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Genes required for limb development have, in several instances, first been identified by studies of human diseases in which the limbs are affected. In humans, mutations in the transcription factor SALL4 results in Okihiro syndrome (OS), which is characterised by forelimb defects and the eye disorder, Duane anomaly. OS patients forelimb defects range from subtle thumb abnormalities to truncated limbs. Mutations in another gene, TBX5, cause Holt-Oram syndrome (HOS), which is defined by heart and forelimb defects. OS and HOS patients limb defects are very similar, in fact, patients that have mutations in SALL4, and thus OS, have in some cases been misdiagnosed with HOS. Studies have shown that Tbx5 performs an evolutionary conserved role in forelimb development. The similar limb phenotypes of OS and HOS patients may suggest that Tbx5 and Sall4 act in a common pathway and that Sall4 is also required for forelimb development. During my thesis work, I have investigated the function of Sall4 and I have explored the hypothetical relationship between Sall4 and Tbx5 during limb development. To perform this analysis I have used zebrafish, chick and mouse model systems. I demonstrate that in the developing zebrafish pectoral fins sall4 acts downstream of tbx5, and that sall4 is essential for pectoral fin (forelimb) development. I show that tbx5 initiates a feedforward transcriptional motif that is required to establish FGF signalling in the pectoral fin bud. My studies of sail gene family redundancy and tbx5 offer explanations for the similarity of OS and HOS patients limb defects.

Using stage-specific over-expression in transgenic <i>Xenopus</i> embryos, I show that both Wnt6 and β-catenin can negatively regulate several molecular markers for heart muscle differentiation as well as earlier heart-specific transcription factors.  In addition, Wnt6 is required for proper heart development since knockdown of XWnt6 results in a non-beating heart and up-regulation of several of these myocardial markers.  Complementary to this finding, activation of canonical Wnt signalling or over-expression of mouse Wnt6 inhibits mouse embryonic stem cell differentiation into beating cardiomyocytes.  Wnt6 functions to restrict heart muscle differentiation. Due to Wnt6 expression within the pronephritic anlage and later within the pronephritic tubules, and because this kidney specific expression is conserved in mouse where Wnt6 is expressed in the ureter bud, we investigated an additional role for XWnt6 in kidney development. Knockdown of Wnt6 studies in <i>Xenopus</i> show that Wnt6 is clearly required for pronephros development since loss of XWnt6 function results in loss of expression of a number of pronephros-specific genes including many associated with MET such as Na⁺ K⁺ATPase and NKCC2 which are required for proper tubule formation and function.  Therefore, XWnt6 is not required for those genes that require XWnt4 expression and it appears instead that these two Wnt proteins work in parallel to direct expression of different genes required for kidney development. In addition, both gain and loss of XWnt6 function result in eye phenotype and XWnt6 function is required for expression of the proneural gene, Sox2. Furthermore, it appears likely that XWnt6 signals with the Wnt receptor Frizzzled5 to regulate expression of Sox2 in the developing retina to promote proper eye formation (Van Raay, Moore et al. 2005).  In summary, XWnt6 restricts heart muscle differentiation whereas it is a positive regulator of kidney and eye development.

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Le développement dentaire est orchestré par une série de signalisations inductives réciproques entre l'épithélium dentaire et le mésenchyme, qui conduit à la formation de la dentine et de l'émail. EMMPRIN/CD147 est un INducteur des MetalloPRoteinases de la Matrice Extracellulaire (MMPs) qui régule les interactions épithélio-mésenchymateuses dans le cancer et d'autres processus pathologiques et est exprimé lors du développement dentaire. Ainsi, nous avons utilisé des souris KO pour EMMPRIN pour déterminer le rôle d'EMMPRIN dans la formation des tissus dentaires. Nous avons démontré que l’absence d’EMMPRIN conduisait dans le germe dentaire à une diminution de l’expression de MMP-3 et de MMP-20, à un retard de la dégradation de la membrane basale, à un retard de la formation de l’émail bien visible dans l'incisive à croissance continue, à une diminution du volume et de l'épaisseur d'émail, mais à une maturation amélaire normale. Ces résultats indiquent qu'EMMPRIN est impliqué dans le dialogue épithélio-mésenchymateuse pendant le développement dentaire, principalement par la régulation de l'expression de certaines MMPS. Nous avons ensuite essayé d'évaluer le rôle potentiel d'EMMPRIN dans le processus de réparation dentaire en comparant la cicatrisation de blessures pulpaires des souris KO pour EMMPRIN à des souris WT. Enfin, dans un souci de transfert vers la clinique, nous avons évalué la capacité d’extraits de pépin de raisin (connu pour être des inhibiteurs naturels de MMPs) à empêcher la dégradation de la matrice dentinaire humaine déminéralisée et traitée par MMP-3. / Tooth development is regulated by a series of reciprocal inductive signalings between the dental epithelium and mesenchyme, which culminates with the formation of dentin and enamel. EMMPRIN/CD147 is an Extracellular Matrix MetalloPRoteinase (MMP) INducer that mediates epithelial-mesenchymal interactions in cancer and other pathological processes and is expressed in developing teeth. Here we used EMMPRIN knockout (KO) mice to determine the functional role of EMMPRIN on dental tissues formation. We demonstrated that EMMPRIN deficiency results in decreased in MMP-3 and MMP-20 expressions, delayed in basement membrane degradation in tooth germ, delayed in enamel formation well distinguishable in incisor, and in decreased enamel volume and thickness but normal maturation. These results indicate that EMMPRIN is involved in the epithelial-mesenchymal cross-talk during tooth development by regulating the expression of MMPs. Then we tried to investigate the potential role of EMMPRIN in the pulp dentin repair process by comparing the healing of injured pulps of EMMPRIN KO and WT mice. Finally, we evaluated the capacity of grape-seed extracts (known to be natural inhibitors of MMPs and used in new daily mouthrinse) to prevent the degradation of human demineralized dentin matrix by MMP-3.

La plasticité phénotypique est la capacité d’un génotype donné à produire différents phénotypes en réponse à différents environnements tels que la température, la nutrition ou encore la présence de prédateurs. Ce phénomène permet aux individus de s’adapter à des environnements fluctuants. Il peut également faciliter l’évolution en élargissant la gamme de phénotypes produits par un génotype. Comme modèle de plasticité phénotypique, nous étudions la pigmentation abdominale chez les femelles Drosophila melanogaster. En effet, ce caractère est sensible à la température : les femelles drosophiles sont plus pigmentées lorsqu’elles se développent à basse température, particulièrement dans les segments abdominaux postérieurs. Les études précédentes du laboratoire ont montré que le gène tan (t), codant une enzyme de pigmentation, est beaucoup plus fortement exprimé à 18°C qu'à 29°C. Par ailleurs, ce gène joue un rôle essentiel dans la plasticité phénotypique de la pigmentation abdominale des femelles Drosophila melanogaster. Au cours de ma thèse, je me suis intéressée à la caractérisation du réseau de gènes impliqué dans la régulation de l’expression de t dans l’épiderme abdominal des femelles Drosophila melanogaster. J'ai également cherché à identifier, dans ce réseau, les acteurs pouvant médier l'effet de la température sur l'expression de t. A l'aide d'une approche gène candidat, j'ai montré que les facteurs de transcription Bric-à-Brac (Bab) et Abdominal-B (Abd-B) intervenaient dans la plasticité phénotypique de la pigmentation abdominale en régulant notamment t. De plus, j'ai réalisé un crible génétique ciblant 573 gènes codant des facteurs de transcription et des régulateurs de la chromatine afin d'identifier de nouveaux régulateurs de t. A l'issue de ce crible, j'ai obtenu une liste de 27 gènes impliqués dans cette régulation. J'ai ensuite commencé la caractérisation fonctionnelle de deux de ces candidats : forkhead box subgroup O (foxo) codant un facteur de transcription impliqué dans la voie de réponse à l'insuline et little imaginal discs (lid) codant une histone déméthylase. / Phenotypic plasticity is the ability of a given genotype to produce different phenotypes in response to different environmental factors such as temperature, nutrition or presence of predators. This phenomenon allows the adaptation of individuals to their fluctuating environments. It can also facilitate evolution, as it broadens the range of phenotypes produced by a given genotype. As a model of phenotypic plasticity, we study the abdominal pigmentation in Drosophila melanogaster females. Indeed, this trait is temperature-sensitive: drosophila females are darker when they develop at lower temperatures particularly in the posterior segments. In the laboratory, it has been previously shown, that tan (t), a gene encoding a pigmentation enzyme, is more expressed at 18°C than at 29°C. Moreover, this gene plays an essential role in the phenotypic plasticity of abdominal pigmentation in Drosophila melanogaster females. During my thesis, I aimed to characterize the gene regulatory network involved in t regulation in the abdominal epidermis of Drosophila melanogaster females. I also tried to identify, in this network, the actors mediating the effect of temperature on t expression. Using a candidate gene approach, I showed that the transcription factors Bric-à-brac (Bab) and Abdominal-B (Abd-B) are involved in the phenotypic plasticity of abdominal pigmentation by regulating t. Furthermore, I performed a genetic screen targeting 573 genes encoding transcription factors and chromatin regulators to identify new regulators of t. At the end of this screen, I obtained a list of 27 genes involved in this regulation. I then started the functional characterization of two of these candidates: forkhead box subgroup O (foxo) encoding a transcription factor involved in the insulin response pathway and little imaginal discs (lid) encoding a histone demethylase.

Une invasion biologique réussie se décompose en trois étapes : l'introduction d'une population allochtone sur une nouvelle aire de répartition géographique, l'établissement de populations viables et leur prolifération exponentielle dans l'aire d'introduction. En 2002, Shea et Chesson ont énoncé l'hypothèse d'Opportunité de Niche dans le but d'expliquer la réussite de l'établissement et de la prolifération des espèces envahissantes. Selon ces auteurs, les espèces exogènes introduites sur une nouvelle aire géographique peuvent y profiter d'une part de la diminution de la pression exercée par leurs ennemis naturels et d'autre part d'une augmentation de la disponibilité de leurs ressources. Drosophila suzukii est une de ces espèces dites envahissantes. Originaire d'Asie, sa présence est aujourd'hui largement recensée en Amérique du Nord et dans tout l'ouest de l'Europe. Depuis son introduction en 2008, en Europe notamment, l'invasion de D. suzukii est particulièrement rapide et les dégâts engendrés dans les cultures par cette espèce qui se développe sur les fruits en cours de maturité sont très préoccupants. Au cours de nos travaux, nous avons mis en évidence certains caractères chez cette espèce comme étant des éléments facilitant le succès de son invasion. D. suzukii présente tout d'abord une grande résistance face à ses principaux ennemis naturels, les parasitoïdes. Nous avons ensuite montré l'existence d'un lien entre sa capacité à mettre en échec les parasitoïdes larvaires et son importante charge hémocytaire. Par ailleurs, grâce à un échantillonnage très large, nous avons illustré la grande polyphagie de cette espèce. Ce caractère lui assure potentiellement une disponibilité en ressources tout au long de l'année. Enfin, à l'aide d'une étude portant sur les relations tritrophiques, nous avons montré que la qualité nutritive des plantes hôtes utilisées par D. suzukii peut avoir un impact sur le niveau de sa résistance aux entomophages. D. suzukii parvient en effet à augmenter sa résistance à plusieurs espèces de parasitoïdes lorsqu'elle réalise son développement sur un substrat riche en alcaloïde. Nos derniers résultats suggèrent qu'elle serait même capable de réaliser une forme d'automédication. Les différentes études réalisées au cours de cette thèse semblent confirmer que D. suzukii profite d'une opportunité de niche en Europe tempérée / Successful biological invasion is divided into three stages: the introduction of a non-native population on a new geographical area, the establishment of viable populations and their exponential growth in the area of introduction. In 2002, Shea and Chesson proposed the Opportunity Niche Hypothesis in order to explain the success of the establishment and the spread of invasive species. According to these authors, alien species introduced into a new range can jointly benefit from a decrease of the pressure applied by natural enemies and from an increase in the availability of resources. Drosophila suzukii has been reported to be an invasive species. Native of Asia, it has been now widely observed in North America and throughout Western Europe. Since its introduction in 2008, especially in Europe, the invasion of D. suzukii is particularly rapid and, as it grows on ripe fruits, a lot of concerns have been raised on the damage it causes on crops. In our work, we have highlighted some characters of this species as elements that facilitate the success of its invasion. D. suzukii is highly resistant against parasitoids, known as its major natural enemies. We have then showed the existence of a link between the ability to resist to larval parasitoids and a high hemocyte load. Furthermore, thanks to a very large sample, we have illustrated the great polyphagia of this species. This property provides available resources throughout the year. Finally, with a study of tritrophic interactions, we have shown that the nutritional quality of host plants used by D. suzukii can have an impact on the level of resistance to entomophages. Indeed, D. suzukii increases its resistance to several species of parasitoids when it growths on an alkaloid-rich substrate. Our recent results suggest that it would even be able to achieve a form of self-medication. The different studies performed in this thesis seem to confirm that D. suzukii makes the most of niche opportunity to efficiently invade temperate Europe

Le syndrome CHARGE (CS) est une maladie génétique rare caractérisée par de nombreuses anomalies congénitales, majoritairement causées par des altérations de novo du gène CHD7. Celui-ci code pour une protéine à chromodomaines, impliquée dans le remodelage ATP-dépendant de la chromatine. La grande majorité des altérations de CHD7 consiste en allèles nuls tels que des délétions, des substitutions non-sens ou des décalages du cadre de lecture. Nous avons réalisé le premier diagnostic moléculaire d’un patient Indonésien atteint du CS, en étudiant un panel de gènes (CHD7, EFTUD2, et HOXA1) par NGS (next-generation sequencing). Nous avons identifié une nouvelle mutation non-sens hétérozygote dans l’exon 34 du gène CHD7 (c.7234G>T ou p.Glu2412Ter). Par ailleurs, il n'existe pas d’analyse fonctionnelle qui permettrait de caractériser la pathogénicité des variants de la protéine CHD7 rencontrés chez des patients. C’est pourquoi l’objectif de ce travail est de mettre au point un test fonctionnel de la protéine CHD7, sous forme sauvage ou mutée. Pour cela, nous avons généré par mutagénèse dirigée des vecteurs codant pour trois variants faux-sens de CHD7 et le variant présentant une insertion de cinq acides aminés. Ensuite, les protéines CHD7, sous forme sauvage ou variante, ont été surexprimées dans la lignée HeLa. L’expression des protéines a été mise en évidence par western blot et par immunofluorescence. Pour étudier la fonctionnalité de CHD7, nous avons quantifié par RT-qPCR les transcrits de cinq gènes (l’ADNr 45S, SOX4, SOX10, MYRF, et ID2), dont la transcription est selon le littérature régulée par CHD7. Nous avons observé que l’expression de CHD7 sauvage entraînait une diminution significative et reproductible des quantités de transcrits correspondant à tous les gènes rapporteurs. Par contre, l’expression des quatre allèles variants de CHD7 n’avait aucun impact, ce qui suggère que ces variants ne sont pas fonctionnels. Par ailleurs, nous avons appliqué notre test biologique dans des cellules de la lignée SH-SY5Y, pour lesquelles nous avons introduit une mutation faux-sens dans le génome en utilisant la technique CRISPR/Cas9. Lorsque ce variant était exprimé, les niveaux de transcription des cinq gènes rapporteurs n’étaient pas significativement différents de ceux observés dans les cellules où les deux allèles de CHD7 avaient été invalidés. Par conséquent, les variants étudiés peuvent être répertoriés comme résultant de mutations causales du CS. / CHARGE syndrome (CS) is a rare genetic disease characterized by numerous congenital abnormalities, mainly caused by de novo alterations of the CHD7 gene. It encodes a chromodomain protein, involved in the ATP-dependent remodeling of chromatin. The vast majority of CHD7 alterations consists in null alleles like deletions, non-sense substitutions or frameshift-causing variations. We report the first molecular diagnosis of an Indonesian CS patient by a targeted NGS (next-generation sequencing) gene panel (CHD7, EFTUD2, and HOXA1). We identified a novel heterozygous nonsense mutation in exon 34 of CHD7 (c.7234G>T or p.Glu2412Ter). Functional analyses to confirm the pathogenicity of CHD7 variants are lacking and urgently needed. Therefore, the aim of this study was to establish a functional test for wild-type (WT) or variants of CHD7 protein found in CS patients. Using an expression vector encoding CHD7, three variants harboring an amino acid substitution and one variant with a five-amino acid insertion were generated via site-directed mutagenesis. Then CHD7 proteins, either wild-type (WT) or variants, were overexpressed in HeLa cell line. Protein expression was highlighted by western blot and immunofluorescence. We then used real-time RT-PCR to study CHD7 functionality by evaluating the transcript amounts of five genes whose expression is regulated by CHD7 according to the literature. These reporter genes are 45S rDNA, SOX4, SOX10, ID2, and MYRF. We observed that, upon WT-CHD7 expression, the reporter gene transcriptions were downregulated, whereas the four variant alleles of CHD7 had no impact. This suggests that these alleles are not polymorphisms because the variant proteins appeared non-functional. Furthermore, we applied our biological assay in SH-SY5Y cell line in which endogenous CHD7 gene was mutated using the CRISPR/Cas9 technique. Then, we observed that when a CHD7 missense variant was expressed, the transcription levels of the five reporter genes were non-significantly different, compared with the cells in which both CHD7 alleles were knocked-out. Therefore, the studied variants can be considered as disease-causing of CS.