar a freqüência genotípica deste parasito em humanos no Noroeste Paulista e correlacionar a presença deste enteropatógeno e seus genótipos à diarréia. Material e Método: Amostras fecais foram coletadas nos municípios de São José do Rio Preto (n=150 ) e Araçatuba (n=154), Noroeste do Estado de São Paulo, Brasil. O diagnóstico parasitológico foi feito por meio de microscopia ótica e a genotipagem do gene β-giardina pela técnica de PCR-RFLP. Resultados: O subgenótipo A1 foi o mais prevalente, no entanto, o subgenótipo A2 mais freqüente em Araçatuba. O genótipo B não foi encontrado e nenhum resultado significativo foi observado entre a consistência das fezes e o subgenótipo detectado. Conclusão: A distribuição destes genótipos pode ser relacionada as interações parasito-hospedeiro em diversas áreas, podendo influenciar as características clínico-epidemiológicas de cada região.