Interest in the aliphatic carbon compound 1,3-propanediol (1,3-PDO) has risen over the past 15 years. In part, this interest is due to the ability of 1,3-PDO to generate a variety of industrially relevant products such as the biodegradable polymer, polytrimethylene terephtalate. Our research group previously reported the identification of a novel Lactobacillus panis PM1 isolate capable of converting glycerol to 1,3-PDO. In this body of work, the effects of various process parameters and the ability of the novel L. panis isolate to produce 1,3-PDO in static and fed-batch cultures were examined. Data collected indicated that the concentrations of glycerol, and glucose, and pH, play a vital role in the optimized production of 1,3-PDO. Optimal conditions for the production of 1,3-PDO were determined to include: i) carbon-limited culture, defined as below 50 mM glucose and ii) growth at 37°C without agitation in the presence of glycerol (150 – 250 mM) at an elevated pH of 9 – 10. Factors such as inoculum size and temperature (OD600 in the range of 0.5 – 2 and a temperature range from 15° - 37°C) in a two-step fermentation showed insignificant variance in the production of 1,3-PDO. Initial fed-batch trials reflected the importance of pH on culture viability. A pH of 8 was determined to be necessary within culture parameters for the fed-batch production of 1,3-PDO. Further, the molar concentrations of 1,3-PDO produced were found to vary only slightly between fed batch culture and a static culture. The variance of 1,3-PDO production between the static and fed-batch trials was found to be 9.1 ± 4.9 mM for an average culture producing 85.3 ± 12.0 mM of 1,3-PDO. However, the mol concentrations of 1,3-PDO produced were found to be significantly higher with 22.3 ± 1.6 versus 5.3 ± 0.7 mmol 1,3-PDO produced for the fed batch versus the static cultures, respectively. The duration of 1,3-PDO production was found to be extended in the fed-batch model of production with increased levels of 1,3-PDO being produced over 120 hours. The cloning and characterization of the recombinant 1,3-PDO NAD+-dependent oxidoreductase also were explored to gain further insight into the native production of 1,3-PDO. Initial kinetic studies determined a Km value of 1.28 ± 0.57 mM for NAD+ versus 23.8 ± 1.1 mM for 1,3-PDO. The Km values demonstrated that the availability of NAD+/NADH may be a determining factor in 1,3-PDO concentration. These findings support the literature and the conclusion that the bottleneck in 1,3-PDO production lies in maintaining an available pool of NAD+/NADH while mitigating negative effects associated with the accumulation of toxic byproducts.

L’ingénierie métabolique utilise des techniques de clonage pour moduler directement les voies métaboliques des microorganismes dans le but de produire des molécules d’intérêts. Précédemment envisagée pour surproduire des métabolites endogènes, l’ingénierie métabolique est aussi considérée maintenant comme une approche prometteuse pour la biosynthèse de composés non naturels par l'expression de voies métaboliques synthétiques. Cependant, malgré leur évolution au cours de millions d’années, les enzymes sont cependant peu ou pas adaptées aux nouvelles fonctions catalytiques requises par ce métabolisme synthétique. Le but de cette thèse est donc d’améliorer deux enzymes qui sont requises pour la construction et le fonctionnement de voies artificielles conduisant à la biosynthèse de molécules d’intérêts, en particulier le (L)-2,4-dihydroxybutyrate et le 1,3-propanediol, en appliquant des concepts d'ingénieries microbienne et enzymatique. / Metabolic engineering, defined as the rational engineering of organisms towards production goals, has greatly evolved since its conception over three decades ago. Once applied to overproduce cell endogenous metabolites, it is now a promising approach also for the biosynthesis of non-natural compounds through the expression of synthetic metabolic pathways. Improved over billions of years by evolution, enzymes are however less adapted to new catalytic functions as required by synthetic metabolism. The present work was aimed at the construction and optimization of artificial routes for the biosynthesis of two industrially relevant commodity chemicals (L-2,4-dihydroxybutyrate and 1,3-propanediol) through the application of concepts of enzyme rational design, directed evolution and microbial engineering.

Este projeto teve como objetivo a produção de 1,3-propanodiol (1,3-PDO) utilizando glicerol como matéria prima, que pode ser proveniente da indústria de biodiesel. O 1,3-PDO é um produto de interesse na indústria biotecnológica, como precursor para diversos processos. Sua maior aplicação é na produção do bioplástico Politrimetileno Tereftalato (PTT), um termoplástico reciclável não biodegradável com qualidades superiores a do Polietileno Tereftalato (PET). Atualmente, o 1,3-PDO é produzido principalmente por síntese química, utilizando derivados do petróleo, mas a alternativa por microrganismos é vantajosa, pois gera menor emissão de poluentes, usa recursos renováveis e tem menor custo de produção. As bactérias apresentadas nesse trabalho são Escherichia coli recombinantes com genes da bactéria naturalmente produtora de 1,3-PDO Klebsiella pneumoniae. Analisando os dados da literatura, as Análises de Balanço de Fluxo (FBA) e dados experimentais, este projeto teve como objetivo eliminar total ou parcialmente os subprodutos lactato e acetato de E. coli recombinantes e analisar o impacto no metabolismo da bactéria e na produção de 1,3-PDO. Também foi o objetivo analisar o papel do gene yqhD na produção, combinando as mutações que produziam mais com as já obtidas, num esforço de melhorar o processo de produção estabelecido. Foram obtidas 4 linhagens da E. coli modificadas geneticamente, nas quais os seguintes genes foram alvos de estudo: ackA, ldhA, poxB, pta e yqhD. Também foram feitas combinações destas linhagens com uma cepa de E. coli já obtida com mutação na enzima Isocitrato Desidrogenase, na qual a especificidade por coenzimas foi alterada (NADP+ para NAD+), o que gerou mais 6 linhagens para estudo. Todos os genes propostos foram deletados e as linhagens tiveram a produção analisada. Com base em resultados preliminares foram construídas novas linhagens combinando as modificações, e todas tiveram a produção testada. A melhor das linhagens foi uma E. coli icdNAD+ΔyqhD, cultivada em biorreator. Foram observados aumentos no fator de conversão (até 0,489 molPDO/molglicerol) e produtividade (até 0,312gPDO.L-1.h-1). Mutantes derivadas desta, para produzir menos acetato, foram construídas e cultivadas em biorreator. Na tentativa de criar uma linhagem com potencial de ser usada na indústria, um gene essencial foi clonado no plasmídeo de produção, na tentativa de resolver problemas de larga escala. Esse novo plasmídeo, quando usado em uma linhagem específica, elimina a necessidade de usar antibiótico no meio e mantém o elevado número de cópias dos genes de interesse. Novos incrementos poderão ser obtidos explorando diferentes condições de oferta de oxigênio. Os objetivos iniciais foram alcançados: construir linhagens mais produtivas de 1,3-PDO e começar a estudar os efeitos da eliminação de genes responsáveis por alguns subprodutos na produção. Os resultados aqui obtidos ainda puderam indicar a importância de alguns genes, e agora perguntas mais específicas podem ser feitas, bem como hipóteses testadas. / This project aimed at producing 1,3-propanediol (1,3-PD) using glycerol as carbon source, which can be proven from the biodiesel industry. 1,3-PD is a significant product in biotechnology as a precursor to several processes. Its main application is as monomer of the bioplastic Polytrimethylene Terephthalate (PTT), a non-biodegradable recyclable thermoplastic with superior qualities over Polyethylene Terephthalate (PET). 1,3-PD is produced mostly by chemical synthesis from petroleum derivatives. The alternative produced by microorganisms is more advantageous due to the use of renewable raw material and the lower cost of production. The bacteria presented here are recombinant strains of Escherichia coli, harboring genes from the natural producer of 1,3-PD, Klebsiella pneumoniae. Reviewing the literature, simulations of Flux Balance Analysis (FBA) and experimental observations, this project aimed at eliminating partially or completely the lactate and acetate byproducts in strains of E. coli, and at understanding the effects of the mutations in production and growing. We also analyzed the role of the yqhD gene in the production of 1,3-PD, combining the mutations that produced more 1,3-PD with each other, to improve the current production process. Four recombinant strains of E. coli were first obtained in a first experimentation, in which the following genes were analyzed: ackA, ldhA, poxB, pta e yqhD. Combinations of these strains was also made with one previously obtained E. coli with mutation at the Isocitrate dehydrogenase enzyme, with specificity altered by coenzymes (NAD+ instead NADP+), resulting in 6 more strains. All genes of interest were deleted, and the mutants had the production evaluated. Based on preliminary results, new strains were constructed combining the modifications, all tested in shake flasks. The best strain for production was an E. coli icdNAD+ΔyqhD, cultivated in bioreactor. It was observed an increase in the yield (up to 0.489 molPDO/molglycerol) and productivity (up to 0.312 gPDO.L-1.h-1). Mutants lacking genes responsible for acetate formation were obtained from the best strain, in order to reduce acetate at batch. At last, in an attempt to create a strain with potential to be used in industry, an essential gene was cloned in the production plasmid, trying to solve some large-scale problems. This new plasmid used in a specific strain eliminate the use of antibiotics, and still preserve the high copy number of the genes of interest. Further improvements could be achieved by exploring different oxygen supply conditions. The initial objectives were achieved: to construct more productive strains of 1,3-PD and study the effect of the deletion of genes responsible of byproducts. Furthermore, the results obtained in this research could reveal the importance of some genes, and from here, more specific questions and hypothesis can be investigated.

O 1,3-propanodiol (PDO) é um composto químico com muitas aplicações industriais, como síntese de polímeros de tereftalatos, cosméticos e lubrificantes, dentre outros. Este composto pode ser produzido biotecnologicamente a partir do glicerol em condições de anaerobiose. Os principais produtores naturais de PDO são bactérias dos gêneros Klebsiella e Clostridium. No entanto, estes microrganismos podem apresentar riscos à saúde humana, sendo considerados oportunistas e, por isso, requerendo cuidados especiais que dificultam seu emprego em escala industrial. Uma alternativa está no uso de Lactobacillus sp., bactérias que realizam altas conversões de glicerol a PDO e não apresentam estes inconvenientes. Neste estudo, buscou-se melhorar a produtividade da transformação de glicerol em PDO por Lactobacillus reuteri, através de diferentes tipos de bioprocessos. Para isso, o microrganismo foi cultivado em meio MRS (com glicose) contendo glicerol como cosubstrato. Realizaram-se experimentos em batelada, batelada repetida e em processo contínuo (quimiostato) sob diferentes condições. Os melhores resultados foram obtidos nos processos em batelada repetida e em quimiostato. Nos ensaios em batelada repetida, a melhor condição foi nos cultivos em que houve decantação de células. Nesta condição, a produtividade (QPDO) superou em quase 3 vezes o ensaio em batelada comum (4,12 g.L-1.h-1). Em quimiostato, a produtividade alcançada sob a taxa de diluição de 0,5 h-1 foi 20% maior do que o melhor resultado em batelada repetida (4,88 g.L-1.h-1). Estes valores de produtividade são os maiores reportados na literatura até o momento. Além disso, os resultados indicam que o processo em quimiostato não é limitado pelo substrato, mas sim pela concentração de lactato produzido. / 1,3-propanediol (PDO) is a high-value chemical compound which has many industrial applications, such as synthesis of polymers of terephthalates, cosmetics and lubricants, among others. This compound can be produced biotechnologically from glycerol in anaerobiosis. The main natural producers of PDO are bacteria from genera Klebsiella and Clostridium. However, these microorganisms could be dangerous to human health, considered opportunistic and therefore require special care when manipulated on an industrial scale. An alternative is the use of Lactobacillus sp., bacteria which achieve high conversions of glycerol to PDO and do not present these problems. In this study, we aimed to improve the yield of PDO by Lactobacillus reuteri through different types of bioprocesses. For this, the microorganism was grown in MRS medium (with glucose) containing glycerol as co-substrate. Experiments were performed in batch run, repeated batch and continuous mode (chemostat) under different conditions. The best results were found in repeated batch run and chemostat mode. In repeated batch runs, the best condition was found in cultures with settling of cells. In this condition, the productivity (QPDO) reached almost 3 times the value of the simple batch run (4.12 g.L-1.h-1). In chemostat mode, the productivity reached, in the dilution rate of 0.5 h-1, was 20% higher than the best result obtained in repeated batch mode (4.88 g.L-1.h-1). These productivity values are the highest reported in the literature until this date. Furthermore, the results indicate that the chemostat process is not limited by the substrate, but by the concentration of produced lactate.

Dentre as principais preocupações relacionadas à cadeia de produção do biodiesel está o excedente de glicerina bruta. Esta corresponde a cerca de 10% da massa total resultante do processo de produção do biodiesel e vem sendo acumulada e armazenada nas usinas, formando grandes estoques de resíduos e deixando diversas empresas diante de um passivo ambiental agravante. Uma forma de diminuir esse problema é utilizá-la para formulação de meios de fermentação para obtenção de produtos de interesse econômico. Exemplos são as produções de dióis como; 1,3-Propanodiol (1,3-PD) e 2,3-Butanodiol (2,3-BD). Estes são monômeros de grande aplicação no mercado, sendo o 1,3-PD usado para fabricação de poliuretanos, compostos cíclicos e novos tipos de poliésteres. O 2,3-BD é utilizado como anticongelante, biocombustível e como um importante aromatizante. Assim, no presente trabalho propõe-se valorizar a glicerina residual da fabricação de biodiesel, visando sua bioconversão em 2,3-BD e 1,3-PD, pela bactéria Klebsiella pneumoniae NRRL B199. Para tanto, a proposta deste trabalho compreendeu quatro etapas conjuntas: 1. Estabelecer um tratamento adequado para a glicerina residual de forma a permitir o crescimento bacteriano e formação dos dióis. 2. Adequar à composição do meio de fermentação, quanto às concentrações de glicerol, com suplementação de glicose, extrato de levedura e elementos traço Fe2+, Zn2+ e Mn2+ no processo fermentativo. 3. Definir a melhor condição de transferência de oxigênio em sistema descontínuo, associada à concentração de substrato, para a melhor formação de produtos. 4. Avaliar o procedimento de separação dos produtos do meio pela técnica de salting-out. Os estudos da etapa 1 e 2 foram realizados em frascos Erlenmeyer de 250 mL com 50 mL de meio. Na etapa 3, o estudo de aeração e agitação foi realizado em fermentador Bioflo III (New Brunswick Sci. Co.) de 1,25 L. Com os resultados obtidos, concluiu-se que o tratamento realizado foi adequado para o emprego da glicerina residual como fonte de carbono para o crescimento da bactéria Klebsiella pneumoniae. Além disso, os trabalhos realizados em frascos revelaram uma produção máxima, em agitação de 200 rpm, de 0,545 g/L.h de 2,3-BD e produção de 0,180 g/L.h de 1,3-PD em agitação de 160 rpm. Sendo que a glicose e o extrato de levedura tiveram efeitos positivos e significativos na produtividade de 2,3-BD e 1,3-PD. Nos ensaios onde foram utilizados maiores transferência de oxigênio observou-se decréscimos na produção de 1,3-PD e uma melhora significativa na produção de 2,3-BD. No estudo de recuperação dos dióis, foi possível recuperar 82% dos dióis utilizando carbonato de potássio 70% na temperatura de 20 ºC e no tempo de reação de 6 horas. / Among the main concerns related to the production of biodiesel is the surplus of crude glycerine. This corresponds to approximately 10% of the total mass of the biodiesel production process and has been accumulated and stored in the biodiesel plants, creating enormous amounts of waste and serious environmental problems. A way to lessen this problem is to use it for the formulation of fermentation medium to obtain products of economic interest. Examples are the production of diols such as, 1,3-propanediol (1,3-PD) and 2,3-butanediol (2,3-BD). These monomers are large market application, and the 1,3-PD used for the manufacture of polyurethanes, cyclic compounds and new types of polyesters. The 2,3-BD is used as antifreeze, biofuel and as an important flavoring. Thus, in present work aims to enrich the residual glycerine from biodiesel production to its bioconversion in 2,3-BD and 1,3-PD by bacterium Klebsiella pneumoniae NRRL B199. Therefore, the purpose of this consisted of four joint steps: 1st. Establish an appropriate treatment for residual glycerine to allow bacterial growth and diols formation. 2nd. To adapt the composition of fermentation medium, as concentrations of residual glycerine, with glucose supplementation, yeast extract and trace elements of Fe2+, Zn2+ e Mn2+ in the fermentation process. 3rd. Define the best condition of oxygen transfer in a batch system, associated with substrate concentration for the best product formation. 4th. To evaluate the separation procedure of products through the of salting-out technique. Studies of step 1 and 2 were conducted in 250 mL Erlenmeyer flasks with 50 mL medium. In step 3, the study aeration and agitation was performed in Bioflo III fermentor (New Brunswick Sci Co.) was 1,25 L. With the results, it was concluded that the treatment was adequate for use of residual glycerine as carbon source for growth of the bacterium Klebsiella pneumoniae. Furthermore, the work carried out on bottles showed a maximum production 2,3-BD of 0.545 g/L.h in agitation of 200 rpm and production 1,3-PD of 0.180 g/Lh in agitation of 160 rpm. With glucose and yeast extract had positive and significant effects on productivity of 2,3-BD and 1,3-PD. For tests were used higher oxygen transfer observed decrease in the production of 1,3-PD and a significant improvement in the production of 2,3-BD. In the study of recovery of diols, it was possible to recover 82% of diols using 70% potassium carbonate at temperature of 20 °C and in reaction time of 6 hours.

O 1,3-propanodiol (PDO) é um composto químico com muitas aplicações industriais, como síntese de polímeros de tereftalatos, cosméticos e lubrificantes, dentre outros. Este composto pode ser produzido biotecnologicamente a partir do glicerol em condições de anaerobiose. Os principais produtores naturais de PDO são bactérias dos gêneros Klebsiella e Clostridium. No entanto, estes microrganismos podem apresentar riscos à saúde humana, sendo considerados oportunistas e, por isso, requerendo cuidados especiais que dificultam seu emprego em escala industrial. Uma alternativa está no uso de Lactobacillus sp., bactérias que realizam altas conversões de glicerol a PDO e não apresentam estes inconvenientes. Neste estudo, buscou-se melhorar a produtividade da transformação de glicerol em PDO por Lactobacillus reuteri, através de diferentes tipos de bioprocessos. Para isso, o microrganismo foi cultivado em meio MRS (com glicose) contendo glicerol como cosubstrato. Realizaram-se experimentos em batelada, batelada repetida e em processo contínuo (quimiostato) sob diferentes condições. Os melhores resultados foram obtidos nos processos em batelada repetida e em quimiostato. Nos ensaios em batelada repetida, a melhor condição foi nos cultivos em que houve decantação de células. Nesta condição, a produtividade (QPDO) superou em quase 3 vezes o ensaio em batelada comum (4,12 g.L-1.h-1). Em quimiostato, a produtividade alcançada sob a taxa de diluição de 0,5 h-1 foi 20% maior do que o melhor resultado em batelada repetida (4,88 g.L-1.h-1). Estes valores de produtividade são os maiores reportados na literatura até o momento. Além disso, os resultados indicam que o processo em quimiostato não é limitado pelo substrato, mas sim pela concentração de lactato produzido. / 1,3-propanediol (PDO) is a high-value chemical compound which has many industrial applications, such as synthesis of polymers of terephthalates, cosmetics and lubricants, among others. This compound can be produced biotechnologically from glycerol in anaerobiosis. The main natural producers of PDO are bacteria from genera Klebsiella and Clostridium. However, these microorganisms could be dangerous to human health, considered opportunistic and therefore require special care when manipulated on an industrial scale. An alternative is the use of Lactobacillus sp., bacteria which achieve high conversions of glycerol to PDO and do not present these problems. In this study, we aimed to improve the yield of PDO by Lactobacillus reuteri through different types of bioprocesses. For this, the microorganism was grown in MRS medium (with glucose) containing glycerol as co-substrate. Experiments were performed in batch run, repeated batch and continuous mode (chemostat) under different conditions. The best results were found in repeated batch run and chemostat mode. In repeated batch runs, the best condition was found in cultures with settling of cells. In this condition, the productivity (QPDO) reached almost 3 times the value of the simple batch run (4.12 g.L-1.h-1). In chemostat mode, the productivity reached, in the dilution rate of 0.5 h-1, was 20% higher than the best result obtained in repeated batch mode (4.88 g.L-1.h-1). These productivity values are the highest reported in the literature until this date. Furthermore, the results indicate that the chemostat process is not limited by the substrate, but by the concentration of produced lactate.

Dentre as principais preocupações relacionadas à cadeia de produção do biodiesel está o excedente de glicerina bruta. Esta corresponde a cerca de 10% da massa total resultante do processo de produção do biodiesel e vem sendo acumulada e armazenada nas usinas, formando grandes estoques de resíduos e deixando diversas empresas diante de um passivo ambiental agravante. Uma forma de diminuir esse problema é utilizá-la para formulação de meios de fermentação para obtenção de produtos de interesse econômico. Exemplos são as produções de dióis como; 1,3-Propanodiol (1,3-PD) e 2,3-Butanodiol (2,3-BD). Estes são monômeros de grande aplicação no mercado, sendo o 1,3-PD usado para fabricação de poliuretanos, compostos cíclicos e novos tipos de poliésteres. O 2,3-BD é utilizado como anticongelante, biocombustível e como um importante aromatizante. Assim, no presente trabalho propõe-se valorizar a glicerina residual da fabricação de biodiesel, visando sua bioconversão em 2,3-BD e 1,3-PD, pela bactéria Klebsiella pneumoniae NRRL B199. Para tanto, a proposta deste trabalho compreendeu quatro etapas conjuntas: 1. Estabelecer um tratamento adequado para a glicerina residual de forma a permitir o crescimento bacteriano e formação dos dióis. 2. Adequar à composição do meio de fermentação, quanto às concentrações de glicerol, com suplementação de glicose, extrato de levedura e elementos traço Fe2+, Zn2+ e Mn2+ no processo fermentativo. 3. Definir a melhor condição de transferência de oxigênio em sistema descontínuo, associada à concentração de substrato, para a melhor formação de produtos. 4. Avaliar o procedimento de separação dos produtos do meio pela técnica de salting-out. Os estudos da etapa 1 e 2 foram realizados em frascos Erlenmeyer de 250 mL com 50 mL de meio. Na etapa 3, o estudo de aeração e agitação foi realizado em fermentador Bioflo III (New Brunswick Sci. Co.) de 1,25 L. Com os resultados obtidos, concluiu-se que o tratamento realizado foi adequado para o emprego da glicerina residual como fonte de carbono para o crescimento da bactéria Klebsiella pneumoniae. Além disso, os trabalhos realizados em frascos revelaram uma produção máxima, em agitação de 200 rpm, de 0,545 g/L.h de 2,3-BD e produção de 0,180 g/L.h de 1,3-PD em agitação de 160 rpm. Sendo que a glicose e o extrato de levedura tiveram efeitos positivos e significativos na produtividade de 2,3-BD e 1,3-PD. Nos ensaios onde foram utilizados maiores transferência de oxigênio observou-se decréscimos na produção de 1,3-PD e uma melhora significativa na produção de 2,3-BD. No estudo de recuperação dos dióis, foi possível recuperar 82% dos dióis utilizando carbonato de potássio 70% na temperatura de 20 ºC e no tempo de reação de 6 horas. / Among the main concerns related to the production of biodiesel is the surplus of crude glycerine. This corresponds to approximately 10% of the total mass of the biodiesel production process and has been accumulated and stored in the biodiesel plants, creating enormous amounts of waste and serious environmental problems. A way to lessen this problem is to use it for the formulation of fermentation medium to obtain products of economic interest. Examples are the production of diols such as, 1,3-propanediol (1,3-PD) and 2,3-butanediol (2,3-BD). These monomers are large market application, and the 1,3-PD used for the manufacture of polyurethanes, cyclic compounds and new types of polyesters. The 2,3-BD is used as antifreeze, biofuel and as an important flavoring. Thus, in present work aims to enrich the residual glycerine from biodiesel production to its bioconversion in 2,3-BD and 1,3-PD by bacterium Klebsiella pneumoniae NRRL B199. Therefore, the purpose of this consisted of four joint steps: 1st. Establish an appropriate treatment for residual glycerine to allow bacterial growth and diols formation. 2nd. To adapt the composition of fermentation medium, as concentrations of residual glycerine, with glucose supplementation, yeast extract and trace elements of Fe2+, Zn2+ e Mn2+ in the fermentation process. 3rd. Define the best condition of oxygen transfer in a batch system, associated with substrate concentration for the best product formation. 4th. To evaluate the separation procedure of products through the of salting-out technique. Studies of step 1 and 2 were conducted in 250 mL Erlenmeyer flasks with 50 mL medium. In step 3, the study aeration and agitation was performed in Bioflo III fermentor (New Brunswick Sci Co.) was 1,25 L. With the results, it was concluded that the treatment was adequate for use of residual glycerine as carbon source for growth of the bacterium Klebsiella pneumoniae. Furthermore, the work carried out on bottles showed a maximum production 2,3-BD of 0.545 g/L.h in agitation of 200 rpm and production 1,3-PD of 0.180 g/Lh in agitation of 160 rpm. With glucose and yeast extract had positive and significant effects on productivity of 2,3-BD and 1,3-PD. For tests were used higher oxygen transfer observed decrease in the production of 1,3-PD and a significant improvement in the production of 2,3-BD. In the study of recovery of diols, it was possible to recover 82% of diols using 70% potassium carbonate at temperature of 20 °C and in reaction time of 6 hours.

Sustainability and green engineering are two main concepts considered throughout this study. Sustainability deals with the utilization of renewable and replaceable sugar-based twelve most promising building blocks included in the report prepared by U.S. Department of Energy and green engineering concept is related with the incorporation of environmental performance criteria to chemical process design. Process performance criteria at the conceptual design stage are selected as persistence, bioaccumulation and aquatic toxicity, economical potential of the processes, atom &amp / mass efficiency of the processes and the relationship between Gibbs free energy of reaction values and economical potential. It is observed that bioaccumulation potentials of both the raw materials and products are low. Petrochemical raw materials are more persistent in air than the bio-based ones. The aquatic toxicity of bio-based raw materials is low / whereas some of the petrochemicals are moderately toxic and allyl alcohol and acrylonitrile among the petrochemicals are classified as highly toxic. Bio -based routes are not economically feasible with 2002 market prices. Atom and mass efficiencies of petrochemical reactions for a group of chemicals are higher than bio-based ones due to mostly addition or substitution reactions. Among high number of products, 1,3 propanediol production from glycerol with two microorganisms is analyzed at preliminary design stage. Process performance criteria are selected as material and energy consumption, cooling water requirement, CO, CO2, SO2 and NOX emissions to the atmosphere per unit of 1,3 propanediol production. Klebsiella pneumoniae process requires less cooling water, but it is less energy efficient and causes higher emissions.

O glicerol é gerado em grandes quantidades durante a produção de biodiesel e tem se tornado um substrato potencialmente atrativo para a produção bacteriana de produtos de valor agregado, tais como 1,3-Propanodiol (1,3-PD), etanol, hidrogênio e outros. O presente trabalho teve como objetivo a produção de hidrogênio, 1,3-PD e etanol utilizando glicerol residual obtido da síntese do biodiesel. A primeira parte do trabalho visou à produção de hidrogênio utilizando glicerol residual. Nesta etapa, o consórcio microbiano ambiental foi submetido a diferentes tratamentos (ácido, básico, choque térmico, congelamento e descongelamento e dessecação). Os resultados mostraram que a maior produção de hidrogênio ocorreu com o consórcio tratado com dessecação e choque térmico, com produções de 34,2 % mol e 27,3 % mol, respectivamente. A otimização da produção de hidrogênio foi realizada utilizando planejamento experimental e alcançou uma produção máxima de 45 % mol. A próxima etapa do projeto foi isolar as bactérias presentes no consórcio microbiano ambiental. Experimentos em biorreatores foram realizados utilizando glicerol puro e glicerol residual e os resultados mostraram que houve a completa degradação do glicerol pelas bactérias do consórcio e também a produção de 1,3-PD, hidrogênio e ácidos. Nesta etapa, 32 bactérias foram isoladas e testadas para a produção de bioprodutos em experimentos em aerobiose e anaerobiose. Quatro bactérias foram selecionadas e o seqüenciamento do gene foi identificado por 16S rRNA identificou três dos isolados como Klebsiella pneumoniae e um isolado como Pantoea agglomerans. Dentre as quatro bactérias, uma cepa, nomeada como K. pneumoniae BLh-1, foi selecionada para os trabalhos posteriores. Para otimização das condições de cultivo, utilizou-se a seleção de variáveis através do delineamento experimental Plackett Burman (P-B) avaliando a produção de 1,3-PD. Sete variáveis foram estatisticamente significativas e um novo planejamento fracionário 27-3 foi realizado com a finalidade de otimizar o meio de produção. Experimentos em biorreatores mostraram que a produção em bioreator com pH controlado com o meio otimizado no planejamento alcançou uma produção máxima de 23,80 g/L de 1,3-PD com produção de 12,30 g/L de etanol. Os ensaios com alimentação de glicerol residual mostraram que altas taxas de alimentação causam acúmulo de glicerol e diminuem a produtividade de 1,3-PD e etanol. Os estudos utilizando fluorescência 2D e modelo quimiométrico foram aplicados para avaliar as mudanças metabólicas nos cultivos aeróbios e anaeróbios. Os resultados mostraram que houve diferença nas regiões de NADH e riboflavinas ambas associadas ao metabolismo do microorganismo. / Glycerol is generated in large amounts during biodiesel production and it is becoming a potentially attractive substrate for bacterial production for value-added products such as 1,3-propanediol (1,3-PD), ethanol, hydrogen, among others. This work aimed at studying the production of hydrogen, 1,3-PD and ethanol using the raw glycerol obtained by biodiesel synthesis. The first steps were to produce hydrogen using raw glycerol. At this step, the environmental microbial consortium was submitted to different pretreatments (acid, base, heat shock, dry heat and desiccation, freezing and thawing). The results showed that dry heat and desiccation had the higher hydrogen production followed by heat shock with production of 34.2 % mol and 27.3 % mol, respectively.The optimization of hydrogen production was performed using experimental design and had a maximum hydrogen production of 45 % mol. The next spet of this project was to isolate the bacteria present in an environmental microbial consortium. Experiments in bioreactors with the microbial consortium using raw and pure glycerol were carried out and the results showed that there was a complete glycerol degradation by microbial bacteria with productions of 1,3-PD, hydrogen and acids. In this step, 32 bacteria were isolated and tested separately for by-products production under aerobic and anaerobic conditions. Four bacteria were selected and sequence gene realized by 16 S rRNA, three of them were identified as Klebsiella pneumoniae and one isolate identified as Pantoea agglomerans. Among the four bacteria, the strain K. pneumoniae BLh-1 were selected for further experiments. Plackett Burman (P-B) experimental procedure was used for assessing the production of 1,3-PD. Seven variables were statistically significant and a new 27-3 fractional design was conducted with the aim of optimizing culture conditions. Bioreactors experiments using the optimized culture conditions showed that production in bioreactor with controlled pH reached a maximal 1,3-PD production of 23.80 g/L with 12.30 g/L of ethanol. The fed-batch experiments showed that high feeding rates caused glycerol to accumulated in the medium and the1,3-PD and ethanol productivity decreased. The 2D fluorescence metodology was applied in order to study the anaerobic-aerobic changes on K. pneumoniae metabolism. The results showed a significant difference on NADH and riboflavin fluorescence that are fluorescence regions associated to metabolism.

O glicerol é gerado em grandes quantidades durante a produção de biodiesel e tem se tornado um substrato potencialmente atrativo para a produção bacteriana de produtos de valor agregado, tais como 1,3-Propanodiol (1,3-PD), etanol, hidrogênio e outros. O presente trabalho teve como objetivo a produção de hidrogênio, 1,3-PD e etanol utilizando glicerol residual obtido da síntese do biodiesel. A primeira parte do trabalho visou à produção de hidrogênio utilizando glicerol residual. Nesta etapa, o consórcio microbiano ambiental foi submetido a diferentes tratamentos (ácido, básico, choque térmico, congelamento e descongelamento e dessecação). Os resultados mostraram que a maior produção de hidrogênio ocorreu com o consórcio tratado com dessecação e choque térmico, com produções de 34,2 % mol e 27,3 % mol, respectivamente. A otimização da produção de hidrogênio foi realizada utilizando planejamento experimental e alcançou uma produção máxima de 45 % mol. A próxima etapa do projeto foi isolar as bactérias presentes no consórcio microbiano ambiental. Experimentos em biorreatores foram realizados utilizando glicerol puro e glicerol residual e os resultados mostraram que houve a completa degradação do glicerol pelas bactérias do consórcio e também a produção de 1,3-PD, hidrogênio e ácidos. Nesta etapa, 32 bactérias foram isoladas e testadas para a produção de bioprodutos em experimentos em aerobiose e anaerobiose. Quatro bactérias foram selecionadas e o seqüenciamento do gene foi identificado por 16S rRNA identificou três dos isolados como Klebsiella pneumoniae e um isolado como Pantoea agglomerans. Dentre as quatro bactérias, uma cepa, nomeada como K. pneumoniae BLh-1, foi selecionada para os trabalhos posteriores. Para otimização das condições de cultivo, utilizou-se a seleção de variáveis através do delineamento experimental Plackett Burman (P-B) avaliando a produção de 1,3-PD. Sete variáveis foram estatisticamente significativas e um novo planejamento fracionário 27-3 foi realizado com a finalidade de otimizar o meio de produção. Experimentos em biorreatores mostraram que a produção em bioreator com pH controlado com o meio otimizado no planejamento alcançou uma produção máxima de 23,80 g/L de 1,3-PD com produção de 12,30 g/L de etanol. Os ensaios com alimentação de glicerol residual mostraram que altas taxas de alimentação causam acúmulo de glicerol e diminuem a produtividade de 1,3-PD e etanol. Os estudos utilizando fluorescência 2D e modelo quimiométrico foram aplicados para avaliar as mudanças metabólicas nos cultivos aeróbios e anaeróbios. Os resultados mostraram que houve diferença nas regiões de NADH e riboflavinas ambas associadas ao metabolismo do microorganismo. / Glycerol is generated in large amounts during biodiesel production and it is becoming a potentially attractive substrate for bacterial production for value-added products such as 1,3-propanediol (1,3-PD), ethanol, hydrogen, among others. This work aimed at studying the production of hydrogen, 1,3-PD and ethanol using the raw glycerol obtained by biodiesel synthesis. The first steps were to produce hydrogen using raw glycerol. At this step, the environmental microbial consortium was submitted to different pretreatments (acid, base, heat shock, dry heat and desiccation, freezing and thawing). The results showed that dry heat and desiccation had the higher hydrogen production followed by heat shock with production of 34.2 % mol and 27.3 % mol, respectively.The optimization of hydrogen production was performed using experimental design and had a maximum hydrogen production of 45 % mol. The next spet of this project was to isolate the bacteria present in an environmental microbial consortium. Experiments in bioreactors with the microbial consortium using raw and pure glycerol were carried out and the results showed that there was a complete glycerol degradation by microbial bacteria with productions of 1,3-PD, hydrogen and acids. In this step, 32 bacteria were isolated and tested separately for by-products production under aerobic and anaerobic conditions. Four bacteria were selected and sequence gene realized by 16 S rRNA, three of them were identified as Klebsiella pneumoniae and one isolate identified as Pantoea agglomerans. Among the four bacteria, the strain K. pneumoniae BLh-1 were selected for further experiments. Plackett Burman (P-B) experimental procedure was used for assessing the production of 1,3-PD. Seven variables were statistically significant and a new 27-3 fractional design was conducted with the aim of optimizing culture conditions. Bioreactors experiments using the optimized culture conditions showed that production in bioreactor with controlled pH reached a maximal 1,3-PD production of 23.80 g/L with 12.30 g/L of ethanol. The fed-batch experiments showed that high feeding rates caused glycerol to accumulated in the medium and the1,3-PD and ethanol productivity decreased. The 2D fluorescence metodology was applied in order to study the anaerobic-aerobic changes on K. pneumoniae metabolism. The results showed a significant difference on NADH and riboflavin fluorescence that are fluorescence regions associated to metabolism.