Submitted by Amanda Silva (amanda.osilva2@ufpe.br) on 2015-03-04T13:16:48Z No. of bitstreams: 2 Dissertação Carlos Eduardo de Oliveira Lacerda .pdf: 1440207 bytes, checksum: 45ba5069ce1d39e72db4b57677b1c684 (MD5) license_rdf: 1232 bytes, checksum: 66e71c371cc565284e70f40736c94386 (MD5) / Made available in DSpace on 2015-03-04T13:16:48Z (GMT). No. of bitstreams: 2 Dissertação Carlos Eduardo de Oliveira Lacerda .pdf: 1440207 bytes, checksum: 45ba5069ce1d39e72db4b57677b1c684 (MD5) license_rdf: 1232 bytes, checksum: 66e71c371cc565284e70f40736c94386 (MD5) Previous issue date: 2013 / REUNI; CAPES / A glicerina bruta, subproduto da produção de biodiesel, vem sendo investigada como fonte de carbono em processos microbianos para a obtenção de bioprodutos de alto valor agregado. A utilização da glicerina na produção de 1,3-propanodiol por via microbiológica é uma forma bastante viável de utilização dessa substância. O processo microbiano ocorre em anaerobiose, onde bactérias (Klebsiella, Citrobacter, Enterobacter e Clostridium) convertem a glicerina bruta em 1,3-propanodiol e vários outros produtos, como: ácido acético, etanol, ácido succínico, ácido lático, ácido cítrico, ácido fórmico, CO2 e H2, de acordo com as vias metabólicas do seu processo fermentativo. Dentre os micro-organismos estudados, no entanto, destacam-se as bactérias Clostridium butyricum e Klebsiella pneumoniae como as de maior utilização e provavelmente as melhores produtoras deste composto, devido a sua tolerância ao substrato, seu rendimento e produtividade. O presente trabalho consistiu em avaliar o comportamento do Clostridium acetobutylicum ATCC 4259 através de fermentações em batelada utilizando glicerol PA como fonte de carbono. A fermentação foi realizada em meio de cultura próprio para obtenção de 1,3-propanodiol, importante monômero utilizado na síntese de polímeros. Foi realizado um planejamento fatorial 2² em estrela com ponto central para avaliar a influência de duas variáveis (glicerol PA e extrato de levedura) no crescimento do micro-organismo. Foram realizados 10 ensaios no planejamento, sendo 9 ensaios em pontos distintos e uma repetição no ponto central. Também foi realizado um experimento de cinética microbiana para estudar em detalhes o crescimento do micro-organismo. Em ambos os casos a técnica de filtração com peso seco foi utilizada para calcular a concentração celular presente no meio. A cinética microbiana mostrou que, para as condições experimentais da pesquisa, a fase exponencial de crescimento ocorreu até o tempo de 14 horas, e uma produtividade celular (P) de 0,0405 g/L.h, uma velocidade máxima de crescimento (μmáx) de 0,0403 h-1 e um tempo de geração (G) de 15,7 h foram alcançados. As melhores respostas obtidas no planejamento fatorial foram 1,42 g/L e 1,40 g/L (30 g/L e glicerol e 2 g/L de extrato de levedura no meio de cultura).

Submitted by Amanda Silva (amanda.osilva2@ufpe.br) on 2015-03-04T14:05:27Z No. of bitstreams: 2 TESE Flávia Gonçalves Domingues.pdf: 1926448 bytes, checksum: 2b318582500f7f05a9fc66b2fff717c8 (MD5) license_rdf: 1232 bytes, checksum: 66e71c371cc565284e70f40736c94386 (MD5) / Made available in DSpace on 2015-03-04T14:05:27Z (GMT). No. of bitstreams: 2 TESE Flávia Gonçalves Domingues.pdf: 1926448 bytes, checksum: 2b318582500f7f05a9fc66b2fff717c8 (MD5) license_rdf: 1232 bytes, checksum: 66e71c371cc565284e70f40736c94386 (MD5) Previous issue date: 2013 / FACEPE; CNPq; BNB / A indústria biotecnológica futura deverá ser responsável pela produção de muitos dos bens de consumo que hoje são derivados do petróleo, como plásticos e combustíveis. Atualmente, obtido por síntese química a partir de derivados do petróleo, o 1,3- propanodiol (1,3-PDO) é uma substância que tem despertado crescente interesse das indústrias químicas. Devido às suas inerentes propriedades, pode ser utilizado como monômero para o desenvolvimento de novos polímeros, como o poli(tereftalato de trimetileno) - PTT. Este um termoplástico com propriedades físico-químicas semelhantes ao poli(etileno tereftalato) (PET) sendo este o fator que mais tem contribuído para o interesse da indústria na obtenção do 1,3-PDO de forma abundante, mais econômica e sustentável. Embora o 1,3-PDO já seja produzido industrialmente por um processo fermentativo, a partir da glicose, a matéria-prima utilizada neste trabalho é diferente e inovadora, o glicerol, que se tem disponível em grande quantidade e baixo custo no país, o que modifica todo entendimento das vias metabólicas, assim como, dos parâmetros envolvidos no processo. Este é gerado em grande quantidade durante a produção de biodiesel e tem se tornado um substrato potencialmente atrativo para a produção bacteriana de produtos de valor agregado, como o 1,3-PDO. Além disso, o micro-organismo a ser utilizado também é importante, pois direcionará os controles mais fundamentais do processo e os subprodutos que são formados. O presente trabalho teve como objetivo a produção de 1,3-propanodiol por via biotecnológica a partir da fermentação do glicerol e a síntese do PTT. A primeira parte do trabalho visou avaliar a produção do 1,3-PDO por quatro cepas: Clostridium acetobutylicum ATCC 824, Clostridium acetobutylicum ATCC 10132, Clostridium acetobutylicum ATCC 4259, Clostridium butyricum DSMZ 10702. Três linhagens mostraram-se capazes de produzir 1,3-PDO. O Clostridium butyricum DSMZ 10702 apresentou maior rendimento no produto de interesse. Para otimização das condições de cultivo, utilizou-se a seleção de variáveis através do delineamento experimental Plackett-Burman (PB) avaliando a produção de 1,3-PDO. As melhores condições de fermentação foram pH (6,5-7,0), temperatura (35,0±0,5oC) e concentração de glicerol (10 g.L-1). A partir da definição das melhores condições de cultivo, os ensaios foram repetidos utilizando glicerol residual. Foi avaliada a cinética de crescimento do Clostridium acetobutylicum ATCC 4259 por ser o micro-organismo que apresentou bons resultados quanto ao aumento de biomassa e produção do 1,3-PDO durante a fermentação. Em outra etapa foi realizada a polimerização do PTT em regime de batelada utilizando-se o 1,3-propanodiol comercial e caracterizado por FTIR e DSC. Na análise de FTIR os comprimentos de onda dos grupos funcionais característicos do poliéster foram identificados, como carbonila, aromático e éster. Já com a análise de DSC o comportamento térmico do PTT foi caracterizado, apresentando temperatura de fusão de 195,25±9,92oC e a parir desse resultado determinou-se sua cristalinidade, em torno de 60%.

Este projeto teve como objetivo a produção de 1,3-propanodiol (1,3-PDO) utilizando glicerol como matéria prima, que pode ser proveniente da indústria de biodiesel. O 1,3-PDO é um produto de interesse na indústria biotecnológica, como precursor para diversos processos. Sua maior aplicação é na produção do bioplástico Politrimetileno Tereftalato (PTT), um termoplástico reciclável não biodegradável com qualidades superiores a do Polietileno Tereftalato (PET). Atualmente, o 1,3-PDO é produzido principalmente por síntese química, utilizando derivados do petróleo, mas a alternativa por microrganismos é vantajosa, pois gera menor emissão de poluentes, usa recursos renováveis e tem menor custo de produção. As bactérias apresentadas nesse trabalho são Escherichia coli recombinantes com genes da bactéria naturalmente produtora de 1,3-PDO Klebsiella pneumoniae. Analisando os dados da literatura, as Análises de Balanço de Fluxo (FBA) e dados experimentais, este projeto teve como objetivo eliminar total ou parcialmente os subprodutos lactato e acetato de E. coli recombinantes e analisar o impacto no metabolismo da bactéria e na produção de 1,3-PDO. Também foi o objetivo analisar o papel do gene yqhD na produção, combinando as mutações que produziam mais com as já obtidas, num esforço de melhorar o processo de produção estabelecido. Foram obtidas 4 linhagens da E. coli modificadas geneticamente, nas quais os seguintes genes foram alvos de estudo: ackA, ldhA, poxB, pta e yqhD. Também foram feitas combinações destas linhagens com uma cepa de E. coli já obtida com mutação na enzima Isocitrato Desidrogenase, na qual a especificidade por coenzimas foi alterada (NADP+ para NAD+), o que gerou mais 6 linhagens para estudo. Todos os genes propostos foram deletados e as linhagens tiveram a produção analisada. Com base em resultados preliminares foram construídas novas linhagens combinando as modificações, e todas tiveram a produção testada. A melhor das linhagens foi uma E. coli icdNAD+ΔyqhD, cultivada em biorreator. Foram observados aumentos no fator de conversão (até 0,489 molPDO/molglicerol) e produtividade (até 0,312gPDO.L-1.h-1). Mutantes derivadas desta, para produzir menos acetato, foram construídas e cultivadas em biorreator. Na tentativa de criar uma linhagem com potencial de ser usada na indústria, um gene essencial foi clonado no plasmídeo de produção, na tentativa de resolver problemas de larga escala. Esse novo plasmídeo, quando usado em uma linhagem específica, elimina a necessidade de usar antibiótico no meio e mantém o elevado número de cópias dos genes de interesse. Novos incrementos poderão ser obtidos explorando diferentes condições de oferta de oxigênio. Os objetivos iniciais foram alcançados: construir linhagens mais produtivas de 1,3-PDO e começar a estudar os efeitos da eliminação de genes responsáveis por alguns subprodutos na produção. Os resultados aqui obtidos ainda puderam indicar a importância de alguns genes, e agora perguntas mais específicas podem ser feitas, bem como hipóteses testadas. / This project aimed at producing 1,3-propanediol (1,3-PD) using glycerol as carbon source, which can be proven from the biodiesel industry. 1,3-PD is a significant product in biotechnology as a precursor to several processes. Its main application is as monomer of the bioplastic Polytrimethylene Terephthalate (PTT), a non-biodegradable recyclable thermoplastic with superior qualities over Polyethylene Terephthalate (PET). 1,3-PD is produced mostly by chemical synthesis from petroleum derivatives. The alternative produced by microorganisms is more advantageous due to the use of renewable raw material and the lower cost of production. The bacteria presented here are recombinant strains of Escherichia coli, harboring genes from the natural producer of 1,3-PD, Klebsiella pneumoniae. Reviewing the literature, simulations of Flux Balance Analysis (FBA) and experimental observations, this project aimed at eliminating partially or completely the lactate and acetate byproducts in strains of E. coli, and at understanding the effects of the mutations in production and growing. We also analyzed the role of the yqhD gene in the production of 1,3-PD, combining the mutations that produced more 1,3-PD with each other, to improve the current production process. Four recombinant strains of E. coli were first obtained in a first experimentation, in which the following genes were analyzed: ackA, ldhA, poxB, pta e yqhD. Combinations of these strains was also made with one previously obtained E. coli with mutation at the Isocitrate dehydrogenase enzyme, with specificity altered by coenzymes (NAD+ instead NADP+), resulting in 6 more strains. All genes of interest were deleted, and the mutants had the production evaluated. Based on preliminary results, new strains were constructed combining the modifications, all tested in shake flasks. The best strain for production was an E. coli icdNAD+ΔyqhD, cultivated in bioreactor. It was observed an increase in the yield (up to 0.489 molPDO/molglycerol) and productivity (up to 0.312 gPDO.L-1.h-1). Mutants lacking genes responsible for acetate formation were obtained from the best strain, in order to reduce acetate at batch. At last, in an attempt to create a strain with potential to be used in industry, an essential gene was cloned in the production plasmid, trying to solve some large-scale problems. This new plasmid used in a specific strain eliminate the use of antibiotics, and still preserve the high copy number of the genes of interest. Further improvements could be achieved by exploring different oxygen supply conditions. The initial objectives were achieved: to construct more productive strains of 1,3-PD and study the effect of the deletion of genes responsible of byproducts. Furthermore, the results obtained in this research could reveal the importance of some genes, and from here, more specific questions and hypothesis can be investigated.

O 1,3-propanodiol (PDO) é um composto químico com muitas aplicações industriais, como síntese de polímeros de tereftalatos, cosméticos e lubrificantes, dentre outros. Este composto pode ser produzido biotecnologicamente a partir do glicerol em condições de anaerobiose. Os principais produtores naturais de PDO são bactérias dos gêneros Klebsiella e Clostridium. No entanto, estes microrganismos podem apresentar riscos à saúde humana, sendo considerados oportunistas e, por isso, requerendo cuidados especiais que dificultam seu emprego em escala industrial. Uma alternativa está no uso de Lactobacillus sp., bactérias que realizam altas conversões de glicerol a PDO e não apresentam estes inconvenientes. Neste estudo, buscou-se melhorar a produtividade da transformação de glicerol em PDO por Lactobacillus reuteri, através de diferentes tipos de bioprocessos. Para isso, o microrganismo foi cultivado em meio MRS (com glicose) contendo glicerol como cosubstrato. Realizaram-se experimentos em batelada, batelada repetida e em processo contínuo (quimiostato) sob diferentes condições. Os melhores resultados foram obtidos nos processos em batelada repetida e em quimiostato. Nos ensaios em batelada repetida, a melhor condição foi nos cultivos em que houve decantação de células. Nesta condição, a produtividade (QPDO) superou em quase 3 vezes o ensaio em batelada comum (4,12 g.L-1.h-1). Em quimiostato, a produtividade alcançada sob a taxa de diluição de 0,5 h-1 foi 20% maior do que o melhor resultado em batelada repetida (4,88 g.L-1.h-1). Estes valores de produtividade são os maiores reportados na literatura até o momento. Além disso, os resultados indicam que o processo em quimiostato não é limitado pelo substrato, mas sim pela concentração de lactato produzido. / 1,3-propanediol (PDO) is a high-value chemical compound which has many industrial applications, such as synthesis of polymers of terephthalates, cosmetics and lubricants, among others. This compound can be produced biotechnologically from glycerol in anaerobiosis. The main natural producers of PDO are bacteria from genera Klebsiella and Clostridium. However, these microorganisms could be dangerous to human health, considered opportunistic and therefore require special care when manipulated on an industrial scale. An alternative is the use of Lactobacillus sp., bacteria which achieve high conversions of glycerol to PDO and do not present these problems. In this study, we aimed to improve the yield of PDO by Lactobacillus reuteri through different types of bioprocesses. For this, the microorganism was grown in MRS medium (with glucose) containing glycerol as co-substrate. Experiments were performed in batch run, repeated batch and continuous mode (chemostat) under different conditions. The best results were found in repeated batch run and chemostat mode. In repeated batch runs, the best condition was found in cultures with settling of cells. In this condition, the productivity (QPDO) reached almost 3 times the value of the simple batch run (4.12 g.L-1.h-1). In chemostat mode, the productivity reached, in the dilution rate of 0.5 h-1, was 20% higher than the best result obtained in repeated batch mode (4.88 g.L-1.h-1). These productivity values are the highest reported in the literature until this date. Furthermore, the results indicate that the chemostat process is not limited by the substrate, but by the concentration of produced lactate.

Dentre as principais preocupações relacionadas à cadeia de produção do biodiesel está o excedente de glicerina bruta. Esta corresponde a cerca de 10% da massa total resultante do processo de produção do biodiesel e vem sendo acumulada e armazenada nas usinas, formando grandes estoques de resíduos e deixando diversas empresas diante de um passivo ambiental agravante. Uma forma de diminuir esse problema é utilizá-la para formulação de meios de fermentação para obtenção de produtos de interesse econômico. Exemplos são as produções de dióis como; 1,3-Propanodiol (1,3-PD) e 2,3-Butanodiol (2,3-BD). Estes são monômeros de grande aplicação no mercado, sendo o 1,3-PD usado para fabricação de poliuretanos, compostos cíclicos e novos tipos de poliésteres. O 2,3-BD é utilizado como anticongelante, biocombustível e como um importante aromatizante. Assim, no presente trabalho propõe-se valorizar a glicerina residual da fabricação de biodiesel, visando sua bioconversão em 2,3-BD e 1,3-PD, pela bactéria Klebsiella pneumoniae NRRL B199. Para tanto, a proposta deste trabalho compreendeu quatro etapas conjuntas: 1. Estabelecer um tratamento adequado para a glicerina residual de forma a permitir o crescimento bacteriano e formação dos dióis. 2. Adequar à composição do meio de fermentação, quanto às concentrações de glicerol, com suplementação de glicose, extrato de levedura e elementos traço Fe2+, Zn2+ e Mn2+ no processo fermentativo. 3. Definir a melhor condição de transferência de oxigênio em sistema descontínuo, associada à concentração de substrato, para a melhor formação de produtos. 4. Avaliar o procedimento de separação dos produtos do meio pela técnica de salting-out. Os estudos da etapa 1 e 2 foram realizados em frascos Erlenmeyer de 250 mL com 50 mL de meio. Na etapa 3, o estudo de aeração e agitação foi realizado em fermentador Bioflo III (New Brunswick Sci. Co.) de 1,25 L. Com os resultados obtidos, concluiu-se que o tratamento realizado foi adequado para o emprego da glicerina residual como fonte de carbono para o crescimento da bactéria Klebsiella pneumoniae. Além disso, os trabalhos realizados em frascos revelaram uma produção máxima, em agitação de 200 rpm, de 0,545 g/L.h de 2,3-BD e produção de 0,180 g/L.h de 1,3-PD em agitação de 160 rpm. Sendo que a glicose e o extrato de levedura tiveram efeitos positivos e significativos na produtividade de 2,3-BD e 1,3-PD. Nos ensaios onde foram utilizados maiores transferência de oxigênio observou-se decréscimos na produção de 1,3-PD e uma melhora significativa na produção de 2,3-BD. No estudo de recuperação dos dióis, foi possível recuperar 82% dos dióis utilizando carbonato de potássio 70% na temperatura de 20 ºC e no tempo de reação de 6 horas. / Among the main concerns related to the production of biodiesel is the surplus of crude glycerine. This corresponds to approximately 10% of the total mass of the biodiesel production process and has been accumulated and stored in the biodiesel plants, creating enormous amounts of waste and serious environmental problems. A way to lessen this problem is to use it for the formulation of fermentation medium to obtain products of economic interest. Examples are the production of diols such as, 1,3-propanediol (1,3-PD) and 2,3-butanediol (2,3-BD). These monomers are large market application, and the 1,3-PD used for the manufacture of polyurethanes, cyclic compounds and new types of polyesters. The 2,3-BD is used as antifreeze, biofuel and as an important flavoring. Thus, in present work aims to enrich the residual glycerine from biodiesel production to its bioconversion in 2,3-BD and 1,3-PD by bacterium Klebsiella pneumoniae NRRL B199. Therefore, the purpose of this consisted of four joint steps: 1st. Establish an appropriate treatment for residual glycerine to allow bacterial growth and diols formation. 2nd. To adapt the composition of fermentation medium, as concentrations of residual glycerine, with glucose supplementation, yeast extract and trace elements of Fe2+, Zn2+ e Mn2+ in the fermentation process. 3rd. Define the best condition of oxygen transfer in a batch system, associated with substrate concentration for the best product formation. 4th. To evaluate the separation procedure of products through the of salting-out technique. Studies of step 1 and 2 were conducted in 250 mL Erlenmeyer flasks with 50 mL medium. In step 3, the study aeration and agitation was performed in Bioflo III fermentor (New Brunswick Sci Co.) was 1,25 L. With the results, it was concluded that the treatment was adequate for use of residual glycerine as carbon source for growth of the bacterium Klebsiella pneumoniae. Furthermore, the work carried out on bottles showed a maximum production 2,3-BD of 0.545 g/L.h in agitation of 200 rpm and production 1,3-PD of 0.180 g/Lh in agitation of 160 rpm. With glucose and yeast extract had positive and significant effects on productivity of 2,3-BD and 1,3-PD. For tests were used higher oxygen transfer observed decrease in the production of 1,3-PD and a significant improvement in the production of 2,3-BD. In the study of recovery of diols, it was possible to recover 82% of diols using 70% potassium carbonate at temperature of 20 °C and in reaction time of 6 hours.

O 1,3-propanodiol (PDO) é um composto químico com muitas aplicações industriais, como síntese de polímeros de tereftalatos, cosméticos e lubrificantes, dentre outros. Este composto pode ser produzido biotecnologicamente a partir do glicerol em condições de anaerobiose. Os principais produtores naturais de PDO são bactérias dos gêneros Klebsiella e Clostridium. No entanto, estes microrganismos podem apresentar riscos à saúde humana, sendo considerados oportunistas e, por isso, requerendo cuidados especiais que dificultam seu emprego em escala industrial. Uma alternativa está no uso de Lactobacillus sp., bactérias que realizam altas conversões de glicerol a PDO e não apresentam estes inconvenientes. Neste estudo, buscou-se melhorar a produtividade da transformação de glicerol em PDO por Lactobacillus reuteri, através de diferentes tipos de bioprocessos. Para isso, o microrganismo foi cultivado em meio MRS (com glicose) contendo glicerol como cosubstrato. Realizaram-se experimentos em batelada, batelada repetida e em processo contínuo (quimiostato) sob diferentes condições. Os melhores resultados foram obtidos nos processos em batelada repetida e em quimiostato. Nos ensaios em batelada repetida, a melhor condição foi nos cultivos em que houve decantação de células. Nesta condição, a produtividade (QPDO) superou em quase 3 vezes o ensaio em batelada comum (4,12 g.L-1.h-1). Em quimiostato, a produtividade alcançada sob a taxa de diluição de 0,5 h-1 foi 20% maior do que o melhor resultado em batelada repetida (4,88 g.L-1.h-1). Estes valores de produtividade são os maiores reportados na literatura até o momento. Além disso, os resultados indicam que o processo em quimiostato não é limitado pelo substrato, mas sim pela concentração de lactato produzido. / 1,3-propanediol (PDO) is a high-value chemical compound which has many industrial applications, such as synthesis of polymers of terephthalates, cosmetics and lubricants, among others. This compound can be produced biotechnologically from glycerol in anaerobiosis. The main natural producers of PDO are bacteria from genera Klebsiella and Clostridium. However, these microorganisms could be dangerous to human health, considered opportunistic and therefore require special care when manipulated on an industrial scale. An alternative is the use of Lactobacillus sp., bacteria which achieve high conversions of glycerol to PDO and do not present these problems. In this study, we aimed to improve the yield of PDO by Lactobacillus reuteri through different types of bioprocesses. For this, the microorganism was grown in MRS medium (with glucose) containing glycerol as co-substrate. Experiments were performed in batch run, repeated batch and continuous mode (chemostat) under different conditions. The best results were found in repeated batch run and chemostat mode. In repeated batch runs, the best condition was found in cultures with settling of cells. In this condition, the productivity (QPDO) reached almost 3 times the value of the simple batch run (4.12 g.L-1.h-1). In chemostat mode, the productivity reached, in the dilution rate of 0.5 h-1, was 20% higher than the best result obtained in repeated batch mode (4.88 g.L-1.h-1). These productivity values are the highest reported in the literature until this date. Furthermore, the results indicate that the chemostat process is not limited by the substrate, but by the concentration of produced lactate.

Dentre as principais preocupações relacionadas à cadeia de produção do biodiesel está o excedente de glicerina bruta. Esta corresponde a cerca de 10% da massa total resultante do processo de produção do biodiesel e vem sendo acumulada e armazenada nas usinas, formando grandes estoques de resíduos e deixando diversas empresas diante de um passivo ambiental agravante. Uma forma de diminuir esse problema é utilizá-la para formulação de meios de fermentação para obtenção de produtos de interesse econômico. Exemplos são as produções de dióis como; 1,3-Propanodiol (1,3-PD) e 2,3-Butanodiol (2,3-BD). Estes são monômeros de grande aplicação no mercado, sendo o 1,3-PD usado para fabricação de poliuretanos, compostos cíclicos e novos tipos de poliésteres. O 2,3-BD é utilizado como anticongelante, biocombustível e como um importante aromatizante. Assim, no presente trabalho propõe-se valorizar a glicerina residual da fabricação de biodiesel, visando sua bioconversão em 2,3-BD e 1,3-PD, pela bactéria Klebsiella pneumoniae NRRL B199. Para tanto, a proposta deste trabalho compreendeu quatro etapas conjuntas: 1. Estabelecer um tratamento adequado para a glicerina residual de forma a permitir o crescimento bacteriano e formação dos dióis. 2. Adequar à composição do meio de fermentação, quanto às concentrações de glicerol, com suplementação de glicose, extrato de levedura e elementos traço Fe2+, Zn2+ e Mn2+ no processo fermentativo. 3. Definir a melhor condição de transferência de oxigênio em sistema descontínuo, associada à concentração de substrato, para a melhor formação de produtos. 4. Avaliar o procedimento de separação dos produtos do meio pela técnica de salting-out. Os estudos da etapa 1 e 2 foram realizados em frascos Erlenmeyer de 250 mL com 50 mL de meio. Na etapa 3, o estudo de aeração e agitação foi realizado em fermentador Bioflo III (New Brunswick Sci. Co.) de 1,25 L. Com os resultados obtidos, concluiu-se que o tratamento realizado foi adequado para o emprego da glicerina residual como fonte de carbono para o crescimento da bactéria Klebsiella pneumoniae. Além disso, os trabalhos realizados em frascos revelaram uma produção máxima, em agitação de 200 rpm, de 0,545 g/L.h de 2,3-BD e produção de 0,180 g/L.h de 1,3-PD em agitação de 160 rpm. Sendo que a glicose e o extrato de levedura tiveram efeitos positivos e significativos na produtividade de 2,3-BD e 1,3-PD. Nos ensaios onde foram utilizados maiores transferência de oxigênio observou-se decréscimos na produção de 1,3-PD e uma melhora significativa na produção de 2,3-BD. No estudo de recuperação dos dióis, foi possível recuperar 82% dos dióis utilizando carbonato de potássio 70% na temperatura de 20 ºC e no tempo de reação de 6 horas. / Among the main concerns related to the production of biodiesel is the surplus of crude glycerine. This corresponds to approximately 10% of the total mass of the biodiesel production process and has been accumulated and stored in the biodiesel plants, creating enormous amounts of waste and serious environmental problems. A way to lessen this problem is to use it for the formulation of fermentation medium to obtain products of economic interest. Examples are the production of diols such as, 1,3-propanediol (1,3-PD) and 2,3-butanediol (2,3-BD). These monomers are large market application, and the 1,3-PD used for the manufacture of polyurethanes, cyclic compounds and new types of polyesters. The 2,3-BD is used as antifreeze, biofuel and as an important flavoring. Thus, in present work aims to enrich the residual glycerine from biodiesel production to its bioconversion in 2,3-BD and 1,3-PD by bacterium Klebsiella pneumoniae NRRL B199. Therefore, the purpose of this consisted of four joint steps: 1st. Establish an appropriate treatment for residual glycerine to allow bacterial growth and diols formation. 2nd. To adapt the composition of fermentation medium, as concentrations of residual glycerine, with glucose supplementation, yeast extract and trace elements of Fe2+, Zn2+ e Mn2+ in the fermentation process. 3rd. Define the best condition of oxygen transfer in a batch system, associated with substrate concentration for the best product formation. 4th. To evaluate the separation procedure of products through the of salting-out technique. Studies of step 1 and 2 were conducted in 250 mL Erlenmeyer flasks with 50 mL medium. In step 3, the study aeration and agitation was performed in Bioflo III fermentor (New Brunswick Sci Co.) was 1,25 L. With the results, it was concluded that the treatment was adequate for use of residual glycerine as carbon source for growth of the bacterium Klebsiella pneumoniae. Furthermore, the work carried out on bottles showed a maximum production 2,3-BD of 0.545 g/L.h in agitation of 200 rpm and production 1,3-PD of 0.180 g/Lh in agitation of 160 rpm. With glucose and yeast extract had positive and significant effects on productivity of 2,3-BD and 1,3-PD. For tests were used higher oxygen transfer observed decrease in the production of 1,3-PD and a significant improvement in the production of 2,3-BD. In the study of recovery of diols, it was possible to recover 82% of diols using 70% potassium carbonate at temperature of 20 °C and in reaction time of 6 hours.

A utilização de combustíveis renováveis tem se destacado nos últimos anos, principalmente devido aos impactos ambientais gerados pelo uso de combustíveis fósseis e escassez dos mesmos. Dentre os combustíveis renováveis destaca-se o biodiesel, cujo processo produtivo apresenta como principal subproduto o glicerol bruto, que tem instigado nos últimos anos intensas discussões sobre a problemática de sua destinação e disposição final. Apesar de ser utilizado na indústria química, o seu teor de impurezas limita o seu processamento industrial. Buscando agregar valor a esse resíduo bruto e contribuir para a produção de bioenergia, este trabalho teve por intuito avaliar a produção dos biocombustíveis hidrogênio e metano, assim como de intermediários químicos a partir de glicerol bruto como substrato em reatores anaeróbios de leito fluidificado (RALF), mesofílicos (30°C), utilizando inóculo de cultura mista. O RALF-H2, com o objetivo de produzir hidrogênio e metabólitos solúveis, foi submetido à concentração de 10 g.L-1 de glicerol e variação do tempo de detenção hidráulica (TDH) de 8, 6, 4, 2, 1 e 0,5 h. Já o RALF-CH4, com intuito de produzir metano, operou sob TDH fixo de 24 h, submetido à variação da concentração de glicerol de 1, 2, 3, 4, 5 e 7 g.L-1, e portanto, da taxa de carregamento orgânico (TCO) de 1, 2, 3, 4, 5 e 7 kgDQO.m-3.d-1, respectivamente. No RALF-H2, os valores máximos de conteúdo de hidrogênio no biogás (69,2 %), produtividade volumétrica de hidrogênio (1,90 L.h-1.L-1) e rendimento de hidrogênio (0,28 molH2.mol-1glicerolconsumido) foram verificados no TDH de 0,5 h. O 1,3-propanodiol se destacou entre os metabólitos produzidos, com rendimento máximo de 0,57 mol1,3-PDO.mol-1glicerolconsumido, alcançado no TDH de 8 h. No RALF-CH4, o máximo conteúdo de metano no biogás (83,0%) foi verificado na TCO de 1 kgDQO.m-3.d-1, a maior produtividade volumétrica de metano (2,26 L.d-1.L-1) na TCO de 5 kgDQO.m-3.d-1 e o máximo rendimento (0,19 m3H4.kg-1DQOaplicada ou 0,77 molCH4.mol-1glicerolconsumido) na TCO de 4 kgDQO.m-3.d-1. Portanto, os resultados evidenciaram a possibilidade de produção de biocombustíveis e metabólitos de valor agregado utilizando glicerol bruto como substrato no processo da digestão anaeróbia. / The use of renewable fuels has been highlighted in recent years, mainly due to the environmental impacts generated by the use of fossil fuels and their scarcity. Among the renewable fuels highlights the biodiesel, whose production process displays as the main byproduct crude glycerol, which has instigated in recent years, intense debates about a problem of its destination and final disposal. Although it is used in the chemical industry, its impurities content limits its industrial processing. In order to add value to this crude residue and to contribute to the production of bioenergy, this work aimed to evaluate the production of biofuels hydrogen and methane, as well as chemical intermediates from crude glycerol as substrate in anaerobic fluidized bed reactors (AFBR), mesophilic (30°C), using mixed culture inoculum. The AFBR-H2, with the objective of producing hydrogen and soluble metabolites, was submitted to a concentration of 10 g.L-1 of glycerol and a variation of the hydraulic retention time (HRT) of 8, 6, 4, 2, 1 and 0.5 h. The AFBR-CH4, with the intention of producing methane, operated under fixed HRT of 24 h, subjected to the variation of the glycerol concentration of 1, 2, 3, 4, 5 and 7 g.L-1 and, therefore, of the organic loading rate (OLR) of 1, 2, 3, 4, 5 and 7 kgCOD.m-3d-1, respectively. In the AFBR-H2, the maximum values of hydrogen content in the biogas (69.2%), hydrogen volumetric productivity (1.90 L.h-1.L-1) and hydrogen yield (0.28 molH2.mol-1glycerolconsumed) were verified in the HRT of 0.5 h. The 1,3-propanediol was highlighted among the metabolites produced, with a maximum yield of 0.57 mol1,3-PDO.mol-1glycerolconsumed, reached in the TDH of 8 h. In the AFBR-CH4, the higher methane content in the biogas (83.0%) was detected in the OLR of 1 kgCOD.m-3.d-1, a higher volumetric productivity of methane (2.26 L.d-1.L-1) in the OLR of 5 kgCOD.m-3.d-1 and the maximum yield (0.19 m3CH4.kg-1CODapplied or 0.77 molCH4.mol-1glycerolconsumed) in the OLR of 4 kgCOD.m-3d-1. Therefore, the results evidenced the possibility of producing biofuels and value-added metabolites using crude glycerol as a substrate at the anaerobic digestion process.

Submitted by Bruna Rodrigues (bruna92rodrigues@yahoo.com.br) on 2016-10-03T14:22:13Z No. of bitstreams: 1 DissAGOP.pdf: 2381103 bytes, checksum: 25fa623c6fb2845927f58c532b278f6b (MD5) / Approved for entry into archive by Marina Freitas (marinapf@ufscar.br) on 2016-10-10T17:29:42Z (GMT) No. of bitstreams: 1 DissAGOP.pdf: 2381103 bytes, checksum: 25fa623c6fb2845927f58c532b278f6b (MD5) / Approved for entry into archive by Marina Freitas (marinapf@ufscar.br) on 2016-10-10T17:29:50Z (GMT) No. of bitstreams: 1 DissAGOP.pdf: 2381103 bytes, checksum: 25fa623c6fb2845927f58c532b278f6b (MD5) / Made available in DSpace on 2016-10-10T17:29:58Z (GMT). No. of bitstreams: 1 DissAGOP.pdf: 2381103 bytes, checksum: 25fa623c6fb2845927f58c532b278f6b (MD5) Previous issue date: 2016-03-18 / Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) / This study aimed to optimize the production of hydrogen and other metabolites using crude glycerol as substrate, through design of experiments (DoE) and statistical process optimization. The first study aimed at optimizing the operational parameters of the fermentation process, and therefore, a mesophilic AFBR reactor was operated on 10 different phases, distributed as a combination of HRT and the glycerol concentration (Gc) proposed by a matrix containing CCD array containing 10 experimental trials. The HRT varied to 9.24h to 0.76h, while Gc ranged from 17.1g / L to 2.9 g / L. The results showed that the maximum conversion of glycerol (CG), 98.4%, was obtained using substrate concentrations lower than 5.0 g/L. The maximum yield (0.17 mol H2 / mol consumed glycerol) and H2 content in the produced biogas (87.4%) were achieved at concentrations greater than 10.0 g/L and HRT of 5h. Among the main soluble metabolites produced, 1,3-propanediol (1,3-PD) and propionic acid (HPr) stood out. The maximum yield of 1,3-PD (1.05 mol 1,3-PD / mol consumed glycerol) was obtained with 10.0 g/L glycerol in HRT of 9,24h, whereas the maximum yield of HPr (0.71 mol HPr / mol consumed glycerol) was achieved with 15.0 g/L of glycerol and HRT of 2h. The second study, in turn, consisted of optimizing the culture medium components (glycerol, KH2PO4, yeast extract and vitamin B12), through batch tests, and subsequent application in AFBR reactor. The maximum hydrogen and ethanol yields, 0.006 and 0.291 mol / mol consumed glycerol, was obtained in optimal culture medium consisting of 26.53 g/L glycerol, 1.75 g/L KH2PO4, 0.0076 g/L B12 and 0.5 g/L yeast extract. The application of optimal culture medium in a continuous reactor did not result in improvement of H2 and ethanol yields, however, caused an increase in 1,3-PD yield, reaching a maximum of 0.38 mol 1.3-PD / mol consumed glycerol. / O presente trabalho teve como objetivo otimizar a produção de hidrogênio e outros metabólitos, utilizando glicerol bruto como substrato, empregando técnicas de planejamento experimental e otimização estatística de processos. O primeiro estudo visou a otimização de parâmetros operacionais do processo fermentativo, e para tanto, um reator RALF mesofílico foi operado em 10 fases distintas, distribuídas conforme uma combinação do TDH e da concentração de glicerol (Cg) proposta por uma matriz de um DCCR contendo 10 condições experimentais. O TDH variou de 9,24h a 0,76h, enquanto a Cg variou de 17,1 g/L a 2,9 g/L. Os resultados obtidos mostraram que a máxima conversão de glicerol (CG), 98,4%, foi obtida utilizando concentrações de substrato menores que 5,0 g/L. O máximo rendimento (0,17 mol H2/mol glicerol consumido) e conteúdo de H2 no biogás produzido (87,4%) foram atingidos em concentrações superiores a 10,0 g/L e TDH de 5h. Dentre os principais metabólitos solúveis produzidos, 1,3-propanodiol (1,3-PD) e ácido propiônico (HPr) se destacaram. O máximo rendimento de 1,3-PD (1,05 mol 1,3-PD/mol glicerol consumido) foi obtido com 10,0 g/L de glicerol em TDH de 9,24h, enquanto que o máximo rendimento de HPr (0,71 mol HPr/mol glicerol consumido) foi alcançado com 15,0 g/L de glicerol e TDH de 2h. O segundo estudo, por sua vez, consistiu na otimização de componentes do meio de cultura (glicerol, KH2PO4, extrato de levedura e vitamina B12), através de ensaios em batelada, e posterior aplicação em RALF. Os máximos rendimentos de H2 e etanol, 0,006 e 0,291 mol/mol glicerol consumido, foram obtidos em meio de cultura ótimo constituído por 26,53 g/L de glicerol, 1,75 de KH2PO4, 0,0076 g/L de B12 e 0,5 g/L de extrato de levedura. A aplicação do meio de cultura otimizado em reator contínuo não resultou na melhoria dos rendimentos de H2 e etanol, no entanto, ocasionou um aumento no rendimento de 1,3-PD, alcançando 0,38 mol 1,3-PD/mol glicerol consumido.

A utilização de combustíveis renováveis tem se destacado nos últimos anos, principalmente devido aos impactos ambientais gerados pelo uso de combustíveis fósseis e escassez dos mesmos. Dentre os combustíveis renováveis destaca-se o biodiesel, cujo processo produtivo apresenta como principal subproduto o glicerol bruto, que tem instigado nos últimos anos intensas discussões sobre a problemática de sua destinação e disposição final. Apesar de ser utilizado na indústria química, o seu teor de impurezas limita o seu processamento industrial. Buscando agregar valor a esse resíduo bruto e contribuir para a produção de bioenergia, este trabalho teve por intuito avaliar a produção dos biocombustíveis hidrogênio e metano, assim como de intermediários químicos a partir de glicerol bruto como substrato em reatores anaeróbios de leito fluidificado (RALF), mesofílicos (30°C), utilizando inóculo de cultura mista. O RALF-H2, com o objetivo de produzir hidrogênio e metabólitos solúveis, foi submetido à concentração de 10 g.L-1 de glicerol e variação do tempo de detenção hidráulica (TDH) de 8, 6, 4, 2, 1 e 0,5 h. Já o RALF-CH4, com intuito de produzir metano, operou sob TDH fixo de 24 h, submetido à variação da concentração de glicerol de 1, 2, 3, 4, 5 e 7 g.L-1, e portanto, da taxa de carregamento orgânico (TCO) de 1, 2, 3, 4, 5 e 7 kgDQO.m-3.d-1, respectivamente. No RALF-H2, os valores máximos de conteúdo de hidrogênio no biogás (69,2 %), produtividade volumétrica de hidrogênio (1,90 L.h-1.L-1) e rendimento de hidrogênio (0,28 molH2.mol-1glicerolconsumido) foram verificados no TDH de 0,5 h. O 1,3-propanodiol se destacou entre os metabólitos produzidos, com rendimento máximo de 0,57 mol1,3-PDO.mol-1glicerolconsumido, alcançado no TDH de 8 h. No RALF-CH4, o máximo conteúdo de metano no biogás (83,0%) foi verificado na TCO de 1 kgDQO.m-3.d-1, a maior produtividade volumétrica de metano (2,26 L.d-1.L-1) na TCO de 5 kgDQO.m-3.d-1 e o máximo rendimento (0,19 m3H4.kg-1DQOaplicada ou 0,77 molCH4.mol-1glicerolconsumido) na TCO de 4 kgDQO.m-3.d-1. Portanto, os resultados evidenciaram a possibilidade de produção de biocombustíveis e metabólitos de valor agregado utilizando glicerol bruto como substrato no processo da digestão anaeróbia. / The use of renewable fuels has been highlighted in recent years, mainly due to the environmental impacts generated by the use of fossil fuels and their scarcity. Among the renewable fuels highlights the biodiesel, whose production process displays as the main byproduct crude glycerol, which has instigated in recent years, intense debates about a problem of its destination and final disposal. Although it is used in the chemical industry, its impurities content limits its industrial processing. In order to add value to this crude residue and to contribute to the production of bioenergy, this work aimed to evaluate the production of biofuels hydrogen and methane, as well as chemical intermediates from crude glycerol as substrate in anaerobic fluidized bed reactors (AFBR), mesophilic (30°C), using mixed culture inoculum. The AFBR-H2, with the objective of producing hydrogen and soluble metabolites, was submitted to a concentration of 10 g.L-1 of glycerol and a variation of the hydraulic retention time (HRT) of 8, 6, 4, 2, 1 and 0.5 h. The AFBR-CH4, with the intention of producing methane, operated under fixed HRT of 24 h, subjected to the variation of the glycerol concentration of 1, 2, 3, 4, 5 and 7 g.L-1 and, therefore, of the organic loading rate (OLR) of 1, 2, 3, 4, 5 and 7 kgCOD.m-3d-1, respectively. In the AFBR-H2, the maximum values of hydrogen content in the biogas (69.2%), hydrogen volumetric productivity (1.90 L.h-1.L-1) and hydrogen yield (0.28 molH2.mol-1glycerolconsumed) were verified in the HRT of 0.5 h. The 1,3-propanediol was highlighted among the metabolites produced, with a maximum yield of 0.57 mol1,3-PDO.mol-1glycerolconsumed, reached in the TDH of 8 h. In the AFBR-CH4, the higher methane content in the biogas (83.0%) was detected in the OLR of 1 kgCOD.m-3.d-1, a higher volumetric productivity of methane (2.26 L.d-1.L-1) in the OLR of 5 kgCOD.m-3.d-1 and the maximum yield (0.19 m3CH4.kg-1CODapplied or 0.77 molCH4.mol-1glycerolconsumed) in the OLR of 4 kgCOD.m-3d-1. Therefore, the results evidenced the possibility of producing biofuels and value-added metabolites using crude glycerol as a substrate at the anaerobic digestion process.