Au cours de ce travail, nous nous sommes attachés à étudier certaines réponses cellulaires secondaires à l’activation des récepteurs purinergiques P2X dans deux modèles différents, les macrophages péritonéaux et les cellules des glandes sous-maxillaires. Ces cellules contribuent à notre immunité innée, soit tournée vers l’intérieur (macrophages), soit vers l’extérieur (glandes sous-maxillaires). Nous avons dans un premier temps confirmé par Western blot et par des dosages de la concentration intracellulaire de calcium ([Ca2+]i) que les deux types de cellules étudiés expriment des récepteurs P2X4 et P2X7 fonctionnels. Nous nous sommes alors concentrés sur deux réponses impliquées dans la protection de l’hôte contre les agressions et l’élimination de pathogènes : la production d’espèces réactives de l’oxygène (ROS) ainsi que la sécrétion de la cytokine pro-inflammatoire interleukine-1beta (IL-1beta). Nos résultats montrent que la production de ROS en réponse à l’ATP extracellulaire est secondaire à l’activation d’une NADPH oxydase dans les deux types de cellules. Cette réponse est médiée par les récepteurs P2X7 ainsi que, dans les macrophages, par d’autres récepteurs purinergiques comme par exemple les récepteurs P2X4 et des récepteurs P2Y. Dans les glandes exocrines, contrairement aux macrophages, la protéine kinase C ainsi que ERK1/2 interviennent dans l’activation de la NADPH oxydase. Par la suite nous avons comparé la régulation de l’expression et de la sécrétion d’IL-1beta par les macrophages et les glandes sous-maxillaires. Nous avons observé que l’IL-1beta est présente dans la salive collectée chez des souris injectées par de la pilocarpine. Des analyses par ELISA, RT-PCR et Western blot montrent que la cytokine est exprimée de manière constitutive par les cellules acineuses et ductales des glandes sous-maxillaires, à un niveau plus élevé que dans les macrophages. Contrairement aux cellules phagocytaires, l’expression de la cytokine dans les cellules des glandes salivaires n’est pas augmentée suite à la stimulation par des lipopolysaccharides. De même, dans ces cellules l’ATP n’a pas provoqué la sécrétion d’IL-1beta malgré l’efflux de K+ secondaire à l’activation des récepteurs P2X7. Dans une dernière série d’expériences nous avons évalué les effets du peptide antimicrobien CRAMP sur les macrophages murins. Le CRAMP a inhibé toutes les réponses secondaires à l’activation des récepteurs P2X7 (ouverture du canal cationique, formation de pore, production de ROS, libération d’IL-1beta, d’acide oléique et de lactate déshydrogénase). L’inhibition par le CRAMP de l’augmentation de la [Ca2+]i en réponse à l’ATP n’était pas médiée par les récepteurs aux peptides formylés car les agonistes de ces récepteurs n’ont pas bloqué cette augmentation. Le CRAMP n’a pas eu d’effet sur l’augmentation de la [Ca2+]i secondaire à l’activation des récepteurs P2X4 par une combinaison d’ATP et d’ivermectine. Nos expériences ont révélé que les récepteurs P2X7 sont couplés à diverses voies de signalisation dans les macrophages et dans les glandes exocrines. Les voies activées diffèrent en fonction du type de cellules. Nous avons également conclu que les peptides antimicrobiens de la famille de cathélicidines ne sont pas des agonistes universels des récepteurs P2X7.

This thesis was focused on the pro-inflammatory cytokines IL-1beta and IFN-gamma. Absolute and differential leukocyte count was also monitored. The experiment was conducted at 8 clinically healthy heifers, hybrids of Holstein and Czech Pied that have been housed by tethering in stalls and fed with a standard diet. The inflammatory reaction was induced by lipopolysaccharide (LPS; 5 ug in 20 ml PBS), as a control a phosphate buff-ered saline (PBS) was used. Results were measured at 1, 2, 3 and 7 days after stimulation of mammary gland by above-mentioned factors. Concentration of each cytokine was detected by a sandwich ELISA using commercially available kits. At 1 day after stimulation of mammary gland by LPS and PBS an average number of leukocytes, which was statistically significantly higher in the case of stimulation by LPS (P <0.01), was detected. After 7 days there was a significant decrease in the total number of leukocytes. There has also been a shift in the differential leukocyte count. Most abundant cell type were neutrophils, whose number was higher in the case of stimulation by LPS. Between day 1 and day 7 after challenge, there was a gradual reduction in the proportion of neutrophils. In the same period an increase in the proportion of macrophages and lymphocytes was detected. Concentration of IL-1beta also increased, 1 day after the activation a striking increase has been detected. In following days there was gradual decline of IL-1beta concentration almost to the level prior to treatment of the mammary gland. In the case of IFN-gamma similar pattern in the form of strong growth and a subsequent gradual decline in concentration to the original values was detected. There was found positive correlation between the increase in IL-1beta and IFN-gamma concentration and a shift in the differential leukocyte count in favor of neutrophils, which confirmed the important role of these pro-inflammatory cytokines in the establishment of inflammatory response and the mobilization of the components of natural and specific immunity.

Made available in DSpace on 2015-07-22T20:50:05Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2011-01-26 / A privacao de sono (PS) e um modelo bem estabelecido para verificar os efeitos prejudiciais da vigilia prolongada e para o estudo das funcoes do sono. Durante este tipo de manipulacao, algumas alteracoes fisiologicas sao observadas, sendo notoria a reducao da capacidade em manter o padrao termorregulatorio, marcada por uma elevacao da temperatura corporea logo nas primeiras 24 horas de PS, que se mantem por pelo menos 96 horas de protocolo de PS. Sabe-se tambem que a PS induz aumento na producao de citocinas, como a Interleucina-1 (IL-1), um pirogeno classico, que medeia o comportamento doentio observado em animais submetidos ao desafio imunologico com lipopolissacarideo (LPS). Ratos submetidos a PS e ratos submetidos a administracao de LPS, apresentam aumento de citocinas e aumento de temperatura. A fim de investigar a participacao da IL-1 no aumento de temperatura induzido pela PS e comparar a magnitude e natureza dessa hipertermia com aquela produzida por LPS, administramos 2 ƒÊg/Kg de anticorpo anti-1 via intraperitoneal (i.p.) em ratos PS pelo metodo das plataformas multiplas modificado ao longo de 96 horas e em ratos tratados com 100 ƒÊg/Kg de LPS (i.p.). O presente estudo fornece evidencias de que a IL-1 nao desempenha papel primordial na hipertermia induzida pela privacao de sono, ao contrario da febre induzida por LPS, que tem participacao notavel da IL-1. Tal fato sugere o envolvimento de outros mecanismos e mediadores, bem como a sinergia entre estes na hipertermia induzida pela PS. Tambem identificamos que o aumento de temperatura e verificado dentro da 2a hora de PS, enquanto que o aumento de temperatura induzida por LPS e observado 4 horas apos sua administracao, sugerindo diferenca na ativacao temporal ou mesmo a existencia de mecanismos distintos para o disparo de ambos. Sabe-se que existe um alto custo metabolico associado ao aumento da temperatura corporea e sua manutencao, por isso aventa-se que a elevacao de temperatura verificada na PS nao seja apenas um efeito do estresse, mas um fenômeno determinado por outros fatores, ainda desconhecidos e que precisam ser melhor investigados. / TEDE / BV UNIFESP: Teses e dissertações

京都大学 / 0048 / 新制・課程博士 / 博士(農学) / 甲第21135号 / 農博第2261号 / 新制||農||1057(附属図書館) / 学位論文||H30||N5109(農学部図書室) / 京都大学大学院農学研究科応用生物科学専攻 / (主査)教授 松井 徹, 教授 久米 新一, 教授 廣岡 博之 / 学位規則第4条第1項該当 / Doctor of Agricultural Science / Kyoto University / DGAM

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Le mécanisme biologique responsable pour l’augmentation de l’expression de la protéine nestin dans les cellules souches neurales (CSN) du cœur après un infarctus du myocarde (IM) demeure inconnu. Des études antérieures ont démontré que le traitement au dexamethasone, un glucocorticoïde aux propriétés anti-inflammatoires, abolit la régulation positive de nestin après un IM. Ceci suggère un lien avec la réponse inflammatoire. Nous avons vérifié dans cette étude l’hypothèse que la cytokine inflammatoire interleukin-1beta (IL-1beta) peut modifier le phénotype de cellules souches neurales. Le deuxième objectif de l’étude fut d’établir l’impact, suivant un IM, de l’inhibition de la signalisation de IL-1beta sur la fonction et la guérison cardiaque. Suite à une ligature complète de l’artère coronaire du rat mâle, le dysfonctionnement contractile du ventricule gauche fut associé à une régulation positive de la protéine nestin dans le myocarde non-infarci. Le traitement avec Xoma 052 (1 mg/kg), un anticorps anti-IL-1beta, 24h, 7 et 14 jours après un évènement ischémique, eu aucun effet sur la taille de l’infarctus ou la contractilité du ventricule gauche. De plus, le traitement avec Xoma 052 après un IM n’a pu supprimer l’augmentation de l’expression de nestin et Bcl-2 malgré une réduction modeste du niveau de la protéine Bax. Pour déterminer directement le rôle de la réponse inflammatoire en l’absence d’ischémie, nous avons injecté des rats mâles avec du LPS (10mg/kg, 18hrs). Dans le coeur du rat-LPS, nous avons noté une augmentation significative du niveau d’ARNm de IL-1beta et de l’expression de la protéine nestin. Le prétraitement avec 10mg/kg de Xoma 052 a aboli l’augmentation de l’expression de nestin dans le coeur des rats-LPS. Ces observations indiquent que les cellules souches neurales pourraient représenter une cible potentielle de l’IL-1beta. / The underlying biological event(s) implicated in the increased expression of nestin in cardiac resident neural stem cells (NSC) following myocardial infarction (MI) remain unknown. Past studies have shown that dexamethasone treatment, a synthetic glucocorticoid with potent anti-inflammatory properties, abolished the upregulation of nestin in the non-infacted left ventricle (NILV) following MI. This suggests an association with the inflammatory response. The present study tested the hypothesis that the inflammatory cytokine interleukin-1beta (IL-1beta) can influence the neural stem cell phenotype. A secondary goal of the study was to assess impact of IL-1beta signalling inhibition on cardiac function and wound healing following MI. Following complete coronary artery ligation of the adult male rat heart, left ventricular contractile dysfunction was associated with the upregulation of the pro-apoptotic protein bax, the anti-apoptotic protein Bcl-2 and nestin in the non-infarcted myocardium. Xoma 052 (1 mg/kg), an IgG antibody directed against IL-1beta, was administred 24 hrs after ischemic injury and subsequently injected 2x over a period of 21 days. Treatment did not alter infarct size or improve left ventricular contractility. In addition, it failed to abolish the increased expression of nestin and Bcl-2, and modestly reduced bax protein levels. To directly assess the relationship between inflammation and the expression of nestin in the absence of an ischemic insult, adult male rats were injected with lipopolysaccharide (LPS) (10mg/kg;18 hrs). In the heart of LPS- treated rats, IL-1beta mRNA levels were significantly increased and associated with elevated nestin protein expression. The pre-treatment with Xoma 052 (10mg/kg) abolished the increased expression of nestin in the heart of LPS-treated rats. These data indicate that neural stem cells may represent a target for IL-1beta. However, futher investigation is required to elucidate the role of IL-1beta on NSC following MI.

Objetivo: determinar as concentrações séricas e peritoneais das interleucinas 1ß (IL-1ß) e 6 (IL-6) e da proteína amilóide A (SAA) em pacientes com endometriose pélvica. Métodos: foram avaliadas 97 pacientes submetidas à videolaparoscopia, 57 com endometriose (A), 27 com sintomas sugestivos porém sem endometriose (B) e 13 sem sintomas e doenças (C). Foram coletados no ato cirúrgico líquido peritoneal e sangue. As concentrações dos mediadores foram determinadas em pg/ml (IL-1 e 6) e ng/ml (SAA) por método imunoenzimático e leitura óptica. Resultados: (líquido peritoneal e sangue medianas) IL-1ß: A- 11,22 and 1,83; B- 15,62 and 1,16; C- 1,92 and 0,80; IL-6: A- 6,80 and 3,70; B- 8,60 and 3,90; C- 3,40 and 2,0; SAA- A- 310,30 and 14,01; B- 306,20 and 10,39; C- 53,4 e 9,5. Conclusão: as concentrações dos mediadores de inflamação avaliados estão elevadas no líquido peritoneal e no soro das mulheres com endometriose. Estas concentrações foram semelhantes às das pacientes com sintomas sugestivos porém sem a doença. A fase do ciclo menstrual, o tipo histológico envolvido e o local de acometimento da doença não influíram de forma significante nas concentrações séricas ou peritoneais de IL-1ß, IL-6 e SAA. / Objective: to assess peritoneal and seric interleukin-1ß (IL-1ß), 6 (IL-6), and protein amyloid A (SAA) concentrations in patients with pelvic endometriosis. Methods: 97 patients were submitted to video laparoscopic surgery, 57 with endometriosis (A), 27 with suggestive symptoms but no endometriosis (B), and 13 without symptoms and diseases (C). Peritoneal fluid and blood were collected during the procedure. Mediator s concentration was determined in pg/ml (IL-1ß and IL-6) and ng/ml (SAA) through immunoenzimatic test and optic measure. Results: (peritoneal fluid and blood -medians) IL-1ß: A- 11,22 and 1,83; B- 15,62 and 1,16; C- 1,92 and 0,80; IL-6: A- 6,80 and 3,70; B- 8,60 and 3,90; C- 3,40 and 2,0; SAA- A- 310,30 and 14,01; B- 306,20 and 10,39; C- 53,4 e 9,5. Conclusion: the inflammation mediators are increased in the peritoneal fluid and blood of women with pelvic endometriosis. The concentrations are similar to those found in patients with suggestive symptoms but no endometriosis. The place of the disease, the histological type and the day of the menstrual cycle didn t alter peritoneal or seric concentration of these cytokines.

Objetivo: determinar as concentrações séricas e peritoneais das interleucinas 1ß (IL-1ß) e 6 (IL-6) e da proteína amilóide A (SAA) em pacientes com endometriose pélvica. Métodos: foram avaliadas 97 pacientes submetidas à videolaparoscopia, 57 com endometriose (A), 27 com sintomas sugestivos porém sem endometriose (B) e 13 sem sintomas e doenças (C). Foram coletados no ato cirúrgico líquido peritoneal e sangue. As concentrações dos mediadores foram determinadas em pg/ml (IL-1 e 6) e ng/ml (SAA) por método imunoenzimático e leitura óptica. Resultados: (líquido peritoneal e sangue medianas) IL-1ß: A- 11,22 and 1,83; B- 15,62 and 1,16; C- 1,92 and 0,80; IL-6: A- 6,80 and 3,70; B- 8,60 and 3,90; C- 3,40 and 2,0; SAA- A- 310,30 and 14,01; B- 306,20 and 10,39; C- 53,4 e 9,5. Conclusão: as concentrações dos mediadores de inflamação avaliados estão elevadas no líquido peritoneal e no soro das mulheres com endometriose. Estas concentrações foram semelhantes às das pacientes com sintomas sugestivos porém sem a doença. A fase do ciclo menstrual, o tipo histológico envolvido e o local de acometimento da doença não influíram de forma significante nas concentrações séricas ou peritoneais de IL-1ß, IL-6 e SAA. / Objective: to assess peritoneal and seric interleukin-1ß (IL-1ß), 6 (IL-6), and protein amyloid A (SAA) concentrations in patients with pelvic endometriosis. Methods: 97 patients were submitted to video laparoscopic surgery, 57 with endometriosis (A), 27 with suggestive symptoms but no endometriosis (B), and 13 without symptoms and diseases (C). Peritoneal fluid and blood were collected during the procedure. Mediator s concentration was determined in pg/ml (IL-1ß and IL-6) and ng/ml (SAA) through immunoenzimatic test and optic measure. Results: (peritoneal fluid and blood -medians) IL-1ß: A- 11,22 and 1,83; B- 15,62 and 1,16; C- 1,92 and 0,80; IL-6: A- 6,80 and 3,70; B- 8,60 and 3,90; C- 3,40 and 2,0; SAA- A- 310,30 and 14,01; B- 306,20 and 10,39; C- 53,4 e 9,5. Conclusion: the inflammation mediators are increased in the peritoneal fluid and blood of women with pelvic endometriosis. The concentrations are similar to those found in patients with suggestive symptoms but no endometriosis. The place of the disease, the histological type and the day of the menstrual cycle didn t alter peritoneal or seric concentration of these cytokines.

Dans cette étude, l'aptitude de trois extraits de Gui fermentés (VAF) issus de trois arbres hôtes, à induire ou moduler la sécrétion de cytokines, telles que l'IL-1β, l'IL-6 et le TNF-α, a été explorée à l'aide de deux modèles de macrophages murins. Des traitements prolongés par des concentrations cytotoxiques, mais non sub-cytotoxiques, de VAFs induisent la sécrétion d'IL-1β. Dans ces conditions, les concentrations sub-cytotoxiques de VAFs amplifient les sécrétions d'IL-1β induite après stimulations par le LPS puis l'ATP, ou par l'imiquimod. Par ailleurs, appliqués brièvement et à concentrations sub-cytotoxiques, les VAFs accélèrent la sécrétion d'IL-1β induite après stimulations par le LPS puis l'ATP. / In this study, the ability of fermented extracts from mistletoe grown on three host trees to induce or modulate the secretion of pro-inflammatory cytokines, like IL-1β, IL-6 and TNF-α has been explored. Applied for long times, cytotoxic, but not sub-cytotoxic concentrations of fermented mistletoe extracts induce the secretion of IL-1β. In these conditions sub-cytotoxic concentrations increase the IL-1β secretions induced either by LPS and ATP, or by imiquimod. When applied briefy at sub-cytotoxic concentrations, fermented mistletoe extracts can accelerate the secretion of IL-1β induced by LPS and ATP.

Dans cette étude, l'aptitude de trois extraits de Gui fermentés (VAF) issus de trois arbres hôtes, à induire ou moduler la sécrétion de cytokines, telles que l'IL-1β, l'IL-6 et le TNF-α, a été explorée à l'aide de deux modèles de macrophages murins. Des traitements prolongés par des concentrations cytotoxiques, mais non sub-cytotoxiques, de VAFs induisent la sécrétion d'IL-1β. Dans ces conditions, les concentrations sub-cytotoxiques de VAFs amplifient les sécrétions d'IL-1β induite après stimulations par le LPS puis l'ATP, ou par l'imiquimod. Par ailleurs, appliqués brièvement et à concentrations sub-cytotoxiques, les VAFs accélèrent la sécrétion d'IL-1β induite après stimulations par le LPS puis l'ATP. / In this study, the ability of fermented extracts from mistletoe grown on three host trees to induce or modulate the secretion of pro-inflammatory cytokines, like IL-1β, IL-6 and TNF-α has been explored. Applied for long times, cytotoxic, but not sub-cytotoxic concentrations of fermented mistletoe extracts induce the secretion of IL-1β. In these conditions sub-cytotoxic concentrations increase the IL-1β secretions induced either by LPS and ATP, or by imiquimod. When applied briefy at sub-cytotoxic concentrations, fermented mistletoe extracts can accelerate the secretion of IL-1β induced by LPS and ATP.