Los (bio)materiales compuestos conductores ((bio)compósitos) han sido en los últimos años, una interesante alternativa en el desarrollo de (bio)sensores amperométricos debido especialmente, a su capacidad de integrar varios materiales de diferente naturaleza, y formar un nuevo material con propiedades físicas, mecánicas y eléctricas muy distintas a los materiales originales que lo constituyen. Los (bio)sensores desarrollados con estos materiales presentan diferentes ventajas analíticas respecto a los conductores puros, que les proporcionan un alto valor añadido como por ejemplo, versatilidad, durabilidad, facilidad de regeneración superficial y de integración, funcionalidad como reservorio de material biológico, etc. Las propiedades eléctricas de los (bio)compósitos y, por tanto, su aplicabilidad analítica, están drásticamente influenciadas por la naturaleza de las partículas conductoras que lo forman, así como, de la cantidad y distribución espacial de las mismas en la matriz del (bio)compósito. Una de las características electroquímicas más importantes que poseen estos materiales, es la similitud en su comportamiento electroquímico respecto a (bio)sensores desarrollados con haces de microelectrodos. La presencia de áreas conductoras separadas por áreas no conductoras en la superficie del electrodo, mimetiza la distribución más o menos ordenada de microelectrodos separados entre sí por un aislante eléctrico. Las características de respuesta de los haces de microelectrodos dependen fundamentalmente, de las dimensiones y separación entre sí de los microelectrodos. De manera, que una apropiada optimización de la separación de las partículas conductoras y de su distribución interna en los (bio)compósitos desarrollados permitiría mejorar la eficacia analítica de los (bio)sensores basados en (bio)compósitos. En el trabajo de investigación presentado en esta tesis, se han implementado un conjunto de técnicas instrumentales que, aplicadas de forma estratégica y sistemática, han permitido la caracterización y optimización de la composición de (bio)materiales compuestos basados en grafito y resina epoxy (Epotek H77), permitiendo el desarrollo de (bio)sensores amperométricos más eficaces. Se ha mejorado la estabilidad y reproducibilidad de la señal, y se ha disminuido los límites de detección de forma significativa aumentando la relación señal/ruido. En primer lugar, se ha caracterizado el material compuesto de partida en función de la composición de grafito-resina presente en el mismo. Se han utilizado diferentes técnicas de caracterización que permiten obtener información de las propiedades eléctricas, electroquímicas y morfológicas del material. Se han construido electrodos compósitos de diferentes composiciones y se han caracterizando usando las técnicas de espectroscopia electroquímica de impedancias, voltamperometría cíclica, microscopia de fuerza atómica con punta conductora, microscopia electrónica de barrido, microscopia láser confocal y amperometría hidrodinámica. La utilización de estas técnicas ha permitido estudiar, el efecto que la incorporación de un tercer elemento de carácter biológico, en el material compuesto, tiene sobre la distribución espacial de las partículas conductoras que forman el biocompósito. La eficacia de estas técnicas ha quedado demostrada en la optimización de la composición (16%-17%) de un biosensor de glucosa modelo, donde la eficacia de la respuesta analítica ha sido superior a los biosensores con un contenido de grafito estándar (20%). Los nuevos criterios de optimización, han sido aplicados a biosensores basados en (bio/inmuno)compósitos, que presentan un interés relevante en aplicaciones analíticas. La respuesta analítica de los nuevos biosensores optimizados, se ha comparado con biosensores basados en el mismo tipo de (bio/inmuno)compósito que contienen un 20% de grafito, y que pueden encontrarse en la bibliografía. Concretamente, se han estudiado un biosensor de acetilcolinesterasa, aplicado a la determinación de pesticidas por inhibición enzimática, y un inmunosensor de inmunoglobulina G aplicado a la determinación indirecta de un antígeno, mediante la detección del correspondiente anticuerpo marcado. En los dos casos, se han obtenido mejoras significativas en la respuesta analítica después de la optimización de la composición del (bio/inmuno)compósito. / The conducting (bio)composites have been in the last years an interesting alternative in the development of amperometric (bio)sensors due to their great capability of integrating different kind of materials and due to the creation of a new material with different physical, mechanical and electrical properties from the originals compounds. The developed (bio)sensors with these materials present different analytical advantages regarding to a pure conductive material, for example, versatility, durability, easy surface regeneration and integration, functionality as a biological material reservoir, etc. The electrical properties of the biocomposites and, therefore, their analytical applicability are directly influenced by the conducting particles nature and the amount and spatial distribution of them inside the biocomposite. One of the most important electrochemical properties of these materials is the similarity of their electrochemical behaviour regarding to a microelectrode array. The presence of conducting areas separated by non-conducting areas on the electrode surface simulates imitate more or less an orderly distribution of microelectrodes separated by an electric insulated. The response characteristics of a microelectrode array depend on the dimensions and the separation between the microelectrodes. So, an appropriate optimization of the distance between the conducting particles and their inner distribution of the developed (bio)sensors will allow improving the analytical efficiency of (bio)sensors based on (bio)composites. In the work presented in this thesis, it has been implemented a group of instrumental techniques that, systematically applied, have allowed the characterization and optimization of (bio)composite materials composition based on graphite and epoxy resin (Epotek H77) and the development of a more efficient amperometric (bio)sensors. This efficiency has become in an improvement of the stability and signal reproducibility and, specially, an increase of the signal-to-noise ratio which has allowed decreasing the detection limits. Firstly, it has been characterized the initial composite material as function of the graphite-resin composition present on it. It has been used different characterization techniques that allow obtaining information about the electric, electrochemical and morphological properties of the material. It has been constructed composite electrodes with different compositions and it has been characterized using electrochemical impedance spectroscopy, cyclic voltammetry, current sensing atomic force microscopy, scanning electronic microscopy, confocal microscopy and hydrodynamic amperometry techniques. The use of these techniques has allowed studying the effect of incorporating a third biological compound on the composite material has on the spatial distribution of the conducting particles of the composite. The efficiency of these techniques has been demonstrated in the composition optimization (16%-17%) of a glucose model biosensor, where the analytical response efficiency is higher compared to biosensors with the standard graphite proportion (20%). The new optimization criteria have been applied to composite electrodes based on alternative biological compounds, and the analytical response of the optimized compositions was compared to the one obtained from biosensors with the standard graphite proportions (20%), reported on the literature. Concretely, it has been studied a biosensor with acetylcholinesterase, applied to pesticide determination by means of enzymatic inhibition, and an immunosensor of immunoglobulin G applied to the indirect determination of an antigen by means of the detection of their corresponding labeled antibody. In both cases, it has been obtained an improvement of the analytical response after the composition optimization of (bio/immune)composite.

En els últims anys, a causa de la necessitat de diàgnostics ràpids i de millores en sensat, s’han utilitzat nous elements de reconeixement en biosensors. Un tipus d’aquests nous elements de reconeixement són els aptàmers. Els aptàmers són cadenes sintètiques de ADN o ARN les quals són seleccionades in vitro i tenen la capacitat d’unir-se a proteïnes, ions, cèl.lules, fàrmacs i lligands de baix pes molecular, reconeixent les seves molècules diana amb alta afinitat i especificitat. Diversos biosensors basats en aptàmers, també anomenats aptasensors, han sigut desenvolupats recentment. D’entre totes les tècniques de transducció utilitzades en biosensors, l’Espectrocòpia Electroquímica d’Impedància ha sigut àmpliament emprada como a eina per caracteritzar la superficies de sensors i estudiar esdeveniments en el biosensat en la superficie d’elèctrodes. La característica més important que presenta aquesta tècnica és que no requereix cap espècie marcada per a la transducció, per tant, aquesta tècnica de detecció pot utilitzar-se per dissenyar protocols de detecció directa sense marcatge, evitant assajos més cars i laboriosos. El principal objectiu d’aquesta tesi doctoral va ser el desenvolupament d’aptasensors utilitzant la tècnica electroquímica d’impedància esmentada anteriorment. Per a això, diferents tipus d’elèctrodes van ser utilitzats, tals com elèctrodes de compòsit grafit-epoxi, elèctrodes de biocompòsit grafit-epoxi modificats amb molècules d’avidina i elèctrodes comercials serigrafiats de nanotubs de carboni de paret múltiple. El treball es va dividir principalmente en dues parts d'acord amb la detecció de dues proteïnes diferents. La primera part es va focalitzar en la detecció de trombina. Primer de tot, es van comparar i avaluar diversos aptasensors de detecció directa sense marcatge basat en diferents tècniques d'immobilització dels aptàmers, tals com: adsorció física humida, afinitat avidina-biotina i enllaç covalent mitjançant activació electroquímica de la superfície de l'elèctrode i mitjançant inserció electroquímica. Posteriorment, els elèctrodes de biocompòsit van ser comparats com a plataformes en genosensat i aptasensat. Amb la finalitat d'amplificar el senyal impedimètric obtingut utilitzant elèctrodes de biocompòsit, un protocol sàndwich va ser emprat incloent nanopartícules d'or modificades amb estreptavidina i tractament amplificador de plata. La segona part de l'estudi es va basar en la detecció de citocrom c. Primerament, es va realitzar un simple aptasensor de detecció directa sense marcatge per a la detecció d'aquesta proteïna utilitzant la tècnica d'immobilització d'adsorció física humida. Finalment, i amb l'objectiu d'amplificar el señal impedimètric, es va desenvolupar un assaig tipus sándwich híbrid d’aptàmer i anticòs utilitzant elèctrodes serigrafiats de nanotubs de carboni de paret múltiple. D'aquesta manera, la tesi explora i compara una àmplia gamma de procediments d'immobilització, l'ús de detecció directa sense marcatge o nanomaterial modificat amb biomolècules en diferents protocols directes o d'amplificació, i l'ús de reconeixement directe i sándwich per amplificar la sensibilitat i/o la selectivitat de l'assaig. / In the recent years, due to the need for rapid diagnosis and improvements in sensing, new recognition elements are employed in biosensors. One kind of these new recognition elements are aptamers. Aptamers are synthetic strands of DNA or RNA which are selected in vitro and have the ability to bind to proteins, ions, whole cells, drugs and low molecular weight ligands recognizing their target with high affinity and specificity. Several aptamer-based biosensors, also called aptasensors, have been recently developed. Among all the transduction techniques employed in biosensors, Electrochemical Impedance Spectroscopy has widely used as a tool for characterizing sensor platforms and for studying biosensing events at the surface of the electrodes. The important feature presented by this technique is that it does not require any labelled species for the transduction; thus, this detection technique can be used for designing label-free protocols thus avoiding more expensive and time-consuming assays. The main aim of this PhD work was the development of aptasensors using the electrochemical impedance technique previously mentioned for protein detection. For that, different types of electrodes were used, such as Graphite Epoxy Composite electrodes (GECs), Avidin Graphite Epoxy Composite electrodes (AvGECs) and commercial Multi-Walled carbon nanotubes screen printed electrodes (MWCNT-SPE). The work was divided in two main parts according to the detection of the two different proteins. The first part was focused on thrombin detection. First of all, different impedimetric label-free aptasensors based on several aptamer immobilization techniques such as wet physical adsorption, avidin-biotin affinity and covalent bond via electrochemical activation of the electrode surface and via electrochemical grafting were developed and evaluated. Then, AvGECs electrodes were compared as a platform for genosensing and aptasensing. With the aim to amplying the obtained impedimetric signal using AvGECs, an aptamer sandwich protocol for thrombin detection was used including streptavidin gold-nanoparticles (Strep-AuNPs) and silver enhancement treatment. The second part of the study was based on cytochrome c detection. Firstly, a simple label-free aptasensor for the detection of this protein using a wet physical adsorption immobilization technique was performed. Finally, with the goal to amplify the impedimetric signal, a hybrid aptamer-antibody sandwich assay using MWCNT-SPE for the detection of the target protein was carried out. In this way, the thesis explores and compares a wide scope of immobilization procedures, the use of label-free or nanocomponent modified biomolecules in different direct or amplified protocols, and the use of direct recognition and sandwich alternatives to enhance sensitivity and/or selectivity of the assay

Els efectes dels cannabinoids en la gana en humans es coneixen des de l´antiguitat. Les experiències dels consumidors moderns de cannabis descriuen un augment en les propietats sensorials i hedòniques del menjar, que els porta a un consum impulsiu de menjar saborós. Aquests efectes són deguts a l´activació per delta9-tetrahidrocannabinol (THC), el principal component psicoactiu present en la resina de la planta de marihuana, dels receptors de cannabinoids del cervell. Els lligands endògens dels receptors cannabinoids s´anomenen endocannabinoids (eCBs), els més coneguts són 2-arachidonoyl glycerol (2-AG) i N-arachidonoylethanolamine (AEA o anandamida). 2-AG i AEA son esters o amides derivats d´àcid araquidònic, que pertanyen respectivament, a dues famílies de compostos lipídics cannabimimètics, els 2-monoacilglicerols (2-MG) i les N-aciletanolamines (NAE), que són derivats de tots els acids grassos naturals de cadena llarga. El sistema endocannabinoid té un paper clau en la regulació homeostàtica i hedònica de la ingesta de menjar. L´expressió elevada de receptors cannabinoids en àrees del cervell que regulen no només la gana sinó també el dolor, l´emoció, la cognició i les funcions motores ressalten el paper que juguen els eCBs en molts processos fisiopatològics. El sistema endocannabinoid està excessivament activat en l´obesitat. Recentment, s´ha demostrat que el sistema endocannabinoid estimula la ingesta de menjar en ratolins mitjançant un augment en la capacitat de detecció olfactiva. Un augment en l’índex de massa corporal (BMI) s´ha associat a dèficits en la capacitat olfactiva en humans. Aquestes investigacions suggereixen una possible interacció entre el sistema endocannabinoid, l´olfacte i l´obesitat. ECBs i cannabimimètics s´estan avaluant en l´actualitat com a biomarcadors d´una sèrie de condicions fisiopatològiques. El fet que les concentracions de eCBs en matrius biològiques no són intercanviables entre laboratoris, limita la seva utilitat per recerca clínica i traslacional. Per superar aquests problemes els investigadors han de prendre una sèrie de mesures en l´obtenció de la mostra, la preservació, el processament i l´anàlisi. La generació artefactual de 2-MG en plasma, la isomerització química de 2-MG i la generació artefactual de NAE en sang són alguns dels reptes a superar. Els objectius principals d´aquesta tesi són i) desenvolupar i validar metodologia analítica per quantificar eCBs i cannabimimètics en plasma humà per utilitzar com a biomarcadors en estudis clínics i traslacionals; ii) avaluar la interacció entre el sistema endocannabinoide, la capacitat olfactiva i la obesitat. En la primer part d´aquesta tesi s´ha validat un mètode analític per la determinació d´una sèrie de 2-MG i NAE en plasma i on s´han superat i/o controlat la major part de factors que contribueixen a la variabilitat en la quantificació de eCBs i compostos relacionats. La troballa més important és que la generació artefactual de 2-MG en plasma es pot controlar utilitzant l´inhibidor de lipases Orlistat. En la segona part d´aquesta tesi s´ha avaluat la funció olfactiva i s´han mesurat les concentracions plasmàtiques d´eCBs i cannabimimètics en un estudi observacional de 161 dones amb un rang de BMI des de baix pes a obesitat mòrbida. Els resultats principals d´aquest estudi mostren que les persones amb obesitat tenen una menor capacitat olfactiva que les persones no obeses i que concentracions plasmàtiques elevades de 2-AG estan associades a una menor capacitat olfactiva. Confirmant estudis anteriors, les concentracions elevades de 2-AG estan associades a un BMI elevat i a obesitat. / The effects of cannabinoids on appetite in humans have been known since ancient times. Following cannabis smoking modern users report an intensification of the sensory and hedonic properties of food, which impels the over-consumption of palatable food. These effects are mediated by activation of brain cannabinoid receptors by delta9-tetrahydrocannabinol (THC), the main psychoactive compound present in the resin of marijuana plant. The endogenous ligands of cannabinoid receptors are called endocannabinoids (eCBs), the most known are 2-arachidonoyl glycerol (2-AG) and N-arachidonoylethanolamine (AEA or anandamide). 2-AG and AEA are ester or amide derivatives of arachidonic acid, and they belong respectively, to two families of cannabimimetic lipid compounds, the 2-monoacylglycerols (2-MG) and N-acylethanolamines (NAE). 2-MG and NAE are respectively ester and amide derivatives of all natural long-chain fatty acids. The eCB system is a key regulator of both the homeostatic and hedonic regulation of food intake. The high expression of eCB receptors in brain areas that modulate not only appetite but also pain, emotion, cognition and motor functions highlight the role of the eCB in many pathophysiological processes. The eCB system is over-active in obesity. It has been recently demonstrated that the eCB system can promote food intake by increasing odor detection in mice. An increase in the body mass index (BMI) in humans has been associated to deficits in olfactory capacity. These findings suggest a possible interaction between the eCB system, olfaction and obesity. ECBs are under evaluation as biomarkers of number physiopathological conditions. The lack of interchangeability of eCB concentrations in biological matrices between laboratories, limit their usefulness in clinics and translational research. To overcome these problems researchers should take into account a number of issues concerning sample procurement, preservation, processing and analysis. The artefactual 2-MG generation in plasma, the chemical isomerization of 2-MG and the artefactual generation of NAE in blood are some of the challenges to be confronted. The main aim of this thesis are i) to develop and validate analytical methodology for the quantification of eCBs and cannabimimetic compounds to be used as biomarkers in clinical and translational studies; ii) to evaluate the interaction between the eCB system, olfactory capacity and obesity. In the first part of this thesis we have validated a method for the determination of a range of NAE and 2-MG in human plasma. We have been able to overcome and/or control most factors contributing to eCB quantification variability. The most relevant finding is that the artefactual generation of 2-MG can be controlled by using the lipase inhibitor Orlistat. In the second part of this thesis we evaluated the olfactory function and we measured the plasma concentrations of eCBs and cannabimimetics in a cross sectional study of 161 females with BMI ranging from under-weight to morbidly obese. The main results of this study show that obese subjects have a lower olfactory capacity than non-obese ones and that elevated circulating 2-AG plasma concentrations are linked to a lower olfactory capacity. In agreement with previous studies we show that elevated 2-AG concentrations are linked to high BMI and obesity.

La industria farmacéutica necesita disponer de métodos analíticos rápidos y fiables para poder controlar de forma eficiente las diferentes etapas de producción, desde la materia prima, los productos intermedios hasta los productos finales. La irrupción de la iniciativa Process Analytical Technology (PAT) ha impulsado la introducción de modernas técnicas espectroscópicas para realizar la monitorización del proceso de fabricación con el objeto de determinar parámetros críticos de calidad que conduzcan a un mejor conocimiento del producto que puede conducir a la mejora continua. En esta Tesis se realiza el estudio de la aplicación de la Espectroscopia NIR a la determinación de parámetros de interés en la fabricación de comprimidos en la industria farmacéutica con el objeto de proponer nuevas metodologías más rápidas y eficaces que serán alternativas reales a los métodos convencionales y que constituyan un avance en la implantación de PAT. Las etapas de producción de comprimidos que fueron objeto de estudio fueron el mezclado, la granulación y el análisis de parámetros de interés de los comprimidos finales. Se han realizado dos estudios críticos de los distintos métodos cualitativos y cuantitativos, aplicables a la monitorización del proceso de mezclado con el fin de elegir el mejor método para la detección del punto final de mezclado. Se estudian diferentes algoritmos a aplicar a los espectros registrados durante el mezclado que permitan obtener un punto final de mezclado que a su vez asegurará la uniformidad de la dosificación en el comprimido final. El primer estudio se ha realizado usando la espectroscopia NIR y en el segundo se ha realizado un estudio comparativo de los resultados usando los espectros NIR frente a los Raman. Se demuestra que algunos de los procedimiento descritos en la bibliografía no son adecuados para este objetivo, mientras que otros, sencillos y fáciles de desarrollar, proporcionan buenos resultados y aconsejables en esta aplicación. Otro estudio lo constituye la determinación del tamaño de partícula, que es un parámetro importante para asegurar la correcta fluidez de un granulado. Se amplió el estudio con la determinación del principio activo en granulados intermedios del proceso así como en el producto final. Finalmente, se ha establecido un método de determinación de la presión de compactación de los comprimidos. Esta propiedad es importante por su influencia en el test de disolución que será determinante para que el producto pueda ser liberado al mercado. La determinación de la concentración del principio activo (API) en los comprimidos finales tiene por finalidad el asegurar el cumplimiento de especificaciones; este método se ha validado siguiendo las guías ICH y EMA, lo que permite su aplicación en el control analítico del producto acabado en el proceso de producción. Se ha estudiado el desarrollo y optimización de una nueva metodología para desarrollar modelos de calibración que incorporen la variabilidad física producida durante el proceso de fabricación de cada formulación. Este método consiste en la adición de un conjunto de espectros proceso (espectros obtenidos por la diferencia entre los espectros de comprimidos de producción y muestras de laboratorio con la misma concentración nominal) al conjunto de muestras preparadas en el laboratorio como una forma de incorporar los cambios físicos producidos durante cada etapa del proceso de producción de comprimidos. Las metodologías desarrolladas en esta tesis aportan soluciones a situaciones reales de la industria farmacéutica y han demostrado de forma satisfactoria como la espectroscopia NIR puede ser una herramienta para el control de parámetros físicos y químicos del proceso de fabricación de comprimidos, obteniendo adecuadas capacidades predictivas. / The pharmaceutical industry needs to have fast and reliable analytical methods for efficiently controlling each of the different stages of production, from raw materials, intermediate products to finished products. The emergence of the initiative Process Analytical Technology (PAT) has promoted the introduction of modern spectroscopic techniques for monitoring the manufacturing process aimed at determining critical quality parameters that lead to a better understanding of the product and towards continuous improvement. With the goal of propose new methodologies that are real alternatives to conventional methods and also achieve a real advance in the implementation of PAT, in this thesis we study the application of NIR spectroscopy to determine the parameters of interest in the manufacturing process of tablets for the pharmaceutical industry. The stages in the production of tablets which were studied are mixing, granulation and the analysis of parameters of interest of the final tablets. Two critical studies of different qualitative and quantitative methods applicable to the mixing process monitoring were performed in order to choose the best method for detecting the end point of mixing. Different algorithms are studied to be applied to the spectra recorded during the mixing to obtain an end point of mixing, at the same time ensures the uniformity of dosing in the final tablet. The first study was conducted using NIR spectroscopy. The second is a comparative study of the results using the NIR spectra versus Raman. We show that some of the procedures described in the literature are not suitable for this purpose, while other procedures, which are simple and easy to develop, provide good results and are desirable for this application. An additional study is the particle size estimation, which is an important parameter to ensure the proper fluidity of a granulate. This study was expanded with the determination of the active principle in granular intermediate process and in the final product. Finally, we have established a method for the determination of the compaction pressure of the tablets. This compaction property is important for its influence on the dissolution test that will determine that the product can be released to the market. The determination of the concentration of active principle (API) in the final tablets aims to ensure compliance with specifications, this method has been validated following the ICH guidelines and EMA, allowing its application in analytical control of the finished product in the production process. We have studied the development and optimization of a new methodology to develop calibration models that incorporate physical variability produced during the manufacturing process of each formulation. This method consists in adding a set of process spectra (spectra obtained by the difference between the spectra of production tablets and laboratory samples with the same nominal concentration) to the set of samples prepared in the laboratory as a way to incorporate the physical changes during each stage in the production process of the tablets. The methodologies developed in this thesis provide solutions to real situations in the pharmaceutical industry and have successfully demonstrated the ways that NIR spectroscopy can be a suitable tool for controlling physical and chemical parameters within the tablet manufacturing process, obtaining thus adequate predictive capabilities

La industria en general, y particularmente la química y la farmacéutica, necesita mejorar la eficiencia de los procesos de producción, para asegurar la obtención de productos con una elevada calidad y a la vez reducir consumos, lo que redundará en una mejora de la productividad. Esta demanda precisa del desarrollo de metodologías analíticas simples, rápidas, fiables y de bajo coste, que puedan ser utilizadas en rutina y por personal poco cualificado, que posibiliten realizar un seguimiento de todo el proceso de producción, y si es necesario aplicar las medidas correctivas necesarias, con el objeto de obtener productos de elevada calidad. Con el objetivo de proporcionar a la industria nuevas metodologías de análisis que permitan cumplir con estos objetivos, en esta tesis se han realizado diversos estudios basados en la espectroscopia NIR y la espectrometría de movilidad iónica (IMS). En el primer estudio de la tesis se ha aplicado la espectroscopia NIR para la monitorización in-line de un proceso de esterificación enzimática de glicerina con ácido esteárico en presencia de una lipasa de Candida Antarctica, mediante la inmersión de una sonda NIR en el reactor. En los diferentes procesos realizados, la reacción enzimática conduce a la formación de diestearato y monoestearato de glicerina; no se observa la formación de triestearato. Se han desarrollado modelos de calibración PLS para cada uno de los componentes, usando los espectros registrado y los valores obtenidos por cromatografía de permeación en gel; los modelos son simples y presentan una correcta capacidad predictiva. Los métodos desarrollados se han aplicado al seguimiento de otros procesos obteniendo resultados que demuestran la utilidad del NIR en la monitorización in-line de la reacción de esterificación enzimática estudiada. El siguiente estudio ha consistido en el desarrollo de un método NIR para la determinación de los componentes de una mezcla adyuvante para un herbicida que se aplica por pulverización de una suspensión. La gran semejanza de los espectros de algunos componentes ha exigido la aplicación de un diseño experimental para la preparación de muestras, que tiene por objeto asegurar la robustez del modelo de calibración. La aplicación de los modelos construidos a muestras de lotes de producción, mostró la buena capacidad predictiva de los modelos construidos y su utilidad para controlar la composición de este tipo de mezclas. En un tercer trabajo se desarrollaron bibliotecas espectrales para la identificación de formulaciones lubricantes, que presentan espectros muy similares. El método desarrollado basado en la construcción de bibliotecas en cascada o sub-bibliotecas permite asegurar la especificidad necesaria para la discriminación entre productos que la biblioteca general identifica ambiguamente. Utilizando criterios de diferenciación más estrictos la biblioteca permite la diferenciación de formulaciones lubricantes que contienen o no aditivos en un porcentaje relativamente pequeño (0.05-0.7%). En este trabajo también se construyeron modelos PLS para la determinación de composición y viscosidad de los lubricantes. En esta tesis se han desarrollado métodos analíticos utilizando la técnica IMS, por primera vez en nuestro grupo de investigación, con el objeto de complementar algunos aspectos analíticos que no se pueden resolver mediante NIR y que son asequibles a la espectrometría de Movilidad Iónica (IMS). Esta es una nueva técnica nueva que ha sido escasamente utilizada en la industria química y farmacéutica. Se han estudiado, desarrollado y validado dos nuevos métodos analíticos, para la determinación de amina residual a lo largo del proceso de fabricación de amidoaminas y fosfolípidos, y otro para la determinación de dos principios activos (en una baja concentración) de un preparado farmacéutico. En ambos casos se han estudiado la influencia de los factores instrumentales en la respuesta IMS y realizando una optimización del método de cuantificación para conseguir la mejor respuesta instrumental y sensibilidad. Se han construido modelos multivariables que permiten la determinación de las especies de interés. Los métodos desarrollados se han aplicado al control analítico de los preparados estudiados. / The industry, and particularly chemistry and pharmaceuticals, needs to improve the efficiency of production processes to ensure obtaining the products in high quality while reducing consumption, what will result in improving productivity. This demand requires the development of analytical methodologies in simple, fast, reliable and low cost manner, which can be used in routine and by unskilled labor, which enable to track the entire production process, and if necessary, apply corrective actions, to obtain high quality products. In order to provide the industry these new methods of analysis to achieve these objectives, in this thesis there have been carried out several studies based on NIR spectroscopy and ion mobility spectrometry (IMS). In the first study of the thesis, NIR spectroscopy has been applied for in-line monitoring of enzymatic esterification process of glycerol with stearic acid in the presence of a lipase from Candida Antarctica, with a NIR immersion probe in the reactor. In the processes performed, the enzymatic reaction leads to the formation of glycol distearate and glycerol monostearate; not being observed the formation of tristearate. It has been developed PLS calibration models for each of the components, using the spectra recorded and the values obtained by gel permeation chromatography; the models were simple and had a correct prediction. The developed methods have been applied to monitoring processes, obtaining results that demonstrate the usefulness of NIR in-line monitoring of the enzymatic esterification reaction studied. The next study involved the development of a NIR method for determining components of a mixture adjuvant in an herbicide product, which was applied for spraying a suspension. The great similarity of the components spectra has required the implementation of an experimental design for sample preparation, which aim is to ensure robustness of the calibration model. The application of the models built to samples of production batches showed good predictive ability of the models constructed, and their utility for checking the composition of such mixtures. In a third work, spectral libraries were developed for the identification of lubricant formulations, which had very similar spectra. The developed method based on the construction of libraries or sub-cascading libraries, ensures the necessary specificity for discrimination between products that were unambiguously identified in the general library. Using more stringent criteria of differentiation, the library allows the differentiation between lubricant formulations which contain or not additives in a relatively small amount (0.05 to 0.7%). In this work, PLS models were also constructed for the determination of composition and viscosity of lubricants. In the present thesis, we have developed analytical methods using IMS technique for the first time in our research group, in order to complement some analytical issues that cannot be resolved by NIR and that are amenable to IMS. This is a new technique that has been rarely used in the chemical and pharmaceutical industries. There have been studied, developed and validated two new analytical methods for determination of residual amine during the manufacturing process of amidoamines and phospholipids, and one for the determination of two active principles ingredients (in low concentration) of a pharmaceutical preparation. In both cases, we have studied the influence of instrumental factors in the IMS response and we have performed an optimization of the quantification method to get the best instrumental response and sensitivity. Multivariate models were constructed which allowed the determination of the species of interest. The developed methods have been applied to analytical control of the preparations studied.

La industria farmacéutica es objeto de estrictas regulaciones que tienen por objeto asegurar la calidad de los productos que ofrecen al mercado; el aseguramiento de esta calidad se realiza mediante la determinación de parámetros de calidad a través de ensayos off-line en el producto terminado. Sin embargo, la complejidad de los métodos y la variedad de los mismos retrasa de forma importante la liberación del producto con las consiguientes pérdidas económicas y de competitividad para la empresa. Como respuesta a esta situación han surgido las iniciativas de Tecnología Analítica de Procesos (PAT) y la calidad mediante el diseño (QbD), en las que se fomenta el uso de nuevas tecnologías para asegurar la calidad de los productos terminados, controlando las diferentes etapas del proceso de fabricación, permitiendo obtener un mejor conocimiento del proceso productivo y asegurando con ello la calidad del producto final. La diversidad de determinaciones a realizar a conducido a recomendar a la espectroscopia NIR como una de las herramientas más apropiadas para PAT. Las ventajas que presenta la técnica NIR frente a otras técnicas instrumentales, la convierten en la herramienta idónea para satisfacer estas necesidades analíticas (ausencia de pre-tratamiento de muestra, nulo consumo de reactivos sin generación de residuos, fácil y rápida adquisición de resultados, entre otras). Los estudios realizados en la tesis doctoral están dirigidos a proponer y aportar soluciones conducentes a la mejora continua de la calidad en los procesos farmacéuticos. Para ello se han construido modelos de calibración multivariantes NIR para determinar los CQAs tanto de productos intermedios como finales. Los CQA seleccionados para los granulados fueron el contenido de principio activo (API), humedad, pH, tamaño de partícula y propiedades de flujo. Estos modelos se han implementado en el proceso por la empresa que permiten realizar las medidas en tiempo real, de forma no invasiva y en una zona no calificada; esto representa un ahorro muy importante en tiempo y una considerable mejora de la productividad. En otro estudio dedicado a un proceso de mezcla de pellets, se ha desarrollado un nuevo método matemático para determinar la homogeneidad de la mezcla en tiempo real durante el mezclado, además de un método NIR para cuantificar un API. La característica interesante de este estudio fue que se utilizó un equipo NIR inalámbrico, controlado a distancia, permitiendo que el equipo forme parte del proceso. Se realizó un estudio completo, planificado y ejecutado, basado en la filosofía QbD para un proceso de fabricación de un gel farmacéutico. En este estudio se definieron y evaluaron las variables del proceso, pudiendo determinar el espacio de diseño (DS). Los métodos NIR construidos permitieron determinar CQAs durante el proceso de gelificación, tales como viscosidad, pH y contenido de API y su determinación durante el proceso permite asegurar que el sistema se mantiene dentro del DS. Se ha evaluado la idoneidad de la espectroscopia NIR en la monitorización in-line de un proceso de liofilización de una mezcla de multicomponentes. En este estudio se han evaluado diversos métodos quimiométricos que permiten extraer información útil del proceso a partir de los espectros NIR. Finalmente, se han desarrollado algoritmos adecuados para extraer información acerca de la homogeneidad de distribución de un componente en cualquier imagen, sea digital o hiperespectral. Estos métodos permiten informar sobre la homogeneidad de muestras farmacéuticas solidas, como tabletas de diversos tipos (recubiertas, sin recubrimiento, efervescentes) y mezclas en polvo; así pueden proponerse las técnicas de imagen química para el establecimiento de la homogeneización de muestras sólidas. Estos estudios han demostrado que la espectroscopia NIR y las técnicas de Imagen Química son herramientas adecuadas para la Tecnología Analítica de Procesos en la industria farmacéutica. / The pharmaceutical industry is subject to strict regulations, which intent to ensure the quality of the products offered on the market. This quality assurance is done by quality parameters determination through off-line test in the finished product. However, the complexity and variety of the methods delay significantly the release of the product with negative economic consequences and loss of competitiveness for the company. In response to this situation, process analytical technology (PAT) and quality by design (QbD) initiatives emerged, which promotes the use of new technologies to ensure the quality of the finished products, controlling the different stages of manufacturing processes, allowing to obtain a better process understanding and consequently ensuring the quality of the finished product. The diversity of quality parameter determinations conducted to NIR spectroscopy was recommended as one of the most appropriate tools for PAT. The advantages of NIR technique, versus other instrumental techniques, make it the ideal tool for these analytical needs (e.g. no sample preparation, no need for reagents, easy and fast acquisition of results). The studies presented in the Doctoral Thesis are aimed to propose and provide solutions to the continuous improvement of quality in pharmaceutical processes. For this reason multivariate NIR calibration models were constructed to determine the critical quality attributes (CQAs) in both intermediate and finished product. The selected CQAs for a granulate formulation were the active pharmaceutical ingredient (API) content, moisture, pH, particle size and flow properties. These models have been implemented in the manufacturing process by the company by using non-invasively and in real-time NIR measures in a non-qualified area. This strategy represents a tremendous savings in time and a considerable improvement in productivity. In another study concerning a blending process of pellets, it has been developed a new mathematical method to determine in real time the blend homogeneity during blending and a NIR method for quantifying an API. The interesting feature of this study was that we used a wireless NIR equipment, remotely controlled, allowing the spectrophotometer forms part of the process. A full study, planned and executed, based on QbD philosophy for a manufacturing process of a pharmaceutical gel was performed. In this study, the process variables were defined and assessed allowing to design space (DS) of process to be identified. The constructed NIR methods allowed to determine the CQAs throughout manufacturing process, such as viscosity, pH, and API content. These determinations during the process allow to assure that system is within DS. The suitability of the NIR Spectroscopy for the in-line monitoring of a multicomponent mixture freeze drying process has been evaluated. In this study different chemometric methods allowing to extract useful information of process by means of NIR measures were assessed. Finally, appropriate algorithms have been developed to extract information about the homogeneous distribution of components in any image (e.g. digital or hyperspectral). These methods allow to inform about the homogeneity of solid pharmaceutical samples solid, such as coated tablets, cores, effervescent tablets and powder blends; therefore, chemical image techniques can be proposed for the establishment of the homogeneity in solid samples. These studies have demonstrated that NIR spectroscopy and chemical image techniques are adequate tools for the process analytical technology in the pharmaceutical industry.

La investigación llevada a cabo en la presente tesis doctoral describe el desarrollo de biosensores basados en membranas de polisulfona y nanotubos de carbono (PS/CNT). Este tipo de membranas ha permitido la incorporación de diferentes biomoléculas como hormonas, anticuerpos y enzimas, de manera rápida y fácil gracias a la técnica de inversión de fase. Además, el uso de nanotubos de carbono confiere al material excelentes propiedades eléctricas, permitiendo su uso como transductor. Inicialmente realizó un estudio de caracterización de la membrana mediante técnicas de microscopía como la microscopía láser confocal (CSLM), o la electrónica de barrido (SEM) para determinar su estructura, porosidad y rugosidad. La CSLM permitió además visualizar la distribución de las biomoléculas dentro de la membrana compósita. De esta manera, la deposición de membranas PS/CNT sobre electrodos serigrafíados dio lugar a la construcción de inmunosensores para la detección de la hormona hCG mediante un inmunoensayo competitivo. El principal objetivo del trabajo ha sido el desarrollo y optimización de biosensors para su posterior aplicación en el análisis de muestras reales. Con esta finalidad también se han desarrollado sensores enzimáticos empleando este tipo de membranas. Así, por ejemplo, se han estudiado diferentes estrategias para la construcción de sensores de L-lactato, y finalmente se han aplicado satisfactoriamente en el análisis de vino y cerveza. De la misma manera, se han desarrollado biosensores, también enzimáticos, para la determinación de histamina en muestras de pescado. Finalmente, se describe el trabajo realizado en la Universidad Tor Vergata de Roma. Éste consistió en la construcción de biosensores de glucosa con el objetivo de obtener respuestas de ultrasensibilidad gracias al efecto “branch point”, un proceso de competición entre dos o más enzimas para reaccionar con el sustrato. De esta manera, empleando este tipo de respuesta en el desarrollo de puertas lógicas se consigue dar una respuesta binaria en función de la concentración del analito. / The research reported in this dissertation deals with the development of biosensors based on polysulfone and carbon nanotubes (PS/CNT) membranes. This type of membrane has allowed the easy and rapid immobilization of hormones, antibodies and enzymes onto electrode surface by phase inversion technique. Moreover, the use of CNT provides a composite material with excellent electrical properties, and consequently, the possibility of acting as transducer. Initially, the membrane was first characterized using microscopic techniques such as confocal scanning microscopy (CSLM) and scanning electron microscopy (SEM) to determine its structure, porosity and roughness. In addition, CSLM also permitted to visualize the biomolecules distribution into the composite membrane. In this manner, the deposition of CNT/PS membranes onto screen-printed electrodes allowed the construction of immunosensors for the detection of hCG hormone based on a competitive immunoassay. Afterwards, given the main aim of the present work has been the development and optimization of biosensors for their further application in real samples analysis, PS/CNT membranes have been also used for the construction of enzymatic biosensors. For this purpose, L lactate biosensors have been developed using different strategies and enzymes, and finally, successfully applied in wine and beer samples analysis. In the same manner, enzymatic biosensors for histamine determination have also been developed and its response has been checked towards fish samples. Lastly, also the research work carried out in Tor Vergata University (Rome) is described. This consists in the construction of glucose biosensors with the aim of obtaining ultrasensitive responses due to the “branch point effect”; a competition process between two or more enzymes for the same substrate. In this way, this type of response has been used to develop of enzymatic logic gates capable of giving a binary response depending of analyte concentration.

La biosorció és una tècnica eficaç per a l'eliminació de metalls pesants de les aigües residuals resultants de l’activitat humana, principalment de les activitats industrials actuals. Els biomaterials provinents de residus es consideren alternatives ideals com a nous biosorbentes donada la baixa relació del seu cost amb la seva eficàcia i alta capacitat d'adsorció per a metalls pesants. Una àmplia gamma de biomaterials de baix cost provinents de residus, alguns dels quals provenen de processos d'operacions industrials a gran escala, s'han emprat amb èxit com a biosorbents aplicats a l'eliminació de metalls pesants, principalment d’aigües residuals. Com a tipus abundant de recurs biològic, els biomaterials amb base de queratina s'investiguen actualment per a aquest propòsit. Aquests biomaterials mostren una alta capacitat de biosorció de metalls pesants a causa del seu alt contingut en grups funcionals carboxil, hidroxil, amino, així com grups que contenen sofre. Aquesta tesi té a veure amb l'ús de biomaterials de queratina, especialment cabell humà, pèl de gos, plomes de pollastre i llana desgreixada, com a materials biosorbents emprats per a l'eliminació de metalls pesants de solucions aquoses. En primer lloc, es va investigar l'eliminació de metalls pesants de solucions aquoses emprant diferents tipus de cabell humà. Es va trobar que el pèl tenyit mostra les millors capacitats de biosorció per a tots els ions de metalls pesants triats. Sobre la base d'aquest resultat preliminar, es van seleccionar dues mostres de cabell humà, incloent cabell natural (H1) i cabell tenyit (H2) per mirar de comprovar-ne la seva eficàcia com a biosorbents de metalls pesants. De manera que es realitza una comparació sistemàtica del procés de biosorció per a l'eliminació d’ions com Cr (III), Ni (II), Co (II), Mn (II), Cu (II), Zn (II), Cd (II) i Pb (II) sota diferents condicions. El cabell H2 (cabell tenyit) va mostrar una millor capacitat de biosorció que el cabell H1 (cabell natural). Aquest comportament, es podria atribuir a la major àrea superficial del primer, així com a la presència de més grups sulfonat (arrel del procés de tinció), fet que és confirmat per l'anàlisi SEM i FT-IR, respectivament. Les capacitats de biosorció dels metalls pesants segueix l'ordre següent: Cu(II) > Pb(II) > Cr(III) > Zn(II) > Cd(II) > Ni(II) > Co(II) > Mn(II) per al cabell H2, i Cu(II) > Cr(III) > Pb(II) per H1, de manera que la biosorció de la resta dels metalls pesants per H1 no va ser significativa. El model de cinètica de pseudo-segon ordre és el que millor s’ajusta i prediu el comportament cinètic de biosorció dels sistemes, per a tot el temps de contacte aplicat, sent la reacció química de sorció l'etapa que controla la velocitat del procés. La capacitat de biosorció màxima de Pb(II) per H1 i H2, segons el model de l’isoterma de Langmuir és de 1,7×10-5 i 23,2×10-5 mol/g a 295 K, respectivament. L'efecte dels grups sulfonat en la superfície del cabell (H2) pot millorar la seva capacitat de biosorció, així com l'eficiència de la següent elució amb EDTA. Les mostres de cabell humà regenerades amb EDTA mostren una bona capacitat de biosorció quan es reutilitzen. Així, el cabell humà es considera un potencial biosorbent per a l'eliminació de metalls pesants de mostres aquoses. Basant-nos en els resultats anteriors, s’arriba a la conclusió que el cabell H2 (cabell tenyit) mostra la millor capacitat de biosorció, de manera que es pot pensar en mirar de modificar químicament el cabell humà, de forma adequada, per tal de millorar la seva capacitat de biosorció original. Així, el cabell humà natiu va ser tractat per un mètode d'oxidació adient, i es va avaluar i comparar el seu rendiment de biosorció respecte el cabell natiu. La composició química i la morfologia del cabell humà després del tractament d'oxidació es van comprovar per anàlisis de FT-IR i SEM, respectivament, així com després d’emprar el biomaterial tractat en el procés de biosorció de metalls pesants. El cabell humà tractat va mostrar una millor capacitat de biosorció dels metalls pesants respecte al cabell natiu, tal i com era d’esperar, a causa de la major àrea de superfície obtinguda després del tractament, i de la presència de més grups sulfonat en la superfície del biomaterial, els quals s’han format a través de la reacció d'oxidació. S’han investigat els paràmetres que afecten a la biosorció dels metalls pesants, com ara temps de contacte, el valor inicial de pH de la solució, la dosi de biosorbent i la concentració inicial dels metalls. D'acord als estudis amb els models cinètics i les isotermes, el pas limitant del procés de biosorció sembla ser la reacció química de sorció que és la causant de la formació d'enllaços químics entre els ions metàl·lics i els grups funcionals del cabell humà tractat, en la monocapa de la superfície del biomaterial. La màxima capacitat de biosorció del cabell humà tractat per Cr (III), Cu (II), Cd (II) i Pb (II) segons el model de la isoterma de Langmuir a 295 K és 9,47×10-5, 5,57×10-5, 3,77×10-5 i 3,61x10-5 mol/g, respectivament. L’energia de Gibbs estàndard de signe negatiu indica que el procés de biosorció de metalls pesants és termodinàmicament factible i de naturalesa espontània. Els grups sulfonat del cabell humà tractat (formats en el tractament d'oxidació), no només milloren la capacitat de biosorció, sinó que també ajuden a la desorció dels ions metàl·lics estudiats mitjançant l'ús de solucions d'EDTA. A més, l’elució amb EDTA és beneficiosa per a la reutilització del biomaterial. Per tant, el cabell humà tractat pel mètode d'oxidació exhibeix una capacitat de biosorció de metalls pesants satisfactòria, de manera que es pot utilitzar com a biosorbent eficaç per a l'eliminació d’aquests a partir de solucions aquoses. Es van utilitzar quatre biomaterials comuns de rebuig de base de queratina, incloent el cabell humà, el pèl de gos, les plomes de pollastre i la llana desgreixada com biosorbents per a l'eliminació de metalls pesants de solucions aquoses. El procés de biosorció es va dur a terme en diferents condicions. La capacitat total de biosorció dels quatre biosorbents generalment segueix el següent ordre: la llana desgreixada > les plomes de pollastre > el cabell humà > el pèl de gos. Aquest comportament és probablement a causa de l'oxidació parcial de la llana original arrel del procés de desgreix, i de l'àrea de superfície alta de les plomes de pollastre, fets que es van confirmar per FT-IR i SEM, respectivament. Els resultats dels estudis cinètics del procés de biosorció amb aquests materials de queratina indiquen que la sorció química és el mecanisme bàsic del procés. Les dades experimentals s’ajusten molt bé al model de la isoterma de Langmuir, i el procés de biosorció és termodinàmicament factible i de naturalesa espontània, tal i com ja s'ha indicat anteriorment en el cas del cabell humà. Aquests quatre biomaterials de queratina regenerats amb EDTA i rentats amb aigua destil·lada mostren una bona capacitat de biosorció, especialment pel cas de la ploma del pollastre (amb baix contingut de cistina) i per la llana desgreixada (que es tracta de fibra de queratina prèviament oxidada en el procés de desgreixat). Els quatre residus de biomaterials de queratina, sent materials barats i fàcilment disponibles, podrien ser una alternativa adient als adsorbents més costosos utilitzats avui en dia per a l'eliminació de metalls pesants en els processos de tractament d'aigües residuals. Sobre la base d'aquests resultats, es pot afirmar que els biomaterials de queratina assajats es poden utilitzar com a potencials biosorbents per a l'eliminació de metalls pesants, i que el cabell humà tractat amb un procediment d'oxidació pot millorar la seva capacitat de biosorció. Per tant, els altres biomaterials de queratina, incloent el pèl de gos, les plomes de pollastre i la llana desgreixada es van tractar també utilitzant el mateix mètode de modificació química. El pèl de gos tractat mostra una millor capacitat de biosorció que el pèl de gos natiu, de manera similar al cas del cabell humà. No obstant, les capacitats de biosorció de les plomes de pollastre i de la llana desgreixada no milloren després del tractament d’oxidació, probablement degut a la condició de material modificat (especialment pel cas de la llana que ha estat desgreixada previament) i degut a la naturalesa i a les propietats dels biomaterials en si mateixos. Per tant, es continua amb la caracterització del pèl de gos tractat. Es preparen els corresponents experiments de biosorció del pèl de gos tractat per tal d’investigar els efectes de diversos paràmetres com ara els temps de contacte, el pH inicial de la solució aquosa i la dosi de biosorbent. També s’utilitzen models cinètics i d'isotermes per tal d’ajustar les dades experimentals obtingudes, tal que els resultats obtinguts indiquen que la sorció química és l'etapa limitant de velocitat del procés de biosorció, i la capacitat màxima de biosorció del pèl de gos tractat per Pb (II), segons el model de la isoterma de Langmuir és de 5,79×10-5 mol/g a 295 K. El pèl de gos tractat, també es pot reutilitzar després de l’elució amb EDTA i del rentat amb aigua destil·lada, com ja s’havia vist anteriorment. En conclusió, els biomaterials de residu de base de queratina poden ser utilitzats com a biosorbents de baix cost i alta eficàcia per a l’eliminació de metalls pesants de solucions aquoses. En general, el tractament d'oxidació pot millorar significativament la capacitat de biosorció d’aquests biomaterials. Cal considerar les millors condicions pel tractament d'oxidació per cada tipus de biomaterial de queratina, per tal d’assolir la millor modificació i eficàcia d’aquest. S'espera que aquests tipus de biomaterials de queratina puguin ser aplicats a gran escala per fer front a la descontaminació de metalls pesants de les aigües residuals industrials en un futur proper. / Biosorption is an effective technique for the removal of heavy metals from wastewaters resulting from human and industrial activities. Waste biomaterials are considered ideal alternatives as novel biosorbents due to the low relatively cost-effective ratio and the high efficient adsorption capacities for heavy metals. A vast array of low-cost waste biomaterials from large-scales industrial operations have been successfully employed as biosorbents for the removal of heavy metals from wastewaters. As a kind of abundant biological resources, keratin biomaterials are investigated currently for this purpose, which show high capacity of biosorption of heavy metals due to their high contents of carboxyl, hydroxyl, amino and sulfur-containing functional groups. This thesis is concerned with the use of keratin biomaterials, specifically human hair, dog hair, chicken feathers and degreased wool, as biosorbents for the removal of heavy metals from aqueous solutions. First of all, the removal of heavy metals from aqueous solutions by different kinds of human hair was investigated. It was found that the bleached and dyed hair showed the best biosorption capacities for all checked heavy metal ions. Based on these preliminary results, two human hair samples including native hair (H1) and bleached-dyed hair (H2) were selected to do further study. A systematic comparison of biosorption performance for removing Cr(III), Ni(II), Co(II), Mn(II), Cu(II), Zn(II), Cd(II) and Pb(II) ions from aqueous solution under different conditions, was provided. The H2 (bleached-dyed hair) showed better biosorption capacity than H1 (in native). It could be attributed to the higher surface area and more number of sulfonate groups, which is confirmed by the SEM and FT-IR analysis, respectively. The biosorption capacities of heavy metals followed the order Cu(II) > Pb(II) > Cr(III) > Zn(II) > Cd(II) > Ni(II) > Co(II) > Mn(II) for H2, and Cu(II) > Cr(III) > Pb(II) for H1, and the biosorption of the rest of the heavy metals for H1 was not significant. The pseudo-second order kinetic model is more likely to predict kinetic behavior of the metal biosorption process for whole contact time range, with the chemical sorption being the rate-controlling step. The maximum biosorption capacity of H1 and H2 for Pb(II) by Langmuir isotherm model were 1.7×10-5 and 23.2×10-5 mol/g at 295 K, respectively. The effect of sulfonate groups on the human hair surface can enhance the biosorption capacity of human hair as well as the elution efficiency of EDTA solution as eluent. The regenerated human hair samples with EDTA and rinsing later with water, showed good biosorption capacities of their reuse. So, the human hair is considered as a potential biosorbent for the removal of heavy metals from aqueous solutions. Based on the above results, we can confirm that H2 (bleached-dyed hair) shows the best biosorption capacity, which inspire us to properly chemically modify the human hair to enhance its biosorption capacity. So, native human hair was treated by a proper oxidation method, and its biosorption performance was evaluated and compared with the native one. The chemical composition and morphology of human hair were analyzed by FR-IR and SEM respectively, after the oxidation treatment as well as after the metal biosorption process. The treated human hair showed better biosorption capacity for heavy metals comparing with the untreated one, as expected, due to the higher surface area after the treatment, and more sulfonate groups present on the surface, which have been formed through the oxidation reaction. The parameters affecting the biosorption of heavy metals, such as contact time, initial aqueous pH value, biosorbent dosage and initial metal concentration have been investigated. According to the kinetics and isotherm studies, the rate limiting step of the biosorption process might be the chemical sorption due to the formation of chemical bonds between the metal ions and the functional groups of the treated human hair in monolayer coverage. The maximum biosorption capacity of the treated human hair for Cr(III), Cu(II), Cd(II) and Pb(II) by Langmuir isotherm model at 295 K are 9.47×10-5, 5.57×10-5, 3.77×10-5, 3.61×10-5 mol/g, respectively. Negative standard Gibb’s energy indicates that the heavy metal biosorption process is thermodynamically feasible and spontaneous nature. The sulfonate groups on the treated human hair formed in the oxidation treatment, not only enhance the biosorption capacity, but also assist the desorption of metal ions by using EDTA. In addition, the elution using EDTA is beneficial to its reuse. Thus, the human hair treated by the oxidation method exhibits satisfactory biosorption capacity and can be used as an effective biosorbent for the removal of heavy metals from aqueous solutions. Four common waste keratin biomaterials including human hair, dog hair, chicken feathers and degreased wool were used as biosorbents for the removal of heavy metals from aqueous solutions. The biosorption process was carried out under different conditions. The total biosorption capacity of the four biosorbents generally followed the order degreased wool > chicken feathers > human hair > dog hair. This is probably due to the partial oxidation of the degreased wool and the high surface area of chicken feathers, which are confirmed by FT-IR and SEM, respectively. Kinetic results indicated that chemical sorption is the basic mechanism in the biosorption processes. The experimental data fitted very well to the Langmuir isotherm model and the biosorption process is thermodynamically feasible and spontaneous nature, as indicated previously with the human hair case. These four keratin biomaterials regenerated with EDTA and rinsed with deionized water exhibit good biosorption capacity, especially for the chicken feathers (low cystine content) and the degreased wool (oxidized keratin fiber). The four waste keratin biomaterials, being cheap and easily available materials, could be an alternative to more costly adsorbents used nowadays for the heavy metals removal in wastewaters treatment processes. Based on these results, it can be said that keratin biomaterials can be used as potential biosorbents for the removal of heavy metals, and that the human hair treated with an oxidation procedure can enhance its biosorption capacity. Therefore, the other keratin biomaterials including dog hair, chicken feathers and degreased wool were also treated by using the same chemical modification method. The treated dog hair shows better biosorption capacity than the native one, with similar behavior to the treated human hair. However, the biosorption capacities of chicken feathers and degreased wool are not improved by this method, which is probably due to the condition of modification (especially for the wool that has been degreased previously) and the properties of the keratin biomaterials themselves. Therefore, further characterization of the treated dog hair is followed. Corresponding biosorption experiments with the treated dog hair were carried out to investigate the effect of different parameters, such as contact time, pH of the solution and biosorbent dosage, as in the previous cases of study. Kinetic and isotherm models were also used to fit the experimental data, the results indicate that the chemical sorption is the rate limiting step in the biosorption process. The maximum biosorption capacity of the treated dog hair for Pb(II) by the Langmuir isotherm model is 5.79×10-5 mol/g at 295 K. The treated dog hair shows a good reusability after simple elution with EDTA and rinsing with deionized water. In conclusion, the waste keratin biomaterials can be used as low-cost and effective biosorbents to remove heavy metals from aqueous solutions. In general, the oxidation treatment can significantly enhance the biosorption capacities of the keratin biomaterials. But the different conditions of the oxidation treatment for each keratin biomaterial should be considered for the proper modification in each case. These kinds of keratin biomaterials are expected to be applied in large scale to deal with the industrial wastewaters in near future.

Els estudis realitzats en aquesta memòria tenen com a fonament tres blocs principals, tots tres centrats en un mateix objectiu: les membranes polimèriques. Aquets tres blocs són: la caracterització de les membranes, algunes aplicacions de les membranes i la síntesis de noves membranes. La caracterització de les membranes és la part més extensa de la memòria i s’ha realitzat amb dues perspectives diferenciables: Per una banda s’ha desenvolupat per primera vegada en el camp de les membranes, l’ús de la tècnica espectroscòpica d’infraroig proper (NIR) com a tècnica per poder distingir les membranes d’inversió de fase, segons si han estat preparades per evaporació o per immersió. Aquest mètode també permet classificar-les pel seu gruix, només realitzant un simple espectre d’infraroig proper de la superfície i aplicant-hi un mètode supervisat de modelatge basat en l’anàlisi de variança residual. Per una altra banda, s’han utilitzat tècniques habituals de caracterització de membranes com la Microscòpia Electrònica d’Escombrat (SEM), la Microscòpia de Força Atòmica (AFM), l’Espectroscòpia Electrònica per a l’Anàlisi Química (ESCA), les Espectroscòpies d’Infraroig (IR) o la Ressonància Magnètica Nuclear (RMN) amb l’objectiu d’estudiar les propietats físiques de les membranes. Concretament s’ha aprofundit en estudiar tres tipus de membranes polimèriques diferents: les membranes de polisulfona (PS), les membranes de polisulfona amb una capa de poliamida (PA), y les membranes d’impressió molecular (MIM). En el cas de les membranes de PS s’ha determinat quin es l’efecte d’algunes de les variables més importants que afecten a la formació de macrovoids durant la preparació d’aquestes membranes. Aquestes variables són: el gruix de membrana, la temperatura del bany de coagulació o la presència d’altres compostos químics com l’isopropil miristat (IPM) utilitzat com agent facilitador del transport. En el cas de les membranes de PS amb una capa de PA, s’ha realitzat un estudi de caracterització superficial per tal de conèixer la degradació d’aquestes membranes quan estan sotmeses a filtracions d’aigua oxigenada (H2O2) al 40%. Finalment, en el cas de les MIM s’han caracteritzat principalment per verificar la correcta formació d’aquestes membranes. Pel que fa al segon bloc sobre aplicacions de les membranes, els estudis s’han dirigit per una banda a la separació quiral dels enantiòmers D,L-propranolol i D,L-selenometionina mitjançant sistemes de diàlisis, i per l’altra banda a la reducció de la Demanda Química d’Oxigen (DQO) d’una solució d’aigua oxigenada al 40% mitjançant filtració frontal en discontinu. Més concretament, s’ha pogut comprovar que les membranes de polisulfona preparades per immersió i amb presencia d’IPM faciliten el transport per igual dels dos enantiòmers del propranolol, mentre que si a més hi afegim el compost N-hexadecil-L-hidroxiprolina (HHP) es produeix una certa enantioseparació. En el cas de la separació dels enantiomers de la D,L-selenometionina, s’ha pogut comprovar que la membrana formada pel copolímer N,N-dimetil-2-aminoetilmetacrilat ̶ etilenglicol dimetacrilat (DMAEM-EDMA) té capacitat d’interacció selectiva amb l’enantiòmer L de la selenometionina. Pel que fa la l’eliminació de la DQO en solucions de H2O2 s’ha demostrat que les membranes de nanofiltració de polisulfona amb una capa de poliamida poden disminuir la DQO de 500 ppm a 62 ppm. Finalment, en l’últim bloc destinat a la síntesis de noves membranes, s’ha realitzat la síntesis i caracterització de noves membranes preparades amb la tècnica de la impressió molecular. Per fer-ho s’han utilitzat tècniques com la polimerització per fixació radicalària utilitzant el benzoin etil èter (BEE) com a fotoiniciador sobre membranes de fluorur de polivinilidè hidrofòbic (PVDF-phob, Durapore), utilitzant 4 tipus diferents de monòmers diferents com són la 4-vinilpiridina (4VPY), l’àcid metacrílic (MAA), l’acrilamida (AAM) i el N,N-dimetil-2-aminoetilmetacrilat (DMAEM). / This thesis is divided in three sections, all of them focused on a common goal: polymeric membranes. These three sections are: the characterization of membranes, applications of the membranes and the synthesis of new membranes. Characterization of membranes is the most extensive section of this memory and has been made with two differentiated perspectives: On one hand, for the first time in the field of membranes, it has been developed the use of the Near Infrared Spectroscopic technique (NIR) as a technique to distinguish the phase inversion membranes, according if they have been prepared by evaporation or by immersion. This developed methodology also allows classifying them by their thickness, just doing a simple near infrared spectrum of the prepared membrane surface and applying a supervised modeling method based on the analysis of residual variance. On the other hand, usual techniques have been used for the characterization of membranes such as Scanning Electron Microscopy (SEM), Atomic Force Microscopy (AFM), Electron Spectroscopy for Chemical Analysis (ESCA), Infrared Spectroscopies (IR) or Nuclear Magnetic Resonance (NMR) with the aim of studying the physical properties of the membranes. Specifically, it has been studied in depth three different types of polymeric membranes: polysulfone membranes (PS), polysulfone membranes with a layer of Polyamide (PA), and molecularly imprinted membranes (MIM). In case of PS membranes, the effect of some of the most important variables that affect the formation of macrovoids during their preparation have been determined. These variables are: the membrane thickness, the temperature of the coagulation bath or the presence of other chemical substances such as isopropyl myristate (IPM) used as the carrier agent facilitator. In case of membranes with a layer of PA, it has been performed a surface characterization study, with the aim of take knowledge about the deterioration of these membranes after their use in filtration processes of 40 % of hydrogen peroxide (H2O2) solutions. Finally, the MIM have been characterized, mainly to verify their correct preparation procedure and final formation. In the second section, related with membrane applications, both chiral separation of D,L-propranolol and D,L-selenomethionine enantiomers using dialysis systems and, reduction of the Chemical Oxygen Demand (COD) of a 40% hydrogen peroxide solutions using a dead-end filtration system have been considered. More specifically, it has been proved that polysulfone membranes prepared by immersion, containing IPM, facilitate the transport of both enantiomers of propranolol, whereas if the compound N-hexadecyl-L-hydroxyproline (HHP) is also added into the membrane, a certain enantioseparation is accomplished. In case of the D,L-selenomethionine enantiomers, it has been proved that the membrane formed by the copolymer N,N-dimethyl-2-aminoethyl methacrylate ̶ ethylenglicol dimethacrylate (DMAEM-EDMA) has the capacity to interact selectively with the L enantiomer of selenomethionine. Regards to COD elimination in H2O2 solutions, it has been proved that polisulfone membranes of nanofiltration with a layer of polyamide can reduce the COD levels from 500 ppm to 62 ppm. Finally, the last section about synthesis of new membranes, comprises the synthesis and characterization of new membranes prepared by molecular imprinted technique. It has been used the technique of radical polymerization using benzoin ethyl eter (BEE) as a photoinitiator over a hydrophobic membrane of polyvinylidene fluoride (PVDF-phob, Durapore), using 4 different types of monomers such as 4-vinylpyridine (4VPY), methacrylic acid (MAA), acrylamide (AAM) and N,N-dimethyl-2-aminoethylmethacrylate (DMAEM).

La metabolòmica ha permès importants avanços en les ciències biològiques. Un nombre creixent d'estudis ecològics han aplicat un enfoc metabolòmic per respondre a preguntes ecològiques (ecometabolòmica) durant els últims anys. El treball desenvolupat al llarg d'aquesta tesi doctoral significa un pas més en el camp de la ecometabolòmica. En el primer capítol d'aquesta tesi doctoral, hem fet l'adaptació del protocol per dur a terme la metabolòmica en estudis ecològics. En ell es descriuen en detall els procediments per al camp i de laboratori per realitzar anàlisis de metabolòmica mitjançant la Ressonància Magnètica Nuclear (RMN) especroscòpica i cromatografia líquida amb espectrometria de masses (HPLC-MS), juntament amb l'anàlisi de l'estequiometria. Aquesta millora ens ha permès combinar l'estudi d'estequiometria ecològica i metabolòmica en un sol protocol i donar una visió general del que està passant amb els organismes. En el segon i tercer capítols s’ha aplicat el protocol sobre la part aèria i arrels en l’estudi dels efectes de factors relacionats amb el canvi climàtic (sequera, escalfament, els factors de risc). Els resultats confirmen la variació metabolòmica entre la part aèria i les arrels, en les diferents estacions de l’any i en diferents tractaments d'aigua. L'anàlisi ecometabolomic simultània entre la part aèria i les arrels ha proporcionat una visió completa de tota la planta, incloent la resposta dels diferents òrgans als canvis ambientals, la resposta global fenotípica i els mecanismes metabòlics subjacents a aquestes respostes. En el quart capítol es descriu la metabolòmica de fulles d’alzina (Quercus ilex) simulant un atac dels herbívors. El perfils de RMN de les fulles del Quercus ilex canvien després de la ferida. Es va observar, un marcat augment en els metabòlits secundaris rics en carboni, del quercitol i del àcid quínic, que estan relacionats amb la via metabòlica de l'àcid shiquímic. Els resultats també confirmen que l'àcid quínic i el quercitol són presents en gran contingut en el gènere Quercus i estan involucrats en els mecanismes contra factors biòtics. Finalment, el cinquè capítol estudia les relacions entre els microorganismes epífitics i la planta. L’estudi mostra que els microorganismes que viuen a la filosfera de la fulla juguen un paper important, existeixen microorganismes dins dels òrgans de la planta i les relacions que hi ha entre l’estructura i les funcions del metabolisme intern i extern de la planta. Aquests resultats aporten un major coneixement de les relacions específiques entre les plantes i les comunitats microbianes que viuen sobre i dins d'ells. / Metabolomics has allowed significant advances in biological sciences. An increasing number of ecological studies have applied a metabolomic approach to answer ecological questions (ecometabolomics) during the last few years. The work developed throughout this PhD thesis means a further step in the field of ecometabolomics. The first chapter of results of this thesis is dedicated to the adaptation of a previously described protocol to conduct metabolomics in ecological studies. It describes in detail the procedures to follow, in the field and in the laboratory, to perform metabolomic analyses using nuclear magnetic resonance (NMR) spectroscopy and liquid chromatography-mass spectrometry (LC-MS) coupled to stoichiometric analysis. This improvement allowed to combine the study of ecological stoichiometry and metabolomics in a single protocol and obtain a wider overview of what is happing to the organism. In the second and third chapters, the described protocol is applied to study how some climate change factors (drought, warming and irrigation) affect different organs of the plant (shoots and roots of Holcus lanatus and Alopecurus pratensis) at two different seasons. The results show a relationship between the metabolic variation observed in roots and the observed in shoots. The simultaneous metabolomic analysis of both organs of these grasses provide a complete view of the entire plant; including the response of different organs to environmental changes, the global phenotypic response and the metabolic mechanisms underlying these responses. The fourth chapter is dedicated to the study of the simulated attack to Quercus Ilex leaves by a herbivore. The results show differences in the 1H NMR metabolic profiles of the leaf before and after the wound. A marked increase in C-rich secondary metabolites, quinic acid and quercitol, which are related to the shikimic metabolic pathway, was observed. The results also confirm that quinic acid and quercitol are present in great content in the genus Quercus and they are involved in mechanisms against biotic stress. In the fifth chapter a study of the relationship between the epiphytic microorganisms and the plant host is described. This study highlights the large complexity of the episphere, the existence of internal microbial communities and the strong relationships between the structure and function of the internal and external plant metabolomes. These results warrant further study of the specific relationships between plants and the microbial communities living on and in them.