La tècnica de LA-ICP/MS presenta certs avantatges respecte altres tècniques d'anàlisi molt interessants per l'aplicació en el Camp de l'estudi del Patrimoni Cultural. Per una banda l'Ablació Laser aporta la possibilitat de la presa de mostra no manual, metodologia en moltes ocasions, més adequada en termes de destructivitat que els mètodes tradicionals. D'altra banda l'ús d'un ICP/MS com a detector aporta un nivell de sensibilitat per a la detecció de majoritaris i minoritaris però també de components en molt baixes concentracions que permet l'obtenció de resultats amb molt poca quantitat de mostra. Malgrat això, el seu ús per la caracterització materials d'objectes del Patrimoni Cultural està molt restringit i fins a dia d'avui només es troben estudis aplicats a objectes ceràmics, metàl·lics i algunes aproximacions a materials d'arxiu, però no en l'aplicació específica a obra pictòrica. Una de les restriccions més importants ve relacionada amb les dimensions dels objectes, en general massa grans per ser analitzats en equips comercials. Des d'un punt de vista analític existeixen dos aspectes importants a tenir present per la caracterització material d'aquest tipus d'objectes. Per una banda la heterogeneïtat intrínseca que presenten, fet que implica una complexitat important per la gran varietat de materials i estructures que es poden trobar. Per l'altre, la necessitat de conservar la integritat física, el que limita en molts casos la metodologia i procediments que es poden aplicar. En aquest context, l'objectiu d'aquesta tesi doctoral ha estat el desenvolupament d'un sistema de LA-ICP/MS per a la caracterització material no destructiva d'objectes del Patrimoni Cultural i la seva aplicació a diferents tipologies d'objectes, especialment a Pintura de Cavallet i Materials d'Arxiu. Dues de les aportacions més importants en el marc d'aquest treball han estat el desenvolupament d'un sistema òptic i la construcció d'una cel·la d'ablació. El sistema òptic permet dirigir el laser sobre un punt concret de l'objecte. A més permet també controlar tant el diàmetre del feix làser incident (diàmetre dels cràters d'ablació 100 µm) com la zona irradiada mitjançant una microcàmera de control. D'altra banda la cel·la d'ablació dissenyada és de fons obert i pot ser posicionada en qualsevol punt de l'objecte permetent l'anàlisi in situ sense restriccions en les seves mides, sense la necessitat d'extreure una mostra prèviament. Finalment l'aplicació de polsos successius sobre un mateix punt permet obtenir la informació estratigràfica, amb bona resolució espaial, tant en superfície com en profunditat. En l'aplicació a Pintura de Cavallet els objectius responen a l'avaluació del senyal obtingut, la capacitat d'identificar la composició tant de majoritaris com de minoritaris, així com la resolució en profunditat, per l'adquisició de la informació estratigràfica de capes pictòriques i de preparació, fent especial èmfasi en la capacitat de detectar capes primes com veladures. Aquesta fase es va dur a terme mitjançant l'anàlisi de pintures simulacre realitzades al laboratori i també amb obra real. En el cas d'obra real s'han analitzat dues pintures sobre taula, una amb tècnica al tremp Verge amb el nen i un àngel atribuïda a Jan Massys, i una a l'oli titulada Retrato de Piero de Medici 'il Gotoso', de Jacomo Pontormo. En ambdós casos s'ha determinat la composició tant de superfície com de capes subjacents i s'ha contribuït a la contextualització i atribució de les obres. En el cas de Material d'Arxiu, l'estudi s'ha centrat també en la caracterització material de manuscrits antics, fabricats a mà de draps i escrits amb tinta ferrogàl·lica. En aquest cas s'han estudiat les capacitats en termes de caracterització i distribució espaial en superfície, tant dels materials constitutius com dels efectes induïts per tractaments de conservació, en especial de desacidificació i laminació, avaluant els efectes de factors de corrosió i la seva influència en la conservació dels manuscrits. Per les dues aplicacions la tècnica ha aporta informació útil i es constitueix com una alternativa complementària a altres tècniques utilitzades en el camp com el SEM-EDX o FTIR. / Laser Ablation -ICP/MS is a technique which presents certain advantages regarding analysis of objects from Cultural Heritage field. In one hand the Laser Ablation device provides and alternative sampling procedure that may be more suitable for the analysis in this context. On the other hand the use of the ICP/MS as a detector, allows for the determination of the elemental composition in a wide range of concentrations with a minimum amount of material required. Nevertheless, its use for the material characterization of Cultural Heritage objects is highly restricted and only some experiences are published on the field of ceramic objects, metallic and some few cases study in manuscript analysis, but not on the analysis of paintings. One of the main drawbacks is the dimensions of the objects. As a consequence there are no commercially available instruments for LA-ICP/MS, including ablation cell, that permit the analysis of large objects like artworks neither Laser Ablation systems for “in situ” sampling had not been described until recently. From an analytical point of view, there are two primary concerns when characterizing works of art composition: the heterogeneity in the distribution of the components, at the macro and micro levels, and the need to preserve the physical integrity of each object In order to accomplish the analysis of objects regardless their size and material heterogenic composition, a specific optical system and ablation cell have been designed and coupled to the ICP/MS. The whole system has been applied on two different type of objects, easel Painting and Manuscripts, and some capabilities for each application evaluated. The capability of the developed LA-ICP/MS system for the analysis of paintings was evaluated in terms of damage produced on the artwork and its potential for stratigraphic composition determination by analyzing real painting such as the portrait of a member of the Medici Family attributed to Jacopo Pontormo, and a mannerist painting attributed to Jan Massys. Regarding the application to Manuscripts the main objective was the characterization of the original material composition and the effects of some restoration interventions in the pH, corrosion and degradation, evaluating the superficial resolution and the possibility to perform maps of the distribution. Results were compared with those obtained by SEM/EDX and FTIR.

L’arsènic és un element que es troba en el medi sota diverses formes químiques, cadascuna de les quals presenta una toxicitat i una reactivitat diferent. A l’aigua de mar, l’arsènic és present en concentracions baixes (0,001 mg As kg-1). Per altra banda, les algues tenen una concentració total d’arsènic molt superior (1-350 mg As kg-1). Tot i així, la fórmula química en aquest cas és predominantment la organo-metàl.lica, sobretot, com a arseno-sucres. Pel que fa a la tesi, la primera part de l’estudi experimental n’estudia la metodologia. S’han comparat diversos tipus de tractament previ de la mostra, s’han desenvolupat mètodes cromatogràfics i s’han preparat materials de referència per al control de qualitat. A la segona part, s’han analitzat mostres originàries de zones que no havien estat estudiades fins ara, com el golf Termaïc i Santorini (Grècia), la Terra del Foc (Argentina) i el Carib panameny. A més, s’ha comparat l’especiació d’arsènic dins d’estructures morfològiques d’algues brunes i com afecta el seu embarracat a la platja. També s’ha realitzat un estudi amb mostres d’aigua continental a Xile. La conca del Loa es troba en una regió minera amb uns nivells ambientals d’arsènic alts. En aquest estudi s’han trobat algues hiperacumuladores, les quals es podrien usar en estudis futurs de bioremediació. En el decurs de la tesi s’ha treballat en col.laboració amb les universitats següents: Universidad Católica del Norte (Xile), Universitat de Bremen (Alemanya), Universitat de Creta (Grècia), Universitat Aristotèlica de Salònica (Grècia). També s’ha comptat amb la col.laboració del Departament de Biologia Vegetal de la Universitat de Barcelona (UB). / Arsenic in the marine ecosystem may derive from natural sources or anthropogenic activities. Inorganic arsenic predominates in seawater. In living organisms, organoarsenic compounds were detected years ago. Marine algae contain most of their arsenic in the form of arsenosugars. In recent decades, a number of studies have described the mechanisms of the transformation and accumulation of arsenicals as well as correlations among arsenosugars and algal orders. Furthermore, there have been several reports of the potentially toxic character of such organoarsenic compounds. The presence and behaviour of arsenic compounds in algae is of interest not only to assess the pollution level in a particular zone, but to evaluate the health risk posed by the consumption of seaweed. The first part of the project was focused on the analytical procedures regarding arsenic speciation. Firstly, the effect of pre-treatments in samples and the storage condition were studied. The second study was the adaptation of our chromatographically method in order to use MSD-TOF as an analyser. The third lane followed was the preparation of reference materials. Individual solutions for each arsenosugar were prepared from algal extracts and a feasibility study was conducted on a Reference Material prepared from the alga wakame for arsenic species. The second part consisted of a series of studies in unstudied geographical zones such as Thermaikos Gulf (Greece), Santorini (Greece), Tierra del Fuego (Argentina) and Panama’s Caribbean Rivera. In addition, freshwater algae and plants from Atacama Desert in Chile were analysed. We had also compared the speciation of arsenic in different structural parts and in algae that were collected on the coast. For these studies we collaborated with the following universities: Universidad Católica del Norte, Universität Bremen, University of Creta and the Aristotle University of Thessaloniki. We had also worked with the Department of Plant Biology of the University of Barcelona.

El selenio es un elemento considerado esencial y a la vez tóxico para el organismo humano. Para establecer una correlación con la biodisponibilidad del elemento in vivo, se pueden emplear diversos métodos de bioaccesibilidad in vitro que simulen condiciones de digestión. De entre los métodos in vitro utilizados en la literatura, el método Physiologically Based Extraction Test (PBET) es uno de los métodos más sencillos y más ampliamente utilizado. La mayor parte del presente trabajo ha tratado sobre los estudios de bioaccesibilidad de selenio basados en el consumo de vegetales comestibles. Para determinar el contenido de Se en los vegetales, se diseñaron diferentes sistemas de crecimiento con condiciones controladas. En este estudio, las plantas comestibles (3 tipos de brotes y 9 tipos de vegetales) se cultivaron en dos medios suplementados (hidropónico y turba, respectivamente) para obtener plantas con un contenido de Se similar a aquéllas que crecen en zonas con una concentración de Se elevada. Para ello, se utilizaron suplementos de sales solubles de Se y el aditivo Selcote Ultra ®. Otra parte del estudio ha sido sobre la bioaccesibilidad de selenio en suelos. En el presente estudio los suelos analizados fueron procedentes del suroeste de los Estados Unidos y su contenido natural fue de 6,8 ± 0,1 mg kg - 1 y 7,6 ± 0,2 mg kg - 1. Durante el presente estudio, el contenido total de selenio y la concentración de las especies de selenio se determinaron en los diferentes materiales utilizando diversas técnicas y procedimientos. Respecto al medio hidropónico, se comprobó que el Se (VI) era más fácilmente absorbido por las plantas que la especie de Se (IV). Respecto a la determinación de Se total se observó que todos los vegetales estudiados absorbieron más cantidad de selenio a medida que aumentaba la concentración de este elemento en el medio fortificado con sales solubles, apareciendo síntomas de deterioro y de inhibición del crecimiento de los vegetales con las fortificaciones de selenio más elevadas. También se observó que las plantas crecidas en presencia del aditivo Selcote Ultra® absorbieron más lentamente el selenio presente en la turba, que las plantas crecidas con sales solubles de selenio. El selenio inorgánico absorbido por las plantas fue transformado principalmente en SeMet, excepto para las plantas del género Allium que contenían principalmente la especie γ-glutamil-Se-MeSeCys. Con respecto al trabajo experimental llevado a cabo durante la estancia de investigación en el Laboratorio de Química Analítica, Bio-Inorgánica y Medio Ambiente (LCABIE), de la Université de Pau et des Pays de l’Adour, se trabajó con diferentes técnicas y procedimientos y se consiguió ampliar la información obtenida con respecto a la especiación de Se. El método PBET se utilizó para estudiar la fracción bioaccesible de Se en suelos y plantas. Mediante la extracción PBET se comprobó que, para los suelos estudiados, la fracción considerada como bioaccesible fue atribuida principalmente a la etapa gastrointestinal del método PBET y correspondió al 50% de Se, incluyendo las especies de Se (IV) y Se (VI). Además, el método PBET de las especies de Se presentes en suelos, se equiparó a una extracción simple con ácido fosfórico. Respecto a los vegetales analizados (col y ajo), se consiguieron extraer las especies de selenio predominantes: selenometionina y γ-glutamil-Se-MeSeCys. También se observó que un porcentaje de este segundo selenocompuesto se degrada a Se-MeSeCys debido a la acción enzimática. En el caso de los vegetales, también se estudió el efecto de diferentes tratamientos aplicados previamente al método PBET (como el proceso de cocción). Se observó que el tratamiento de cocción de las muestras de col favoreció el incremento de la concentración de la especie selenometionina y redujo la concentración de Se (VI) en los extractos gastrointestinales del método PBET, debido a que un gran porcentaje de Se inorgánico se extrajo previamente en el proceso de cocción. Finalmente se han puesto de manifiesto los resultados más importantes obtenidos en el presente estudio y se han comparado con los datos encontrados en la literatura. / Selenium is considered both an essential and toxic element for the human health. Therefore, it is of great interest to study the presence and bioavailability of the selenocompounds in foods and the possible toxic effects from the ingestion of contaminated materials, which depend on their absorption and metabolism. Therefore, given the effects that different Se species can have in the organism, it is necessary to establish a method to study the bioaccessibility of this element, as a step prior to determining bioavailability. Among the in vitro methods used in the literature, the Physiologically Based Extracted Test (PBET) seems to be the easiest and most widely used method. A broader part of this study concerned Se bioaccessibility based on plant consumption. To determine the Se content in plants, different growth systems involving controlled conditions were designed. In this study, the edible plants (3 kinds of sprouts and 9 kinds of vegetables) were grown in two media supplemented (hydroponic and peat, respectively) to obtain plants with a natural Se content similar to those growing in areas with a high Se concentration. Another part of the study was about the Se bioaccessibility in soils. Little information is known about this topic, since most studies on bioaccessibility have concerned heavy metals (such as Pb, Cd, or Cr). In the present study the soils analyzed were obtained from the southwestern United States with Se natural content. During the present study, the total Se content and the concentration of the Se species were determined in the different materials using various techniques and procedures. The PBET method was then used to study the bioavailable fraction of Se in soils and plants. Finally, we highlighted the most important results obtained in the present study and we compared our results with data found in the literature.

Degut a la necessitat d’estudis sistemàtics per a l’establiment de mètodes eficaços per a la determinació d’espècies de mercuri en matrius ambientals i biològiques complexes, que assegurin la inalterabilitat de les mateixes durant la seva manipulació, aspectes que són avui dia els punts més febles en l’especiació analítica, l’objectiu de la present Tesi es basa en l’optimització de mètodes analítics per a estudiar l’especiació de mercuri en mostres del medi aquàtic mitjançant la tècnica acoblada HPLC-UV-CV-AFS. Dins d’aquest marc, la Tesi aborda uns objectius específics que es descriuen a continuació: - Optimització de totes les condicions experimentals implicades en la determinació de mercuri inorgànic i metilmercuri mitjançant CV-AFS establint, en primer lloc, les condiciones òptimes de detecció i, a continuació, estudiant la separació de les espècies mitjançant cromatografia de líquids en fase inversa; tot establint els paràmetres de qualitat per al mètode analític proposat. - Modificació i/o optimització del mètode analític per tal de determinar altres espècies de mercuri que de manera poc habitual es puguin trobar en mostres ambientals i/o biològiques. - Desenvolupament d’un mètode de preconcentració on-line per a l’especiació de mercuri en aigües. - Establiment dels efectes de pretractament en la determinació de mercuri en mostres de sediments. - Aplicació de la metodologia analítica desenvolupada a mostres ambientals i biològiques (aigües, sediments i biota) prèviament estudiant diferents mètodes d’extracció d’espècies emprant materials de referència. Els resultats obtinguts dins del tres primers objectius es mostren i es discuteixen al Capítol 3 de la present memòria; els estudis realitzats per a l’avaluació dels efectes de pretractament de mostra en sediments es descriuen al Capítol 4, i l’últim capítol descriu l’aplicació a mostres ambientals i biològiques del medi aquàtic. Als annexos I i II s’inclouen els articles científics publicats fins al moment. L’Annex I consta d’un article sobre la determinació de Hg2+ i MeHg+ en aigües contaminades mitjançant HPLC-UV-CV-AFS, mentre que a l’Annex II es troba un review sobre materials de referència certificats per a l’especiació de mercuri en matrius biològiques i ambientals. / In the present thesis, analytical methodology has been developed for mercury speciation in aquatic samples. The first part of the work consists of the optimization of the method for the separation of the species by the technique HPLC-UV-CV-AFS, another part focuses on the effects of sample pretreatment for the determination of total mercury and its species in sediments, and finally the last part consists of the application of the developed methodology to environmental and biological aquatic matrices (water, sediment and biota). Obtained results in the first part of the work are shown and discussed in Chapter 3; studies about sample pretreatment in sediments are described in Chapter 4; and the last part of the work is described in Chapter 5. Appendix I includes an article about the determination of Hg2+ and MeHg+ in polluted waters by HPLC-UV-CV-AFS, while Appendix II includes a review of certified reference materials for mercury speciation in environmental and biological matrices.

La tesi està dividida en tres parts diferenciades: una primera part on es desenvolupa un nou mètode cromatogràfic per determinar el coeficient de partició 1-octanol/aigua (log Po/w) de fàrmacs, una segona part on s’avaluen diversos descriptors de l’acidesa de l’enllaç d’hidrogen del solut per estimar el log Po/w i, finalment, una tercera part que descriu l’avaluació de la partició de fàrmacs en liposomes. En la primera part s’ha establert un mètode cromatogràfic per determinar el log Po/w de substàncies d’interès farmacèutic. En primer lloc, s’han optimitzat les condicions experimentals (columna, tipus i fracció de modificador orgànic a la fase mòbil) utilitzant substàncies d’estructura senzilla. S’ha demostrar que qualsevol columna amb fase estacionària C18 és apta i que les fases mòbils que contenen un 40-50% d’acetonitril proporcionen els resultats més acurats. El mètode s’ha validat per comparació entre els valors determinats i els valors de referència. Un cop fet això, s’ha estudiat la lipofilicitat de compostos bàsics demostrant la validesa del mètode per determinar el seu log Po/w si es treballa amb els tampons i columnes adients. En un tercer estadi s’ha avaluat la capacitat del mètode per determinar el log Po/w de fàrmacs d’estructura complexa. Els compostos han estat cedits per l’empresa Laboratoris Dr. Esteve S.A., que va mostrar interès en un mètode cromatogràfic robust per aplicar-lo en els seus procediments interns. Els compostos estudiats presenten una major complexitat estructural i provenen d’una selecció representativa de la biblioteca de compostos d’Esteve S.A.. Els resultats obtinguts demostren la capacitat del mètode per determinar el log Po/w de fàrmacs d’estructures molt diverses i la seva aplicabilitat per procediments de rutina en la indústria farmacèutica. Un cop s’ha establert el mètode cromatogràfic, s’ha seguit amb l’avaluació de diversos descriptors de l’acidesa de l’enllaç d’hidrogen dels soluts, atès que els descriptors utilitzats en la part anterior es calculen amb un programa, CODESSA, que no està a l’abast de la indústria farmacèutica ja que té un ús estrictament acadèmic. S’han considerat quatre descriptors, tres d’ells calculats a partir de la representació tridimensional de la molècula i el restant a partir de l’estructura en 2D. Els models generats a partir dels descriptors 3D depenen de la esteroisomeria i de la conformació de la molècula, i per tant, el descriptor 2D presenta una major simplicitat. Això fa que el seu ús sigui recomanable, doncs els resultats obtinguts en tots els casos són molt similars. La darrera part de la tesi ha servit per estudiar la lipofilicitat anisotròpica, mesurada com el coeficient de partició en liposomes/aigua per fàrmacs fluorescents. S’ha aplicat un nou mètode, basat en la polarització de la radiació fluorescent. Aquesta polarització depèn de la fracció de fàrmac que s’ha incorporat als liposomes, i permet calcular el coeficient de partició a partir de mesures de la polarització o anisotropia en solucions amb concentracions creixents de liposomes mantenint la concentració de fàrmac constant. Els resultats obtinguts s’han comparat amb els valors determinats aplicant les tècniques de referència (diàlisi en equilibri i potenciometria) i s’han observat algunes desviacions, possiblement degudes a la dispersió de la radiació per la presència dels liposomes en la solució. Malgrat aquests inconvenients, el procediment pot ser útil en el cas de compostos fluorescents que no es puguin estudiar amb les tècniques de referència. / Evaluation of the Lipophilicity of Drugs The study is focused to the lipophilicity assessment of drugs with diverse structures, functionalities and acid-base properties. The chromatographic method is based on a quantitative structure-property relationship method (QSPR), which permits the estimation of the log Po/w from the chromatographic retention complemented with several molecular descriptors calculated from the structure of the compound. The method was set up with a collection of ben-zene, phenol and aniline derivates and then, the experimental conditions of the chromatographic measurement were optimized. Later, the performance of the method was extended with the study of basic compounds, including several commercial drugs. This involved the use of alkaline mobile phases and, hence, columns prepared for working with them. Finally, the proposed method was used to assess the lipophilicity of drugs which showed a very complex structure and the structural descriptors were again evaluated because these drugs showed significantly different descriptor values compared to those from the substances used to establish the method. The performance of the new UHPLC systems to obtain the chromatographic data was also considered. As a consequence of the study of the structural descriptors involved in the proposed chromatographic method, the ability of several hydrogen bond acidity descriptors to complement the chromatographic retention in order to predict the log Po/w is studied. Four QSPR models are proposed, which are based on the chromatographic retention and a hydrogen bond descriptor. The four proposed models show similar statistical parameters among them, although the model which is based on the calculated Abraham hydrogen bond acidity parameter shows some advantages. This is because this parameter is easier to calculate. In the third part of the Dissertation, the evaluation of lipophilicity in liposomal systems is assessed. First, the lipophilicity of several drugs is determined by means of the reference techniques and, in a second part, a new approach is established, based on the measurement of the fluorescent anisotropy of drug-liposome solutions.

El principal objetivo de esta Tesis es el estudio de la viabilidad analítica de nuevos dispositivos electródicos como son los electrodos serigrafiados modificados con bismuto o antimonio como materiales alternativos al mercurio en la determinación y especiación de metales pesados mediante técnicas voltamperométricas. La tecnología del serigrafiado permite la fabricación de dispositivos económicos y desechables de sistemas electródicos como alternativa a los electrodos clásicos que se pueden adaptar a instrumentación portátil. Los electrodos serigrafiados (SPEs), pueden ser modificados con metales como el bismuto o el antimonio por métodos de electrodeposición vía in-situ o ex-situ, utilizando una solución de Bi(III) o de Sb(III); también pueden modificarse a través de un precursor metálico, o se puede obtener mediante la técnica de sputtering. Por otro lado existe un creciente interés en la búsqueda de materiales electródicos alternativos del mercurio, menos tóxicos que éste pero con un comportamiento electroquímico similar (amplio rango catódico de trabajo, sensibilidad y reproducibilidad), especialmente para cumplir con las crecientes demandas de dispositivos para monitoreo ambiental in-situ de metales pesados. Entre estos materiales, el bismuto y más recientemente el antimonio han demostrado tener un comportamiento analítico adecuado que los hace aparecer como una alternativa en la determinación de metales pesados mediante técnicas voltamperométricas. Para conseguir los objetivos planteados se han realizado diversos estudios que se comentan a continuación. En primer lugar se presentan los resultados obtenidos cuando se utilizan BiSPEs. Se caracterizan los dispositivos considerados (ex-situ BiSPCE, in-situ BiSPCE, BiOxSPCE y BispSPE) tanto física como analíticamente, se compara el comportamiento de los diferentes dispositivos entre ellos y el electrodo de gotas de mercurio y se aplican estos dispositivos a la determinación de Cd(II) y Pb(II) en un material de referencia (agua subterránea) y en aguas de pozo de El Salvador. Los BiSPEs demostraron ser una alternativa a los electrodos de mercurio en la determinación de estos metales. Además, de entre estos electrodos se presenta al BiSPE obtenido por técnicas de sputtering como una alternativa ventajosa a los BiFEs y a los BiSPCEs obtenidos modificando un SPCE vía in-situ o ex-situ, debido a que no es necesario ningún tratamiento antes del análisis de la muestra ya que presentan unos LOD muy favorables. El electrodo BispSPE demostró tener un comportamiento analítico similar al del HMDE en la determinación de Cd(II) y Pb(II) en muestras de aguas de pozos. En esta Tesis se ha utilizado por primera vez un electrodos serigrafiados de carbono modificados con bismuto vía ex–situ en estudios de complejación; en concreto se han estudiado las interacciones del Cd(II) con ligados de interés medioambiental por voltamperometría de impulsos diferencial y técnicas quimiométricas para el tratamiento de los datos. Estos dispositivos han demostrado ser una alternativa a los electrodos de mercurio y a los de película de bismuto en este tipo de estudios. En segundo lugar se han estudiado las posibilidades que presentan los electrodos serigrafiados modificados con antimonio en la determinación de metales pesados. En concreto se ha considerado un SPCE modificado vía in-situ y se ha aplicado a la determinación de Cd(II), Pb(II) y Cu(II) en un material certificado (agua subterránea). Este dispositivo demostró ser una opción al in-situ BiSPCE para la determinación de estos metales en particular para el Cu(II), no solo por presentar un menor LOD para este metal, sino porque no se observa competencia entre el Sb(III) y Cu(II) por depositarse en la superficie del electrodo. Como resultado de los estudios de investigación llevados a cabo en esta Tesis, se han publicado cuatro artículos en diferentes revistas científicas. Estas publicaciones son la base del trabajo expuesto en esta Tesis. / The main goal of this Thesis is to study the analytical possibilities of screen printed electrodes (SPEs) modified with bismuth or antimony as new alternative materials to mercury for the determination and speciation of heavy metals by voltammetric techniques. The screen printing technology permits the fabrication of low cost, small size and disposal devices, as an alternative to classic electrodes that can be suitable for portable instrumentation. The SPEs can be modified with metals as bismuth or antimony by electrodeposition methods via ex-situ or in-situ, also can be modified using a metallic precursor or by sputtering the metal on a ceramic substrate. First of all, SPE modified with bismuth were studied. The devices considered (ex-situ BiSPCE, in-situ BiSPCE, BiOxSPCE and BispSPE) were characterized microscopically and analytically compared between them and with the HMDE, and applied for the determination of heavy metals in natural samples. The BiSPEs proved to be an option to mercury electrodes for the analysis of these metals. Between them the electrode obtained by the sputtering techniques has demonstrated to be a good alternative to HMDE, and also to classic BiFEs. The provided LOD and LOQ for Pb(II) and Cd(II) analysis were in all cases at the level of μg L-1. Furthermore ex-situ BiSPCEs have been used for the first time for the analysis of the complexation of Cd(II) by thiol containing compounds as glutathione (GSH) and phytochelatin (PC2). The data were treated by multivariate curve resolution by alternating least squares (MCR-ALS), demonstrating that the results are in good agreement with those previously obtained with mercury electrodes. Finally, the possibilities of SPCEs modified with Sb(III) via in-situ for the determination of Cd(II), Pb(II) y Cu(II) in natural samples were studied. The SbSPEs were microscopically characterized and experimental parameters for the determination of heavy metals by anodic stripping voltammetry were optimized. The in-situ SbSPCE demonstrated to be a good alternative to in-situ bismuth film electrodes for the determination of these metals ions in particular for copper, since no competition between copper and antimony for surface sites was noticed.

La presencia de contaminantes de origen natural en productos destinados al consumo humano ha suscitado una gran preocupación en los últimos años debido al mayor conocimiento de sus efectos nocivos para la salud humana. Por este motivo, los organismos responsables de velar por la salud de los ciudadanos, han decretado los niveles máximos permitidos de dichos contaminantes en alimentos y aguas. Se requiere pues metodología analítica que permita la determinación fiable de dichos contaminantes en las matrices correspondientes a los bajos niveles requeridos por la legislación. En la presente Tesis Doctoral se ha estudiado el potencial analítico y la aplicabilidad del acoplamiento cromatografía líquida-espectrometría de masas en tándem (LC-MS/MS) con analizador de triple cuadrupolo (QqQ), en el campo del análisis de tóxicos de origen natural en muestras alimenticias y mediambientales. El elevado potencial de esta técnica ha permitido el desarrollo de metodología analítica rápida, sensible, selectiva y fiable para la determinación de dichas toxinas. Además, todos los métodos de análisis desarrollados se han validado siguiendo los criterios de calidad recogidos en las guías europeas, desde el punto de vista cualitativo y cuantitativo, con el fin de que los datos obtenidos presenten elevada fiabilidad. La investigación realizada en esta Tesis Doctoral se estructura en dos bloques, estudiándose en el primero de ellos las toxinas correspondientes al grupo conocido como micotoxinas, mientras que el segundo está dedicado a las ficotoxinas. Esta estructura se ha elegido para agrupar los trabajos según los tóxicos y el tipo de matrices estudiadas. En el primer bloque se han desarrollado metodologías para el análisis de micotoxinas en alimentos en su mayoría de origen agrícola. En el primer trabajo se ha estudiado el potencial de la cromatografía líquida de ultra resolución acoplada a espectrometría de masas en tándem (UHPLC-MS/MS) para el desarrollo de un método multianalito que permita la determinación simultánea de las micotoxinas legisladas, con propiedades físico-químicas muy diferentes, de manera rápida, sensible y selectiva. Se evaluó las diferentes opciones que permitieran realizar una correcta cuantificación de las muestras, seleccionando el calibrado en matriz como la opción más favorable. Esta metodología se validó y aplicó al análisis de diferentes muestras pertenecientes a cereales y alimentos infantiles. En el segundo trabajo se amplió el número de analitos, introduciendo micotoxinas estructuralmente relacionadas. Se estudió el potencial de esta técnica para el análisis de un elevado número de matrices utilizando la aproximación “dilute and shoot† con el objetivo de poder determinar simultáneamente todos los compuestos seleccionados en una única inyección. Se consiguió validar la metodología analítica para todos los compuestos legislados a concentraciones inferiores a las establecidas por el reglamento de la Comisión Europea. Esta metodología se aplicó al análisis de muestras pertenecientes a un estudio de dieta total (EDT) de la Comunidad Valenciana mediante el cual se pretendió determinar la ingesta de este tipo de contaminantes en los productos de consumo más habituales en la población de esta región. El tercer y cuarto trabajo abordan distintos problemas analíticos surgidos en el desarrollo de la metodología multianalito. En el tercer trabajo se puso especial énfasis en aumentar la sensibilidad de la metodología analítica con el fin de determinar concentraciones sub-µg/kg de determinadas aflatoxinas y ochratoxina A en muestras de alimentos destinadas a bebés y niños de corta edad, según se establece en la regulación establecida por la Comunidad Europea. Se evaluó el uso de la extracción en fase sólida (SPE) como la opción que permite la preconcentración de los analitos y purificación de los extractos, comparando el uso de diferentes materiales. Se observó que los mejores resultados se obtenian mediante el uso de cartuchos de inmunoafinidad, destacando su elevada selectividad para las micotoxinas objeto de interés. En la última parte de este primer bloque se desarrolló metodología analítica para la determinación de la micotoxina patulina, la cual, debido a sus propiedades físico-químicas, no pudo ser incluida en los métodos multianalito. Debido a su elevada polaridad y bajo peso molecular se requirió una cuidadosa optimización del tratamiento de muestra, así como de las condiciones cromatográficas y espectrométricas. Se comparó el uso de dos fuentes de ionización a presión atmosférica, la ionización electrospray (ESI) y la ionización química a presión atmosférica (APCI). Mediante el uso de la APCI se consiguió minimizar los problemas de supresión iónica debidos a la matriz observados en la fuente ESI. De este modo se consiguió la determinación de este compuesto en productos derivados de manzana, tanto sólidos como líquidos. En el caso de los productos sólidos se realizó una extracción sólido-líquido, mientras que en el caso de las muestras líquidas se llevó a cabo la inyección directa en el sistema cromatográfico tras una etapa de dilución. El segundo bloque aborda el análisis de ficotoxinas en muestras ambientales y alimenticias. En el primer trabajo de este bloque se desarrolló metodología analítica para la determinación de microcistinas y nodularina, toxinas procedentes de algas cianobacterianas, en aguas superficiales y de consumo. En este caso, al igual que en las micotoxinas, se pretendía desarrollar un método multianalito que permitiera la detección simultánea de la nodularina y las seis microcistinas seleccionadas. Se estableció el objetivo de poder determinar cada una de las toxinas seleccionadas a concentraciones inferiores a 1 µg/L (límite máximo establecido en la legislación Española para la microcistina LR). El procedimiento desarrollado incluyó una etapa de pre-concentración de los analitos en línea con el sistema UHPLC-MS/MS, el cual, con la inyección de 1 mL de muestra y de una manera totalmente automatizada, consiguió alcanzar las concentraciones deseadas. Para finalizar, en el segundo trabajo de este bloque se desarrolló metodología analítica basada en cromatografía líquida de alta resolución acoplada a espectrometría de másas en tándem (HPLC-MS/MS) para la determinación simultánea de toxinas marinas pertenecientes a diferentes grupos o familias. Este hecho aumentó la dificultad de la tarea ya que se pretendía la determinación de compuestos iónicos simultáneamente con compuestos de mayor apolaridad mediante cromatografía de fase reversa. Para ello se hizo uso de cromatografía de pares iónicos con el objetivo de aumentar la retención de los compuestos iónicos. Esta metodología se aplicó al análisis de muestras de vieiras contaminadas naturalmente en un “bloom† de algas tóxicas y sometidas posteriormente a un proceso de depuración, en las que se detectó la presencia de ácido domoico. El estudio de la concentración de ácido domoico en muestras tomadas a diferentes días posteriores a su contaminación permitió establecer la cinética de depuración de este contaminante en este tipo de organismos bivalvos.

La present tesi s'ha desenvolupat dintre de la línia de recerca que el grup té sobre el desenvolupament de nous sorbents polimèrics per a aplicar-los com a sorbents en extraccions en fase sòlida. En aquest cas, els sorbents sintetitzats són altament selectius per a la molècula d'interès i es coneixen com a sorbents d'empremta molecular. Pel que fa al mètode de síntesi s'han explorat diferent tipus de polimeritzacions així com diferents tipus d'interacció entre els components que constitueixen el polímer a fi de millorar tant el procés de síntesi com el reconeixement de la molècula objectiu un cop obtingut el polímer per tal d'obtenir extraccions altament selectives. Aquest sorbents s'han aplicat per a l'extracció de compostos considerats com a contaminants orgànics emergents en mostres tant d'orina humana com aigües de riu o de depuradora amb resultats satisfactoris en tots els casos, demostrant que aquest sorbents són una bona opció a l'hora de realitzar extraccions altament selectives. / The present thesis has been developed within the research trend that the group has on the development of new polymeric materials for their used as sorbents in solid-phase extraction. In this case, the sorbents synthesised are highly selective for the molecule of interest and are known as molecularly imprinted polymers. Regarding the synthesis of these polymers, several polymerisation protocols as well as several kinds of interactions that can be established between all the components involved in the synthesis of the polymers have been exploited. The sorbents obtained were further applied in the selective extraction of several compounds framed within the group of emerging organic pollutants from human urine, river water or effluent water from sewage plants. In any case, a successful extraction of the target analyte was easily achieved by using any of the sorbents developed, thus proving that these sorbents are a good option when aiming to selectively extract the compound of interest from highly complex matrices.

L’estudi de la presència i distribució dels contaminants orgànics persistents en el medi ambient és avui dia un tema de gran interès social degut als efectes nocius que aquests compostos provoquen en el organismes vius i a la seva capacitat per a bioacumular-se a través de la cadena tròfica. A més dels compostos que es troben en el llistat de substàncies perilloses del Conveni d’Estocolm (bifenils policlorats (PCBs), policlorodibenzo-p-dioxines i furans (PCDDs/Fs) i pesticides organoclorts), alguns que s’hi han afegit recentment (2009) com els polibromodifenil èters (PBDEs) o sulfonats de perfluorooctà, en els últims anys s’ha detectat en el medi ambient la presència de nous contaminants com les parafines clorades (CPs). Aquest fet, ha comportat que s’hagi proposat la seva inclusió en el llistat de compostos que s’estan avaluant per ser inclosos en el Conveni d’Estocolm i s’hagin inclòs en la directiva marc de l’aigua de la Unió Europea. Atès que la informació que es disposa actualment relativa a la seva presència i distribució en el medi ambient és encara limitada, és d’interès disposar de mètodes d’anàlisi ràpids i fiables que permetin la seva determinació amb una elevada sensibilitat i selectivitat L’objectiu principal d’aquesta tesis és el desenvolupament de metodologies analítica per a l’anàlisi de CPs i d’altres contaminants orgànics persistents per tal de estudiar la seva presència i distribució en mostres ambientals i alimentàries. En una primera part de la tesi s’ha estudiat l’aplicabilitat de l’extracció assistida per microones com a alternativa a les tècniques d’extracció tradicional per l’anàlisi de CPs en mostres de sediments, per tal de disposar d’un mètode ràpid i senzill per l’anàlisi d’aquest compostos en matrius abiòtiques d’elevada complexitat. Tanmateix, s’ha avaluat l’aplicabilitat d’un mètode multi-component per l’anàlisi de mescles de CPs i d’altres famílies de contaminants, com les PCDD/Fs, els PCBs i els PBDEs, en mostres de bivalves i peixos destinats al consum humà. En ambdós casos, els mètodes s’han aplicat a l’anàlisi de CPs i altres contaminants en sediments d’origen fluvial i marí fortament influenciats per l’activitat industrial i en productes del mar procedents d’àrees d’especial interès pesquer i ecològic, com és el Delta de l’Ebre. En una segona part d’aquesta tesi s’ha estudiat l’aplicabilitat de la cromatografia de gasos multidimensional integrada (GCxGC) per a la separació i caracterització de mescles de CPs i la seva determinació en mostres ambientals. Amb aquest objectiu, en primer lloc es van estudiar diferents combinacions de columnes en les dues dimensions per tal d’aconseguir la màxima separació entre els components de les mescles i estudiar la seva composició i naturalesa. En segon lloc, es va desenvolupar un mètode GCxGC acoblat amb un espectròmetre de masses amb analitzador de temps de vol (TOF-MS) per dur a terme la identificació i quantificació de les CPs en mostres ambientals. Per altra banda, s’ha avaluat la capacitat de la GCxGC en l’anàlisi de CPs i d’altres contaminants, com els PCBs i els PBDEs, en mostres de sediments per tal de disposar d’un mètode ràpid i fiable per a la determinació conjunta d’aquestes tres famílies de compostos. Finalment, en aquesta tesi s’ha estudiat l’aplicabilitat de l’acoblament GCxGC-MS amb analitzador quadrupolar com a alternativa al TOF, per a l’anàlisi de mescles de CPs. En aquest sentit s’ha pogut demostrar la idoneïtat d’aquest tipus d’analitzador, treballant en condicions que proporciona la màxima velocitat d’adquisició sense perdre informació espectral, ja que permet acostar-se a les prestacions del TOF i, en conseqüència, es pot utilitzar per l’anàlisi i caracterització de mescles de CPs i d’altres famílies de contaminants. / Today, the study of the presence and distribution of the persistent organic pollutants (POPs) in the environment is a matter of social interest since these compounds cause harmful effects on living organisms and exhibit a high capacity to bioaccumulate through the trophic chain. In recent years, new persistent pollutants, such as chlorinated paraffins (CPs), have been detected in the environment. These compounds show similar characteristics and properties than those included into the Stockholm Convention list, the initial one with polychlorinated biphenyls (PCBs), polychlorodibenzo-p-dioxins and dibenzofurans (PCDD/Fs), organochlorinated pesticides, and also those added later (2009), such as polybrominated diphenyl ethers (PBDEs) or perfluorooctane sulfonate (PFOS). As a consequence, CPs have been proposed to be included into the POP list of the Stockholm Convention and are considered as priority substances by the Oslo and Paris Commission (OSPAR). Moreover, they have been included in the list of priority hazardous substances in the field of water policy of the European Union (Directive 2002/45/EC). Since information about the levels and distribution of CPs in environment is still limited and the characterization and quantification of CP mixtures is a complex task, there is a need to dispose of reliable, sensitive and selective analytical methods for their determination in environmental matrices. The aim of this work is double, on the one hand the development of methodologies for the analysis and characterization of CPs and on the other, the study of their presence and distribution in environmental and food samples.

The thesis presents the development of immunochemical methods for detection of trichlorophenols (TCP) in environmental and biological samples. An indirect enzyme linked immunosorbent assay (ELISA) for 2,4,5-TCP has been developed after a rational design of the immunizing hapten chemical structure, and the screening of 12 competitor haptens. The effect of the conjugation degree of the competitors and their homology with the target analyte, the physicochemical parameters (pH, ionic strength), the concentration of detergent, the time of incubation and the specificity were studied. Two immunoassays (2,4,5- and 2,4,6-TCP ELISAs) were evaluated for the analysis of water, milk, serum and urine. Drinking water was analyzed directly after buffering the sample. The strong matrix effects in milk samples requires the sample clean up. Human serum can be analyzed after protein precipitation with absolute ethanol. The strong matrix effect of urine and its variability for samples from different individuals suggested the introduction of a purification step prior to ELISA. The C18- solid phase extraction (SPE) is an effective clean up method to remove an important part of the nonspecific interferences present in urine. The C18-SPE-ELISA method allows accurate quantification of TCPs in urine of occupationally exposed persons. SPE based on immunosorbents (immunoaffinity extraction, IAE) have been developed in single and 96-column formats. IAE is an effective clean up method to remove all nonspecific urinary interferences. The IAE step was optimized regarding sample volume, loading level, type of urine hydrolysis washing and elution conditions. The selectivity of the immunosorbents can be modulated by the washing conditions. The immunosorbents have sufficient capacity to effectively extract 2,4,6-TCP from urine samples of occupationally exposed persons and the general population. The HTS-IAE-ELISA method allows the processing of 100 samples/day with very good precision and accuracy. The method was validated with GC-MS and applied to the biomonitoring of three groups of population from Catalonia.A quenching fluorescence immunoassay based on the laser-induced fluorescence detection in microdroplets (LIF-microdroplet-QFIA) for 2,4,6-TCP has been developed as a novel biodetection system. This approach offers significant improvement in method detectability compared to the microplate immunoassays and is the first application urine samples that can be directly analyzed after sample dilution.