Hintergrund: Das Vorhofflimmern ist die häufigste Rhythmusstörung des Menschen. Eine gesteigerte Expression des Na+/Ca2+-Austauschers (NCX) ist dabei eine von zahlreichen elektrischen Remodeling-Mechanismen, die bei diesem Krankheitsbild beobachtet werden. Der unabhängige, also in Abwesenheit anderer Remodeling-Mechanismen bestehende Einfluss einer gesteigerten NCX-Aktivität auf die atriale Proarrhythmie ist allerdings immer noch unzureichend untersucht. Der zugrundeliegende Mechanismus des Vorhofflimmerns basiert zumindest teilweise auf einer spontanen atrialen Aktivität in Form der Ausbildung von spontanen Aktionspotentialen (sAPs). Dabei führt eine spontane Ca2+-Freisetzung aus dem sarkoplasmatischen Retikulum (SR) zu einer NCX-vermittelten Ca2+-Extrusion, die einen von NCX getragenen Einwärtsstrom (INCX) genereriert, welcher wiederum eine Depolarisation des Membranpotentials (DAD, delayed afterdeplorazition) nach sich zieht. Diese kann, sofern sie das kritische Membranpotential zur Reaktivierung des Natrium-Stroms (INa) überschreitet, ein sAP induzieren, welches letztendlich das Vorhofflimmern auslösen kann. Methoden: In der vorliegenden Arbeit wurden isolierte atriale Herzmuskelzellen von homozygoten NCX-Überexpressor (OE) und heterozygoten NCX-Knockout (KO) Mäusen und deren korrespondierenden Wildtypen (WTOE und WTKO) mit der Ca2+-imaging- und der patch-clamp-Methode, sowie mit molekularbiologischen und histologischen Methoden untersucht. Ergebnisse: Eine gesteigerte bzw. verringerte atriale NCX-Expression und –Aktivität wurde mithilfe eines Immunoblots, durch eine veränderte NCX-vermittelte Ca2+-Extrusionskapazität und durch Messungen des INCX bestätigt. Das Vorhofgewicht, die Zellgröße, die elektrische Zellkapazität und Fibrosefärbungen ergaben keinen Anhalt für ein strukturelles Remodeling in den untersuchten Mauslinien. Es gab weder Unterschiede in der Anzahl von spontanen Ca2+-Freisetzungen aus dem SR noch in der SR-Ca2+-Beladung. Die Anzahl von DADs, die während eines proarrhythmischen Stimulations-Protokolls auftraten, war im OE im Vergleich zum WTOE und im KO im Vergleich zum WTKO unverändert. Allerdings wurden DADs im OE im Vergleich zum WTOE signifikant häufiger in sAPs übersetzt. Komplementär dazu wurden im KO im Vergleich zum WTKO DADs tendenziell aber statistisch nicht signifikant seltener in sAPs übersetzt. Unter Verwendung eines aggressiveren proarrhythmischen Protokolls in KO und WTKO zeigte sich eine signifikant geringere Übersetzung von DADs in sAPs. Im OE zeigte sich eine erhöhte DAD-Amplitude im Vergleich zum WTOE und komplementär dazu eine Verringerung der DAD-Amplitude im KO im Vergleich zum WTKO. Messungen der L-Typ Ca2+-Ströme (ICa,L) zeigten einen vergrößerten Strom im OE und einen verringerten im KO, bezogen auf WTOE bzw. WTKO. Versuche mit einem Ca2+-Chelator ließen auf eine direkte funktionelle Interaktion zwischen NCX und L-Typ Ca2+-Kanälen (LTCC) schließen. Der K+-Strom (IKtot) war im OE verstärkt und im KO verringert im Vergleich zu den korrespondierenden Wildtypen. Schlussfolgerung: In atrialen murinen Herzmuskelzellen führte eine gesteigerte NCX-Aktivität zu einer erhöhten Anfälligkeit gegenüber sAPs, während eine verminderte NCX-Aktivität zu einem 101 Schutz vor dem Auftreten von sAPs führte. Die vorliegende Arbeit legt die folgenden Mechanismen nahe: Eine gegebene spontane Ca2+-Freisetzung induziert über NCX eine DAD, wobei die Amplitude der DAD direkt abhängig von der NCX-Aktivität ist. Sobald eine DAD die Reizschwelle für die Aktivierung von Na+-Kanälen überschreitet, wird ein sAP ausgelöst. Bei, wie in dieser Arbeit beobachtet, unveränderter Anzahl von spontanen Ca2+-Freisetzungen und damit auch von DADs, machte daher im OE die höhere DAD-Amplitude das Überschreiten der spannungsabhängigen Reizschwelle von sAPs wahrscheinlicher. KO Zellen waren umgekehrt dazu durch den komplementären Mechanismus geschützt, da eine geringere DAD-Amplitude seltener die Schwelle zur Induktion eines sAPs erreichte. Die in dieser Arbeit beschriebene Interaktion zwischen NCX und ICa,L kann als additiver Mechanismus interpretiert werden, durch den im OE bei höherer NCX-Aktivität eine leichtere Reaktivierung von ICa,L erfolgt, was die Induktion eines sAPs möglicherweise zusätzlich unterstützt. Die Befunde der vorliegenden Arbeit zeigen, dass die NCX-Aktivität als unabhängiger Proarrhythmiefaktor, zumindest in den in dieser Arbeit untersuchten Modellen, die Entstehung von atrialen sAPs beeinflussen kann. Insbesondere die Befunde im KO lassen eine Inhibition von NCX zur Behandlung des Vorhofflimmerns als zukünftige experimentelle Therapiestrategie möglich erscheinen.

In dieser Arbeit wurde die Chitinsynthase von Manduca sexta untersucht. Wie alle Insekten besitzt Manduca zwei Chitinsynthase-Gene, die als MsCHS-1 und MsCHS-2 bezeichnet werden. Mittels Northern-Blots konnte gezeigt werden, dass MsCHS-1 in den ektodermalen Zellen der Epidermis und der Tracheen exprimiert wird, während MsCHS-2 ausschließlich in den entodermalen Zellen des Mitteldarms exprimiert wird. Die Untersuchung der entwicklungsabhängigen Regulation der Chitinsynthase zeigte, dass MsCHS-1 nur in den Häutungsstadien exprimiert wird, einer Phase, bei der es zur Synthese der neuen Kutikula sowie zum Wachstum der Tracheen kommt. MsCHS-2 wird hingegen nur in den Zwischenhäutungsstadien exprimiert, einer Phase, die mit der Synthese der Chitin-haltigen peritrophischen Matrix einhergeht. Die Chitinsynthese des Mitteldarms wird vermutlich vornehmlich auf transkriptioneller Ebene reguliert, da während der larvalen Entwicklung die Mengen an Chitinsynthase-mRNA und -Protein, als auch die Aktivität der Chitinsynthase weitgehend korrelieren. Diskrepanzen zwischen den getesteten Parametern weisen auf zusätzliche, posttranslationale Regulationsmechanismen hin. Bei der Analyse der Trypsin-vermittelten Aktivierung der Manduca Mitteldarm-Chitinsynthese wurde deutlich, dass die Chitinsynthase nicht direkt durch Trypsin aktiviert wird, sondern dass ein löslicher Faktor prozessiert wird, der die Chitinsynthese stimuliert. Möglicherweise handelt es sich dabei um eine Chymotrysin-ähnliche Protease, wie andere Untersuchungen des Labors gezeigt haben. Die Etablierung eines Chitinsynthase-Aktivitäts-Assays sowie eines Reinigungsprotokolls ermöglichte es die Chitinsynthase aus dem Mitteldarm zu isolieren. Das Enzym konnte dabei als aktiver, trimerer Komplex gereinigt wurde. Dieser bestand aus fünf Proteinen, bei denen es sich um Fragmente der Chitinsynthase handelt, die wahrscheinlich durch proteolytische Prozessierung entstehen.

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Voltage gated potassium channels (Kv) play a key role in the nervous system- not only due to their involvement in the action potential. Vertebrates express four subtypes, which are termed Kv1, Kv2, Kv3 and Kv4, respectively. Tsha3 is a Kv1 channel which was originally isolated from brain tissue of rainbow trout (Oncorhynchus mykiss). This channel possesses an unique amino terminus and a characteristic amino acid sequence in the T1 domain, which is engaged in the oligomerization of Kv α-subunits and is thus involved into the segregation of subfamilies. The two major goals of this thesis were the structural and functional characterization of the N-terminal cytosolic domain of Tsha3 as well as the invention of a system to gain data about the functional dynamics of full length Kv channels. Molecular biological techniques were used to isolate mRNA from trout brains, to transcribe it into cDNA and clone it into vectors. DNA from such plasmids was ligated into expression vectors for heterologous expression in E. coli, P. pastoris and Sf21 cells, with concomitant fusion of marker proteins (GFP or DsRed) or tags (6 x HisTag or StrepTagII) due to the individual experiment. Protein was overexpressed in E. coli and affinity purified to analyze separated domains with biochemical (SDS-PAGE and Western Blot, Pull-Down-Assay or Dot-Blot-Assay) or biophysical (CD-spectroscopy, EPR spectroscopy) efforts. The P. pastoris system to express Tsha1 was established, to generate a system for future EPR-measurements of whole Kv channels. Heterologous expression of Kv1α (Tsha3 and Tsha1) and the core domain of Kvβ in Sf21 cells was performed to analyze the subcellular distribution of the respective subunits via fluorescence microscope and via subcellular fractionation of cell lysates with downstream biochemical analyses (SDS-PAGE and Western Blot). Furthermore the gating of diverse fusion constructs of Tsha3 in co-expressions and the gating of diverse cystein substitution mutants of Tsha1 were measured via path-clamp recordings in whole cell modus. The structural analyses of the N-terminal cytosolic domain (NCD) of Tsha3 revealed that the 128 amino acid containing part before the T1-domain (Tsha3-NT) can be structurally divided into three parts of different structure and mobility. The most outward part possesses a very high mobility and is putatively unfolded as random coil. This section is expected to express no tertiary contacts. The middle part of Tsha3-NT is structured in α-helices and β-sheets and thus slightly immobile. This folded part is also assumed to build no tertiary structure and to be exposed into the cytosol. The third, which is directly neighboring the T1 domain, has the most restricted mobility of Tsha3-NT. It consists predominantly of α-helices and exhibits a tertiary structure, putatively with the T1 domain. Tsha3-NCD self-tetramerizes and oligomerizes with Tsha1, although mutations exist in Tsha3 in conserved amino acids, which were reported to function in subfamily specific hetero-tetramerization. Thus it is proven, that Tsha3 takes part in the segregation into the Kv1 subfamily. Furthermore, Tsha3 interacts with the core domain of Kvβ2 although there are also mutations in the reported consensus sequence for interaction. Association of Kvβ2 in co-expression studies directs Tsha3-DsRed fusion constructs from internal vesicular structures into the cell membrane. But the fusion with DsRed is leading to a loss of function of Tsha3 which cannot be rescued by co-expression of the chaperone Kvβ2. But- without fusion of marker proteins- Tsha3 was identified as an outward rectifier in a cooperative Bachelor Thesis. These structural data lead to the assumption, that Tsha3-NT exhibits lateral interactions and especially the helical but mobile middle part of the N-terminus can play such a role. Due to the localization next to the membrane, interactions with membrane proteins- putatively with protein cascades are possible. Although Tsha3-NT contains no reported interaction domains for protein-protein interactions, follow-up experiments should be performed to shed light on this interesting question. Tsha1 C30S C31S C180S C224A C239S C389S C424S C476S is a complete cysteine free mutant, which was identified as a functional voltage-gated potassium channel. It was expressed in and purified from eukaryotic cells (P. pastoris) and therefore it can be assumed to be properly folded and modified. After a slight optimization of the features of expression, this system can be used to reconstitute Tsha1 channels into liposomes and use them for Freeze Quench EPR to gain structural information about a Kv1 channel in the open as well as in the closed state. This is the first report of the establishment of a full length Kv for studies of structure and functional dynamics experiments.

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