Die Schwangerschaft ist ein komplexes Phänomen, bei dem es zu einer Interaktion zwischen dem mütterlichen Immunsystem und dem Fetus kommt. An der feto-maternalen Grenze kommt es zur Auslösung einer inflammatorischen Reaktion, die für eine normale Implantation und Schwangerschaft notwendig ist. Allerdings kann eine exzessive Entzündungsreaktion zu Schwangerschaftskomplikationen wie dem immunologisch vermittelten Sponatanabort füh-ren. Das zytoprotektive Enzym Hämoxygenase-1 (HO-1) spielt eine sehr wichtige Rolle bei der Kontrolle inflammatorischer Reaktionen. Inwiefern HO-1 für das Gelingen und Bestehen einer Schwangerschaft unabdingbar ist, wurde bisher nicht untersucht. Unsere Hypothese ist, dass HO-1 eine bedeutsame Rolle während der Schwangerschaft spielt. Die Beantwortung dieser wichtigen Frage ist deshalb Hauptziel dieser Dissertation. Es konnte gezeigt werden, dass eine spezifische Hochregulation des HO-1 Moleküls mittels Gentherapie in einem Mausmodell für Spontanabort zur signifikanten Reduktion der Abortra-te führte. Dieser protektive Effekt war mit einer erhöhten Th2/Th1 Zytokinen-Ratio und mit verminderter Apoptose assoziiert. Ein weiteres Teilziel dieser Arbeit bestand darin, die Rolle des HO-1 Moleküls während der Plazentation zu untersuchen. Dafür wurde eine Trophoblastenstammzelllinie benutzt, die in der Lage ist, zu Riesenzellen zu differenzieren. Die mittels Zinkprotoporphyrin (ZnPPIX) induzierte Expressionssuppression von HO-1 führte zur Verminderung der Überlebensrate von Trophoblastenstammzellen und zur Hemmung von deren Ausdifferenzierung in Trophoblastenriesenzellen. Um die Rolle des HO-1 Moleküls in anderen Schwangerschaftsprozessen zu untersuchen, wurden Hämoxygenase-1 defiziente (Hmox1-/-) Mäuse benutzt. Da die Verpaarung von Hmox1-/- Mäuse zu keinem erfolgreichen Abkömmling führt, war ein weiteres Teilziel dieser Arbeit gewesen, den zu Grunde liegenden Mechanismus aufzuklären. Es zeigte sich, dass Hmox1-/- Weibchen im Vergleich zu den Hmox1+/+ Weibchen weniger Oozyten produzieren. Auch konnten die Hmox1-/- Oozyten weniger erfolgreich als die Hmox1+/+ Oozyten fertili-ziert werden. Verschiedene Verpaarungsexperimente mit Hmox1+/+, Hmox1+/- und Hmox1-/- Mäusen ergaben einen indirekt proportionalen Zusammenhang zwischen HO-1 Expression und Aborthäufigkeit. Die hier gewonnenen Daten deuten daraufhin, dass HO-1 eine entscheidene Rolle in der Schwangerschaft spielt. Die gewonnenen Erkenntnisse tragen zum Verständnis der Pathologie des immunologisch vermittelten Spontaborts bei und können darüber hinaus helfen neue Be-handlungsstrategien gegen diese gefürchtete Schwangerschaftskomplikation zu entwickeln. / Mammalian pregnancy is a parabiotic union of two genetically different individuals, the fetus and the mother. At the feto-maternal interface, inflammatory processes can occur due to an immune reaction against alloantigens. It is known that some degree of systemic or uterine inflammation is necessary for both normal implantation and pregnancy. However, if this in-flammation becomes too excessive it can cause pregnancy complications such as abortion. Heme oxygenase-1 (HO-1), the enzyme responsible for the degradation of free heme, plays a key role in inflammatory processes. Viewing pregnancy mainly as an inflammatory process had led us to the idea that HO-1 may play an important role in pregnancy. Therefore, the main aim of this work was to analyze the role of HO-1 in the different processes related to preg-nancy by means of functional studies employing in vivo as well as in vitro models. First, we could show that a specific up-regulation of HO-1 in abortion-prone animals by means of an adenoviral vector is able to reduce the abortion rate. This HO-1 up-regulation improved pregnancy outcome by up-regulating the Th2/Th1 cytokines ratio and protecting tissues from apoptosis, suggesting an important role of HO-1 in pregnancy. In a second part of the work, we aimed to analyze the role of HO-1 in placentation. For that, a trophoblast stem cell line capable of differentiate into trophoblast giant cells was used. Inter-estingly, a down-regulation of HO-1 by means of ZnPPIX led to diminished survival of the trophoblast stem cells. Furthermore, these cells were unable to differentiate into trophoblast giant cells in the absence of HO-1, strongly suggesting a crucial role of HO-1 in placentation. Finally, a closer look into the role of HO-1 in pregnancy was performed by using heme oxy-genase-1 deficient mice (Hmox1-/- mice). Interestingly, Hmox1-/- females produce much less oocytes than wild type females. Analyses of the ovaries of both types of females showed dif-ferences in follicle development. Furthermore, when fertilized in vitro, a significant diminu-tion in the fertilization rate of Hmox1-/- oocytes when compared to Hmox1+/+ oocytes was found. Since the mating of Hmox1-/- mice does not yield progeny, we also aimed to clarify whether this is due to problems in the female, in the male or in both. For this, different mating combinations of mice partially or totally deficient in Hmox1 were performed. The analysis of the pregnancy outcome showed that, the less HO-1 in the combination, the higher the fetal rejection. In summary, a central role of HO-1 in different processes of reproduction could be demon-strated in this work which helps understanding the mechanisms behind pregnancy success.

Flavinmononukleotid (FMN) und Flavin-Adenin-Dinukleotid (FAD) gehören zu den wichtigsten Redox-Coenzymen und sind an zentralen Stoffwechselprozessen aller Organismen beteiligt. Sie entstehen aus Riboflavin (Vitamin B2). Das bifunktionale RIBA Enzym, das Peptiddomänen für die GTP Cyclohydrolase II (GCHII) und 3,4-Dihydroxy-2-Butanon-4-Phosphat-Synthase (DHBPS) Aktivität umfasst, führt die beiden ersten Schritte der Riboflavin Biosynthese in Pflanzen durch. Die RIBA Proteine werden durch drei Gene in Arabidopsis thaliana und anderen Blütenpflanzen kodiert. Eines der Ziele war es, die physiologischen Rollen der drei RIBA Isoformen aufzuklären. Detaillierte enzymatische Untersuchungen wurden mit rekombinanten RIBA Proteinen IN VITRO durchgeführt. Es wurde gezeigt, dass RIBA2 und RIBA3 jeweils die GCHII oder die DHBPS Aktivität verloren haben. Des Weiteren konnte die Phosphorylierung von RIBA1, sowie die Hemmung von dessen GCHII Aktivität durch FMN nachgewiesen werden. Ein Knockout von RIBA1 führte zu Embryoletalität. Die schrittweise Reduzierung des RIBA1 Proteingehaltes in Arabidopsis, welches zu einem verringerten Flavingehalt führte, ergab einen schwerwiegenden Bleichungsphänotyp. Die konstitutive Antisense-Mutante, sowie das Verfahren des Virus-induzierten Gen-„Silencing“ wurden verwendet, um den durch RIBA1-Mangel hervorgerufenen Flavin-Defizienz-Effekt zu beschreiben. Eine Metabolomics Analyse ergab, dass die Abnahme des Flavingehaltes zu einer Deregulierung verschiedener Zitronensäurezyklus assoziierten Flavoenzyme und zu einer starken Reduktion der katabolischen Kapazität diverser Aminosäuren führt, während flavinabhängige Stickstoffassimilationsprozesse eher priorisiert wurden. Diese Arbeit leistet einen Beitrag zur Erweiterung des Kenntnisstands über den pflanzlichen Riboflavin Biosyntheseweg, sowie zum Verständnis über die Folgen von Flavinmangel in Pflanzen. Darüber hinaus wird hier der erste Versuch zu Erhöhung des Vitamin B2-Gehalt in Pflanzen beschrieben. / Flavin mononucleotide (FMN) and Flavin adenine dinucleotide (FAD) belong to the main redox coenzymes and are involved in central metabolic processes. They derive from riboflavin also referred to as vitamin B2. The bifunctional RIBA enzyme, which comprises peptide domains for GTP cyclohydrolase II (GCHII) and 3,4-dihydroxy-2-butanone-4-phosphate synthase (DHBPS) activity, performs the two initial steps of riboflavin biosynthesis in plants. Three genes encode RIBA proteins in Arabidopsis thaliana and many other flowering plants. One of the main aims of this study was to elucidate the physiological roles of the three RIBA isoforms. Detailed enzymatic studies were performed with recombinant RIBA proteins IN VITRO. It revealed for RIBA2 and RIBA3 the loss of either GCHII or DHBPS activity, respectively. The phosphorylation of RIBA1 as well as the inhibition of its GCHII activity by FMN could be demonstrated. A knockout of RIBA1, encoding the dominant RIBA isoform, led to embryo lethality. The gradual reduction of the RIBA1 protein content in Arabidopsis was associated with reduced flavin amounts and a severe bleaching phenotype that was caused by the gradual loss of pigments during leaf development. Flavin deficiency effects caused by RIBA1 depletion were characterised with a constitutive antisense mutant and the virus induced gene silencing method. A comprehensive metabolite profiling, revealed that the loss of almost one third of total flavin content led to a deregulation of several citric acid cycle-associated flavoenzymes. Moreover, a severe reduction of the catabolic capacity of numerous amino acids is seen, while seemingly flavin-dependent processes of the nitrogen assimilation are prioritised. In summary, this thesis contributes to the extended knowledge about the riboflavin biosynthesis pathway as well as to the understanding about consequences of flavin deficiency in plants. Moreover, the first attempt to increase the vitamin B2 content in plants is presented.

Die Veraenderungen des Immunsystems mit zunehmendem Alter, Immunseneszenz genannt, resultieren in erhoehter Infektanfaelligkeit. Infolge dessen leiden aeltere Menschen unter haeufigeren und schwerer verlaufenden Infekten, Autoimmunerkrankungen und vermindertem Impfschutz. Immunseneszenz entsteht nicht nur aufgrund chronologischen Alterns, sondern wird auch durch andere teils ungeklaerte Faktoren verursacht. Cytomegalievirus (CMV) ist ein Herpesvirus, dass in immunkompetenten Menschen lebenslang persistiert. Infolge chronischer Immunaktivierung traegt CMV zur beschleunigten Immunseneszenz bei. In dieser Arbeit wurden die Alters- und CMV-induzierten Veraenderungen in humanen T-Zellen analysiert. Dafuer wurden PBMC von 50 gesunden Spendern in drei verschiedenen Altersgruppen antigenspezifisch (CMV-Proteine pp65 und IE1 und protein purified derivate von Mycobacterium tuberculosis (PPD)) und polyklonal (OKT3) in vitro stimuliert. Ein 11-Farben-Panel wurde etabliert, um die simultane Expression der Differenzierungsmarker CD45RA und CD27 und der Aktivierungsmarker CD40L, IFNg, IL2 und TNF auf T-Zellen durchflusszytometrisch zu untersuchen. Die Ergebnisse dieser Arbeit zeigten, dass die antigenabhaengige Differenzierung der Gedaechtnis-T-Zellen mit zunehmendem Alter und CMV-Infektion zunahm. Die Differenzierung der Gedaechtnis-T-Zellen in CMV-positiven Spendern war ausserdem mit der Antwortgroesse gegen pp65 korreliert. Die pp65-spezifische, aber nicht die IE1-spezifische polyfunktionale T-Zell-Antwort nahm mit zunehmendem Alter der Probanden zu. Zusammenfassend kann gesagt werden, dass CMV einen grossen Einfluss auf das Immunsystem gesunder Individuen hat. Die Differenzierung der Gedaechtnis-T-Zellen ist nicht nur abhaengig von der Infektion mit CMV, sondern auch davon, wie das Immunsytem auf CMV reagiert. Polyfunktionale CMV-spezifische T-Zellen, die wahrscheinlich CMV kontrollieren, sind vorhanden und werden nicht von dysfunktionalen T-Zellen im Alter verdraengt. / Ageing of the immune system, also called immunosenescence, is a phenomenon that leads to increased susceptibility to infections in elderly people. Persistent cytomegalovirus (CMV) infection induces strong T cell responses in humans and is thought to be one of the driving forces of immunosenescence. In this work CMV-induced alterations in the T cell compartment of human individuals were analysed in terms of frequencies and absolute numbers per ml blood. Peripheral blood mononuclear cells (PBMC) from 50 donors in three different age groups were stimulated in vitro and examined for the phenotypic markers CD45RA and CD27 and the effector molecules CD40L, IFNg, IL2 and TNF by polychromatic flow cytometry. The frequency of responding polyfunctional T cells to stimulation with OKT3 or CMV peptide pools phosphoprotein 65 (pp65) or immediate-early protein1 (IE1) increased with the age of the donor. The memory subset distribution differed between CMV-seronegative and CMV-seropositive donors and was correlated with the response size in the CMV-seropositive group. Polyfunctional T cells expressed quantitatively and qualitatively more activation marker on a per cell level than monofunctional cells and therefore appeared to be more effective. Furthermore, polyfunctional T cells expressed reduced amounts of surface CD3, CD4 and CD8 compared to monofunctional or non-responding T cells. In summary, the results indicate that CMV has a significant influence on the immune system of healthy people. The memory subset composition of the entire T cell compartment depends on how the immune system responds to CMV (large or small responses) rather than the presence or absence of infection. Irrespectively of response size or age a robust population of polyfunctional CMV-specific T cells is present and may be in control of CMV.

In h?heren Pflanzen vermittelt der Blaulicht-sensitive Photorezeptor Phototropin verschiedene Reaktionen wie Phototropismus, Chloroplastendrehung und die ?ffnung von Schlie?zellen. Alle Reaktionen haben mit der Optimierung der pflanzlichen Lichtaufnahme und damit einer angepa?ten Photosynthese sowie der Vermeidung von Lichtsch?digung zu tun. In C.reinhardtii haben alle Phototropinreaktionen mit dem Sexualleben dieser Alge zu tun, d.h. Gametogenese, sexueller Kompetenz sowie der Keimung von Zygoten. Diese Doktorarbeit wurde Ende 2001 begonnen und verlief parallel zu den Arbeiten von Huang. Im Unterschied zu den Ergebnissen von Huang war das Chlamydomonas Phototropin in meinen H?nden unl?slich. Das Protein war nicht komplett membranassoziiert, sondern ein Teil des Proteins blieb immer l?slich. Die Phototropinmenge sowie die Verteilung waren in vegetativen Zellen, die unter Stark- oder Schwachlicht gewachsen waren, unterschiedlich. Deshalb wurde fš¹r diesen Unterschied Licht als wesentlicher Faktor verantwortlich gemacht. Jedoch zeigen verschiedene St?mme bei vegetativem Wachstum unter identischen Lichtbedingungen unterschiedliche Phototropinmengen. Das deutet auf weitere Faktoren hin, die Konzentration und Verteilung von Phototropin beeinflussen. In Chlamydomonas wurde neben dem Volll?ngenprodukt noch eine c-terminal verkš¹rzte Phototropinvariante gefunden. Licht wurde als Verursacher der Verkš¹rzung identifiziert. Aber nur lange Belichtungen von ca. 48 h fš¹hrten je nach Intensit?t zu klaren Abbaumustern. Fš¹r das Studium der Beteiligung des Phototropins am Sexualleben von Chlamydomonas, sollte ein Phot- Stamm generiert werden. Dazu wurde ein RNAi-Konstrukt hergestellt, mit dem es m?glich war, im Stamm cw15 arg- A das Phototropin bis auf 10% des Originalniveaus zu reduzieren. Leider funktionierte das Konstrukt in anderen St?mmen nicht zuverl?ssig. Im Stamm CC32pab1mt(+) konnte nur ein Klon mit einer Reduktion auf 15% des Originalniveaus erreicht werden. Au?erdem war die Silencing-Effizienz stark von den Wachstumsbedingungen abh?ngig. Die beste Reduktion wurde bei niedrigen Lichtintensit?ten gefunden. Es wurde ein weiterer Kreuzungstest etabliert, der fš¹r die Analyse der Zygotenkeimung verschiedene Vorteile gegenš¹ber bekannten Tests liefert. Aus den durchgefš¹hrten Tests konnte geschlossen werden, dass Licht auch ein wesentlicher Faktor fš¹r die Zygotenkeimung ist. Bei mittleren Lichtintensit?ten keimen Zygoten mit wenig Phototropin sp?ter. Starklicht kann diesen Mangel weitgehend kompensieren. Zur biochemischen Analyse des Phototropins in vitro war die Expression eines markierten Phototropins notwendig. Zur Analyse des Phototropinabbaus und fš¹r die sp?tere Reinigung wurde auch versucht, Phototropin in verschiedenen Gastorganismen zu exprimieren. In dieser Arbeit wurde Phototropin in Xenopus Oocyten und Diatom?en exprimiert. Diese Versuche haben best?tigt, dass das Phototropinabbauprodukt vom selben Gen wie das Volll?ngenprotein resultiert. Durch Expression der Phot-Mutante S57S/C250S konnte auch gezeigt werden, dass die Aktivierung des Phototropins keine Voraussetzung fš¹r den Abbau ist. Erstmalig konnte auch Phototropin als Fusionsprotein in Chlamydomonas exprimiert werden. Das Fusionsprotein wurde gereinigt und die Identit?t massenspektrometrisch verifiziert. Es wurde ein Stamm gefunden, der nur eine verkš¹rzte Variante des Phototropins exprimiert. Das Produkt war besser l?slich als die Volll?ngenversion. Eine Gro?produktion sollte fš¹r die Reinigung und nachfo! lgende Kristallisation angesetzt werden. Tandem Affinit?tsreinigungen sollten fš¹r die Identifizierung von Reaktionspartnern durchgefš¹hrt werden. / Abstract In higher plants, phototropin is in charge of phototropism (Liscum, 2002), chloroplast relocation (Wada et al., 2003) and stomatal opening (Schroeder et al., 2001). All its functions are connected with plants' modulation to the surrounding light conditions so that plants can make the best use of light for photosynthesis and dodge harmful strong light. In C.reinhardtii, all its reported functions are connected to the sexual life of this green alga, i.e. gametogenesis, maintenance of gamete competence and zygote germination. This PhD work started at the end of 2001 and went on in parallel with Huang's work. Different from Huang's observation that phototropin was insoluble (Huang et al., 2002), it was found that phototropin existed not only as a membrane associated protein, a portion of phototropin always remained soluble. Phototropin levels and distributions were different between vegetative cells grown in strong light or in darkness. Light was thought to be the essential factor that caused this difference. But, different strains grown vegetatively under same light conditions showed that the levels of phototropin and its distributions varied. This suggested the existence of other factors in the determination of its level and distribution. A C-terminus degradation product of phototropin was found as a stable component in C. reinhardtii. Light was found as a reason that caused the degradation. However, short time of illumination with strong light (up to 2 h) did not evoke the degradation machinery. In light gradient experiment, long time illumination (~48h) with different light intensity showed a clear degradation pattern. To study phototropin involvement in Chlamydomonas sexual life, a Phot1- strain was needed. An RNAi phototropin construct was made. It managed to reduce the level of phototropin in strain cw15 arg- A down to 10% of its original level. However, the construct did not work properly in other strains. Only one transformant of strain CC32pab1mt(+) with a reduction of the phototropin level to around 15% of the original level was found. Under different growth conditions, the silencing efficiency varied. The best silencing result appeared when cells were grown under low light conditions. A new mating assay was established in this work, which has many benefits over the traditional way of studying zygote germination. The conclusion was drawn from this assay that light was the primary factor that determines zygote germination; under moderate light conditions, zygotes with higher phototropin level would germinate earlier; strong illumination could compensate the difference caused by the low phototropin level in zygote germination. For phototropin function analysis in vitro, a Chlamydomonas strain that over-expressed phototropin was in need. To prove that the suspected degradation product originated from the phototropin gene and to purify phototropin for crystallization, trials to express C.r. phototropin cDNA in different organisms were also made. Phototropin was expressed in Xenopus oocytes and diatom in this work. The expression pattern confirmed that both the full-length and the suspected degradation product did originate from the same phototropin gene. It was also found that the degradation was independent on phototropin activation state by expressing C.r. Phot1 (C57S, C250S) in oocytes. For the first time, recombinant phototropin got expressed in Chlamydomonas by fusion expression strategy. The fusion product was purified and the identity was confirmed by Mass Spectrometry analysis. One strain which expressed only a C-terminus truncation version of the fusion product was found. Compared with the full length product, this mutant had better solubility and was easier to be purified. Large scale of purification should be performed to obtain enough material for crystallographic studies. Tandem affinity purification (TAP) tag should also be performed in Chlamydomonas proteomic studies about phototropin.

Diese Arbeit basiert auf der grundlegenden Annahme, dass Signaltransduktionsnetzwerke in lebenden Organismen als das Ergebnis eines evolutionären Prozesses betrachtet werden können, der sich durch Mutations- und Selektionsprinzipien auszeichnet. Basierend auf dieser Hypothese werden zwei Ansätze vorgestellt, um Design und Kontrollmechanismen von Netzwerken zu untersuchen. In Kapitel 2 wird ein Modell entwickelt, welches die Struktur analysiert. Ein vereinfachtes Modell wird benutzt, um Systeme, bestehend aus Rezeptoren, Kinasen und Phosphatasen, zu beschreiben. Zwei dynamische Eigenschaften sollten für die Überlebensfähigkeit der Organismen eine wichtige Rolle spielen: (i) Um eine Autoaktivierung zu verhindern, z.B. gegenüber stochastischen Schwankungen von Rezeptorliganden, muss der Signal-Aus Zustand dynamisch stabil sein. (ii) Das Ausgangssignal sollte verstärkt werden. Um Netzwerke zu charakterisieren, die beide Kriterien gleichzeitig erfüllen, wird eine systematische Analyse von kleinen Netzwerken durchgeführt. Die Untersuchungen machen deutlich, dass für solche Netzwerke die folgenden zwei Design-Eigenschaften gelten: (i) Mit steigender Netzwerkgröße verringert sich die Konnektivität, was einer steigenden Spezifität der Kinasen gleichkommt. (ii) Die Anzahl der "Feedback"-Zyklen nimmt mit zunehmender Netzwerkgröße ab, was eine abnehmende Tendenz anzeigt, dass "nachgeschaltete" Kinasen "vorgelagerte" Kinasen aktivieren. Die allgemeine Gültigkeit dieser Eigenschaften wird durch die Untersuchung eines großen Kinase-Netzwerks aus der Datenbank TRANSPATH gestützt, welches hinsichtlich verschiedener Strukturmerkmale weitergehend untersucht. Das Netzwerk-Design unterscheidet sich aussagekräftig von Zufallsnetzen. In Kapitel 3 werden Kontrollmechanismen unterschiedlicher Signalnetzwerke analysiert, indem die Metabolische Kontroll Theorie auf transiente Aktivierungsprofile angewendet wird, indem Kontrollkoeffizienten für Amplitude, Signaldauer berechnet werden. / This work is based on the hypothesis that signal transduction networks in living cells are the result of an evolutionary development which is governed by mutations and natural selection principles. Based on this working hypothesis, two approaches are presented to investigate design and control mechanisms of signal transduction networks. In the first approach, covered in chapter 2, a model is developed to analyse the structural design of signaling networks. A simplified model is used to describe systems consisting of receptors, kinases and phosphatases. Two dynamic features of signaling systems are assumed to be crucial for the organism''s surviving capacity: (i) To avoid autoactivation, e.g. due to stochastic fluctuations of receptor ligand, the signal off-state must be dynamically stable. (ii) The signal output should be amplified. To characterise networks fulfilling both criteria simultaneously, a systematic analysis is performed for small networks. The investigations reveal that for such networks the following two design principles hold true: (i) With increasing network size the connectivity decreases connoting an increasing specificity of kinase activities. (ii) The number of feedback cycles decrease with increasing network size indicating a decreasing tendency of downstream kinases to activate upstream kinases. The general validity of these design principles is supported by the analysis of a large kinase network retrieved from the TRANSPATH database. This signaling network is further investigated regarding several design properties. When comparing the design and dynamic features of the TRANSPATH network to random networks, significant differences are observed. In the second approach, described in chapter 3, control mechanisms of different signaling networks are analysed by applying Metabolic Control Analysis to transient activation profiles. Control coefficients on the signal amplitude, signal duration and integrated response are calculated.

Lipoxygenasen sind nichthämeisenhaltige Dioxygenasen, die die Bildung von Hydroperoxiden aus molekularem Sauerstoff und mehrfach ungesättigten Fettsäuren katalysieren. Im Rahmen dieser Arbeit wurden verschiedene Lipoxygenase-Ligand-Wechselwirkungen untersucht: a) Durch gezielte Substratveränderungen und ortsgerichtete Mutagenese konnte gezeigt werden, dass Fettsäuren normalerweise mit dem Methylende in der Bindungstasche tierischer Lipoxygenasen gebunden werden. Unterschiedliche Positionsspezifitäten basieren demzufolge auf dem Volumen der Substratbindungstasche (Volumenhypothese). Darüber hinaus konnte bei der 15-Lipoxygenase eine inverse Substratbindung (Carboxylgruppe im aktiven Zentrum) durch Modifikation beider Enden der Fettsäure erzwungen werden, wodurch ausschließlich 5-Lipoxygenierung katalysiert wurde. b) Untersuchungen mit dem Hemmstoff Ebselen ergaben unterschiedliche Hemmmechanismen für verschiedene Enzymzustände. Die Hemmung der Lipoxygenase im Grundzustand (Fe[II]) erfolgt durch kovalente Bindung und Veränderung der Eisenligandensphäre irreversibel nach einem nicht-kompetitiven Mechanismus. Dagegen wird die aktive Lipoxygenase (Fe[III]) nur noch kompetitiv durch Ebselen gehemmt. c) Die Membranbindung der tierischen 15-Lipoxygenase erfolgt über hydrophobe Wechselwirkungen, vermittelt durch oberflächenexponierte, hydrophobe Aminosäuren aus beiden Enzymdomänen. Die Expression einer enzymatisch aktiven Trunkationsmutante, der die N-terminale Domäne fehlt, zeigte, dass diese nicht essentiell ist für die Membranbindung. / Lipoxygenases are nonheme iron-containig dioxygenases that catalyze the oxygenation of polyunsaturated fatty acids to hydroperoxy derivatives. Here, the interaction of lipoxygenases with various ligands was investigated: a) From substrate modifications and site directed mutagenesis it was concluded that fatty acids are bound with their methyl end in the substrate binding pocket of mammalian lipoxygenases. The positional specificity is therefore related to different volumes of this binding pocket (space-based hypothesis). For the 15-lipoxygenase an inverse substrate binding (carboxy terminus in the pocket) could be forced by simultaneous modification of both ends of the fatty acid. This lead to an exclusive 5-lipoxygenation by the 15-lipoxygenase. b) The mechanism of lipoxygenase inhibition by ebselen depends on the enzyme's state. The groundstate lipoxygenase (containing Fe[II]) is irreversibly inhibited in a non-competetive manner due to covalent modification and alteration of the iron ligand sphere. The active enzyme (containing Fe[III]) on the other hand is only competetively inhibited. c) The membrane binding of the mammalian 15-lipoxygenase is based on hydrophobic interactions mediated by solvent exposed, hydrophobic amino acid residues of both enzyme domains. The expression of an enzymatically active truncation mutant, which lacks the entire N-terminal domain, showed that this domain is not essential for membrane binding.

Die Blutgefäßentwicklung ist ein mehrstufiger Prozess, der durch verschiedenste Signalwege und Zellmechanismen bestimmt wird. Murale Zellen sind mit dem Endothel assoziiert und wichtig für die Stabilisierung von Blutgefäßen. Ein essentieller Faktor für die Blutgefäßentwicklung ist die Bestimmung der Zellmigrationsrichtung durch verschiedene Faktoren. Einige dieser Faktoren wurden ursprünglich für die neurale Entwicklung beschrieben. Die Proteinfamilie der Neuron Navigators (NAV) sind neue Akteure, die die Migration von Zellen während des Neuronenwachstums beeinflussen. Ein möglicher Einfluss auf die Blutgefäßentwicklung ist bisher unbekannt. Wir nehmen an, dass das Protein NAV1 in Zellmigrationsprozessen während der Angiogenese eine Rolle spielt und verwendeten zur Aufklärung der Funktion von NAV1 Modelle in der Maus und im Zebrafisch. Das Blutgefäßnetzwerk in der Retina von neonatalen NAV1-/--Mäusen, als auch in einem aortic ring assay zeigte Defekte der Gefäßremodellierung durch eine verringerte Anzahl an Verzweigungspunkten der Blutgefäße auf. Es konnte erstmals eine Expression von NAV1 in muralen Zellen gezeigt werden. Die NAV1-defizienten Mäuse zeigten eine verringerte Anzahl von muralen Zellen auf Blutgefäßen auf. Dieser Defekt ging mit einer verstärkten Regression von Blutgefäßen einher, welche für die geringere Verzweigung dieser verantwortlich sein kann. In vitro Experimente mit primären muralen Zellen deuten auf einen zellautonomen Einfluss von NAV1 auf die Bewegung von Zellen in Abhängigkeit von Netrin-1 und der extrazelluären Matrixkomponente Kollagen I hin. Nav1-depletierte Zebrafische wiesen eine verringerte Komplexität von bestimmten zerebralen Blutgefäßen auf. Dies deutet darauf hin, dass der Einfluss von Nav1 auf die Blutgefäßausbildung konserviert ist. Wir konnten NAV1 als einen neuen zelleigenen Faktor der Motilität von muralen Zellen identifizieren, der in Folge als positiver Modulator zur Regulation der Gefäßstrukturierung beiträgt. / Vessel development is a multistep process orchestrated by different cellular and signaling mechanisms. Mural cells are associated with the endothelium and thought to be important for vessel stabilization. Cell guidance is an essential factor during vascular development, accomplished by different attractive and repulsive factors. Some of these were originally described in neural development. The Neuron Navigator (NAV) protein family is a novel player in regulating cell migration events during neuron growth, but their potential impact in vessel development is unknown. We hypothesized that the family member NAV1 plays a role in cell migration events during angiogenesis and examined the function of NAV1 in vascular development using loss-of-function models in mouse and zebrafish. Analysis of the vessel network phenotype in neonatal retina and an aortic ring assay of NAV1-/--mice revealed defective vessel remodeling in the absence of NAV1, indicated by reduced branch point numbers of vessels. Characterization of cellular expression domains point to a prominent, so far unknown, NAV1 expression in mural cells and NAV1-knockout mice exhibited reduced mural cell numbers on vessels. Decreased mural cell recruitment accompanies with increased vessel regression in the retina that may be attributable for the vascular phenotype. In vitro data of primary mural cells indicate a cell-autonomous influence of NAV1 on cell locomotion in response to Netrin-1 and/or the extracellular matrix component Collagen I. Analysis of Nav1 depleted zebrafish embryos revealed less complex vessel networks of specific cerebral vessels, the central arteries, suggesting that the impact of Nav1 on vessel development is conserved in vertebrates.

Parasitische Nematoden beeinflussen gezielt die Abwehrreaktionen ihres Wirtes. Dies wird besonders während der chronischen Infektionsphase durch eine herabregulierte T-Zell-Antwort auf Parasitenantigene und andere Stimuli ersichtlich. In dieser Arbeit wurde die T-Zell-Antwort gegen einen intestinalen Nematoden untersucht. Mäuse wurden mit dem Trichostrongyliden Heligmosomoides polygyrus infiziert und in der Folge Effektor- sowie regulatorische T-Zellen (Tregs) untersucht. Subpopulationen von CD4+ T-Zellen wurden aus chronisch infizierten Mäusen isoliert und in naive Empfänger transferiert, welche nachfolgend infiziert wurden. Dabei zeigte sich, dass der Transfer von CD4+ Effektor-T-Zellen zu einer verminderten Wurmlast in den Empfängertieren führte, diese Zellen also einen partiellen Schutz gegen die Primärinfektion vermitteln. Der gleichzeitige Transfer von Tregs beeinflusste diesen Effekt nicht. Tregs allein zeigten keinerlei Einfluss auf die Wurmlast der Empfänger. Die Protektion durch Transfer von Effektor-T-Zellen kann vermutlich auf eine kleine Antigen-spezifische Population von CD4+ Zellen zurückgeführt werden. Diese Zellen wurden durch die Expression von CD40-L (CD154) nach Restimulation mit Parasitenantigen in vitro charakterisiert und enthielten einen Großteil der Zytokinproduzenten unter den CD4+ Zellen. Während diese Effektorzellen ein deutliches Th2-Zytokinprofil durch Produktion von Interleukin-4 (IL-4) und IL-13 zeigten, reagierte eine Treg-Subpopulation mit der Sekretion hoher Mengen von IL-10 auf Antigenstimulation. Diese Tregs waren durch Expression des Integrins AlphaE (CD103)Beta7 sowie CD25 und Foxp3 charakterisiert und vermittelten in vitro die stärkste Suppression anderer T-Zellen, wenn sie aus chronisch infizierten Mäusen isoliert wurden. Durch Untersuchung der zellulären Zusammensetzung von mesenterialen Lymphknoten und Milz konnte gezeigt werden, dass die Frequenz solcher regulatorischer Zellen im Verlauf der Infektion dauerhaft und überproportional zunimmt. Im Gegensatz dazu wurde am Infektionsort nur eine vorübergehende Akkumulation von Tregs (Foxp3+) während der akuten Phase der Infektion nachgewiesen. Diese Ergebnisse zeigen den Einfluss einer intestinalen Nematodeninfektion auf die Aktivität von Tregs und das Potential parasitenspezifischer CD4+ Effektor-Zellen zur Vermittlung von Schutz gegen die Infektion. Ein weiteres Projekt dieser Arbeit wahr die Verabreichung eines immunmodulatorischen Parasitenproteins, des Filariencystatins Av17, in einem Mausmodell entzündlicher Darmerkrankungen. In Mäusen wurde eine kolitisartige Entzündung durch eine Chemikalie im Trinkwasser induziert. Die regelmäßige Verabreichung von rekombinant exprimiertem Cystatin verminderte die Entzündungsreaktion signifikant. Damit konnte in dieser Arbeit gezeigt werden. dass Entzündungsreaktionen, die nicht durch den Parasiten selbst hervorgerufen werden, durch die Applikation einer einzelnen Parasitenkomponente unterdrückt werden können. / Parasitic nematodes specifically modulate the immune response of their hosts. A cellular hyperreactivity, especially during the chronic phase of infection, is a distinct finding of such infections. The T cell response against an intestinal nematode was analyzed in this work. Mice were infected with the trichostrongylid Heligmosomoides polygyrus and surveyed for changes concerning effector and regulatory T cells (Tregs). Subpopulations of CD4+ T cells were isolated from chronically infected mice and adoptively transferred to naive recipients, which were subsequently infected. The Transfer of CD4+ effector cells conferred partial protection, seen as decreased worm burdens in recipients. This effect was unimpaired by simultaneous transfer of Tregs. The transfer of purified Tregs alone showed no effect on worm burdens. The protection by transfer of effector T cells was probably due to a small parasite-specific population, which was characterized by the expression of CD40-L (CD154) after antigen-restimulation. The CD154+ population contained high frequencies of cells reacting with production of the Th2 key cytokines interleukin-4 (IL-4) and IL-13. On the other hand, a subpopulation of Tregs secreted high amounts of IL-10 in response to the antigen. These Tregs were characterized by the expression of the integrin AlphaE (CD103)Beta7, as well as CD25 and Foxp3. They showed a peculiar strong suppressive efficacy on the proliferation of other T cells, especially when derived from chronically infected donors. Analyzing the cellular composition of mesenteric lymph nodes and spleens in response revealed a lasting and over-proportional increase in frequencies of these Tregs. In clear contrast, only a transient increase of Foxp3-expressing Tregs was detected at the site of infection during the acute phase. These results point out the changes Treg activity during an intestinal nematode infection and show the potential of CD4+ effector cells in mediating protection against infection. A second project of this work was the application of an immunomodulatory parasite protein, the filarial cystatin Av17, in a mouse model of inflammatory bowel disease. Mice developed an inflammatory response to a chemical applied in the drinking water. The repeated application of recombinantly expressed cystatin significantly diminished the inflammatory response. Hence, this work showed the potential of a single parasite component in suppressing inflammatory processes not caused by the parasite itself.

Zusammenfassung Die hier vorgelegte Arbeit analysiert funktionelle Domänen von Sec71p und Sec72p, zwei Komponenten des posttranslationalen Transports in das ER von Saccharomyces cerevisiae. Die Kombination von Nullmutanten von SEC71, SEC72 und SBH1 führte zu den letalen Doppeldeletionsmutanten -sec71/-sbh1 und -sec72/-sbh1. Beide Hefestämme zeigen starke Akkumulation von Präkursoren verschiedener Transportsubstrate in vivo und in vitro. Ausgehend von den letalen Doppeldeletionsstämmen war es möglich, für die Funktion von Sec71p und Sec72p wesentliche Domänen zu bestimmen. Der cytosolische Bereich von Position 120-160 des Sec71p ist ausreichend für die Assoziation mit Sec62p und bildet außerdem einen Teil der Sec72p-Bindungsdomäne. Der sich anschließende C-terminale Bereich von 46 Aminosäuren ist ebenfalls ein Teil der Sec72p-Bindungsdomäne. Jede Teildomäne für sich kann Sec72p eingeschränkt anlagern, zusammen binden sie Sec72p Hochsalz-resistent und Alkali-beständig. Sowohl eine C-terminale Verkürzung von Sec71p bis Position 160, als auch eine Sec71p-Variante ohne Membrananker und luminalen Teil können Sec71p funktionell ersetzen. Fusionsproteine von cytosolischen Bereichen des Sec71p und dem Membrananker des P450 aus Candida maltosa können es nicht. Der Membrananker von Sec71p ist somit nicht essentiell, kann aber auch nicht durch einen beliebigen Membrananker ersetzt werden. Eine Sequenzanalyse von Sec72p identifizierte im C-Terminus von Sec72p eine potentielle TPR-Domäne. TPR-Domänen sind Bestanteile von Protein-Interaktionen, unter anderem auch im Protein-Targetingmechanismus von Mitochondrien und Peroxisomen. Es lag daher nahe, nach cytosolischen Interaktionspartnern von Sec72p zu suchen, die Teil eines posttranslationalen Targetingmechanismus sein könnten. Die Ergebnisse photochemischer Quervernetzungsexperimente werden genauso vorgestellt, wie die eines Screens zur Identifizierung synthetisch letaler Mutanten. Durch Coimmunpräzipitationen wurde gezeigt, daß in Abwesenheit von Sec71p, Sec72p und Sbh1p die Assoziation von Sec61p mit Sec62p nicht beeinträchtigt wird. Die hier präsentierten Daten in Kombination mit anderen Ergebnissen führen zu der Hypothese, daß Sec71p/Sec72p zusammen mit Sbh1p eine essentielle Funktion während eines frühen Schrittes der posttranslationalen Translokation ausüben. Wegen der möglichen gegenseitigen Komplementation wurden die drei Proteine bisher in genetischen Screens jedoch nie als essentiell für den posttranslationalen Transportprozeß gefunden. / Abstract This work is focused on the functional domains of Sec71p and Sec72p. These proteins are components of the posttranslational transport complex of the ER in the yeast Saccharomyces cerevisiae. Deletion mutants of SEC71, SEC72 or SBH1 are viable. However the deletion of two genes - either SEC71 and SBH1 or SEC72 and SBH1 resulted in a lethal phenotyp. Both double deletion strains accumulate different transport substrats in vivo and in vitro. Exploiting the lethal strains it was possible to investigate the function of special domains of Sec71p and Sec72p in detail. The cytosolic part of Sec71p from amino acid (aa) 120 to 160 is sufficient for the association of Sec71p with Sec62p. It is also part of the Sec72p binding domain since it binds Sec72p weakly. A tight association (resistant to high salt and alkaline pH) is achived by the additional interaction of Sec72p with the C-terminal aa 160-206 of Sec71p. The C-terminal truncation of Sec71p up to aa 160 is able to rescue a -sec71/-sbh1 deletion strain. Even a Sec71p-variation without the luminal part and membrane anchor can functionaly replace the wt-protein whereas fussion proteins of different cytosolic parts of Sec71p with a transmembrane domain of P450 of Candida maltosa are not able to do it. The transmembrane domain of Sec71p seems not to be essential for proteins function. A membrane anchor of a different protein abolishes the correct interaction of Sec71p with its partners of the translocon. A sequence analysis of SEC72 identified a C-terminal domain with similarity to a TPR-domain. TPR-domains mediat protein interactions and they participate for instance in the targeting of proteins to the mitochondria or peroxisomes. Therefore we searched for cytosolic interaction partners of Sec72p. The results of photoreactive crosslinking studies and of a screen for synthetic lethality are presented in this work. By co-immunoprecipitation we showed that the association between Sec61p and Sec62p is not altered in the abscence of Sec71p, Sec72p and Sbh1p. The results presented herein combined with other data gave rise to the hypothesis that Sec71p/Sec72p together with Sbh1p are essential for an early step of the posttranslational translocation. Because of their overlapping functions neither one of them was found to be essential for the posttranslational transport in former genetic screens.

Viele seeinterne Maßnahmen zielen darauf, die Phytoplanktonentwicklung über die Verfügbarkeit von Phosphor (P) im Wasserkörper zu steuern. Die meisten Restaurierungsverfahren sollen über eine Erhöhung der P-Bruttosedimentation oder Verminderung der P-Rücklösung die P-Retention im Sediment beeinflussen. Daher sind Sedimentuntersuchungen zur Abschätzung der P-Retention und ihrer Veränderung unter dem Einfluss der erwogenen Maßnahmen eine wichtige Voraussetzung für die Auswahl des im konkreten Einzelfall am besten geeigneten Verfahrens. Eine durch Fragebögen und Literaturauswertung vorgenommene Analyse legt offen, dass die Sedimentuntersuchungen häufig nicht oder mit ungeeigneten Methoden erfolgten und die Therapieversuche daher in der Vergangenheit oft nicht die erwartete Wirkung hatten. Mit einer Kosten-Nutzen-Abschätzung wird gezeigt, dass sich Voruntersuchungen auch finanziell rechnen, obwohl sie aufwendig und teuer sind. Die Forschung der letzten Jahre hat das Prozessverständnis für die Kopplung der verschiedenen Kreisläufe und das Zusammenspiel von chemischen und biologischen Prozessen erheblich vervollständigt. Wegen der Komplexität ist es jedoch immer noch sehr schwierig, die Wirkung eines technischen Eingriffs genau vorherzusagen. Es werden Untersuchungsmethoden benötigt, die die beteiligten Prozesse und Zustandsgrößen mit ausreichender räumlicher und zeitlicher Auflösung erfassen. Besonders wichtige Größen für seeinterne Maßnahmen sind das P-Freisetzungspotential und die P-Freisetzungsrate. Verschiedene Bestimmungsmethoden für die beiden Größen werden in der Arbeit beschrieben, weiterentwickelt, gegenübergestellt, mit Beispielen veranschaulicht und im Bezug auf ihre Vor- und Nachteile diskutiert. Das P-Freisetzungspotential kann aus der Veränderung der Gesamtphosphorgehalte im Sedimenttiefenprofil, aus den P-Bindungsformen der oberen Sedimentschicht oder aus Desorptionsuntersuchungen mit Sediment der oberen Schicht abgeleitet werden. Die P-Freisetzungrate kann als Konzentrationsanstieg des Freiwassers in Säulenversuchen, in Flux-Kammern oder im Hypolimnion gemessen werden. Alternativ ist es möglich, sie aus dem Konzentrationsgradienten des gelösten Phosphors an der Sediment-Wasser-Grenze mit Filtration, Zentrifugation, Sensoren oder Dialysesammlern zu ermitteln. Ein spezielles Augenmerk wird auf die kleinräumige horizontale Heterogenität der P-Porenwasserkonzentrationen gelegt, da diese Variabilitäten zu fehlerhaften P-Freisetzungsraten führen können. Ein neues Probenahmegerät, ein zweidimensionaler Porenwassersammler, wurde entwickelt, um die P-Porenwasserkonzentrationen mit hoher horizontaler und vertikaler Auflösung messen zu können. Das neue Probenahmegerät erwies sich zur Klärung der Frage, wie viele unabhängige Messungen in einem konkreten Fall für zuverlässige Ergebnisse erforderlich sind, als geeignet. Der Einsatz des zweidimensionalen Porenwassersammlers identifizierte biologische Aktivität als Hauptursache räumlicher Variabilität. Ferner wurde deutlich, dass die räumliche Variabilität der P-Porenwasserkonzentrationen in flachen Gewässern größer als in tiefen Gewässern ist. Bei der Probenahmeplanung und Ergebnisauswertung sollte die räumliche Variabilität auf jeden Fall ausreichend berücksichtigt werden. An einem konkreten Anwendungsfall (Auensee) werden die vorgestellten Untersuchungsmethoden eingesetzt, um die Auswahl von Restaurierungsverfahren zu demonstrieren. Erst die kombinierte Interpretation von P-Freisetzungspotential und P-Freisetzungsrate erlaubt, die richtigen Schlussfolgerungen für das Untersuchungsgewässer zu ziehen. In einem weiteren Fallbeispiel (Süßer See) wird gezeigt, dass Nachuntersuchungen nicht nur zur Erfolgskontrolle notwendig sind, sondern auch um wissenschaftliche Erkenntnisse zu gewinnen. Im dargestellten Fall wird anhand von Laborversuchen und einer konzeptionellen Modellierung gezeigt, dass eine mit Neusediment überdeckte P-sorbierende Schicht auch bei noch vorhandener Sorptionskapazität keinen nennenswerten Einfluss auf die P-Konzentrationen im Wasserkörper hat. Die mit der vorliegenden Dissertation erfolge Zusammenschau und kritische Bewertung der Untersuchungsmethoden soll auch dazu dienen, die Lücke zwischen wissenschaftlichem Prozessverständnis und wasserwirtschaftlicher Praxis zu verkleinern. / Many internal restoration measures in lakes are directed to control of phytoplankton development by limiting the availability of phosphorus (P). Most such measures are aimed at changing P retention in sediment by increasing gross P sedimentation, or reducing P release (Chapter 2). Thus, pre- and post-restoration investigations of the lake sediment, including estimating the actual P retention and its predicted change caused by the considered measure, are an important means for choosing the most appropriate restoration technique and to determine whether restoration was successful. However, our questionnaires and literature study reveal that, in the past, pre-restoration investigations were frequently either omitted or inadequate. Consequently, effectiveness of lake restorations was often low. In contrast, appropriate pre-restoration investigations, increase the prospect of success. Our cost-benefit estimation proves that pre-restoration investigations, though expensive, reduce costs of lake restorations and increase the cost-benefit relationship (Appendix 1). Last years research has improved the knowledge of the complex coupling of the chemical cycles involved, and of the chemical and biological processes in the lake ecosystem. However, it is still difficult to estimate the effects of a technical measure, because we lack investigation methods that record the involved processes with the necessary temporal and spatial resolution. To evaluate internal measures, the P release potential and the P release rate are necessary. In this dissertation, the methods to determine the P release potential and the P release rate are developed, described, exemplified, compared, and their advantages and disadvantages are discussed. The P release potential can be derived from the change of total phosphorus in the sediment depth profile, from P binding forms, or from P desorption experiments in laboratory (Chapter 3). The P release rate can be measured in the water column as increase of phosphorus in core experiments, in flux chambers, or in the hypolimnion of stratified lakes. Alternatively, the P release rate can be determined from P concentration gradients at the sediment-water interface with filtration, centrifugation, microsensors, or dialysis samplers (Chapter 4). Special attention of this dissertation is focussed on pore water inheterogeneity because in might result in incorrect P release rates. A new device, a two-dimensional pore water sampler, was developed to measure pore water P concentrations with high horizontal and vertical resolution. The new device is shown to be applicable to particular lakes to determine how many independent measurements are necessary to get reliable results. Our use of the two-dimensional pore water sampler determined biological activity as the main cause of the spatial heterogeneity of pore water P concentrations and revealed that the spatial variability is larger in shallow lakes than in deep lakes. The variability should be taken into account when planning a sampling program or evaluating results (Appendix 2). The proposed sediment investigation methods to determine the P release potential and the P release rate are used at Lake Auensee to demonstrate their use for choosing the most appropriate restoration technique. The case study of Lake Auensee points out that only a combined interpretation of P release potential and P release rate leads to the correct conclusion (Appendix 3). Post-restoration investigations are necessary to check whether a restoration was successful or not, and to gain scientific insight. A study of Lake Süsser See is used as an example for post-restoration investigations of the sediment. Core experiments and a conceptual model are used to show that a buried layer, even with P sorption capacity, has no impact on the P release (Appendix 4). Furthermore, the surveys and critical evaluations contained in this dissertation should decrease the gap between scientific understanding of processes in a lake and practical water management.