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Στην παρούσα εργασία μελετήθηκε η επίδραση των διατροφικών επιπέδων βιταμίνης Α στην ανάπτυξη των σκελετικών δυσπλασιών και των μεριστικών χαρακτήρων του λαβρακιού. Εφαρμόσθηκαν 7 διαφορετικά διατροφικά επίπεδα ρετινόλης (0, 5, 10, 15, 25, 35 και 70 mg ρετινόλης ανά Kg ξηράς τροφής) σε 21 νυμφικούς πληθυσμούς λαβρακιού (3 επαναλήψεις ανά διατροφική ομάδα). Η εφαρμογή των διαφορετικών συνθηκών έλαβε χώρα στο διάστημα των πρώτων 45 ημερών ανάπτυξης. Συνολικά μελετήθηκαν 1098 νύμφες και 1053 ιχθύδια. Τα αποτελέσματα έδειξαν πως οι διαφορετικές συγκεντρώσεις της βιταμίνης Α επιδρούν σημαντικά στην ανάπτυξη σκελετικών παραμορφώσεων στις νύμφες και τα ιχθύδια του λαβρακιού, καθώς επίσης και στους μεριστικούς χαρακτήρες. Οι διάφορες σκελετικές δομές δεν παρουσίασαν την ίδια ευαισθησία στη βιταμίνη Α. Σημαντικά επηρεάστηκαν δομές του κρανίου όπως οι βραγχιοστεγείς ακτίνες, το υοειδές τόξο και οι γνάθοι, καθώς και τα σκελετικά στοιχεία των πτερυγίων. Τα βέλτιστα επίπεδα των εξεταζόμενων συγκεντρώσεων βιταμίνης Α στα οποία παρατηρούνται οι μικρότερες συχνότητες εμφάνισης δυσπλασιών διαφοροποιήθηκαν σημαντικά, ανάλογα με την εξεταζόμενη ανατομική περιοχή. Εντούτοις, η συγκέντρωση 5-10 mg Kg-1 παρατηρήθηκε σε πολλές περιπτώσεις να αντιστοιχεί στο βέλτιστο. Στο εύρος αυτό της συγκέντρωσης ρετινόλης παρατηρήθηκε και η μεγιστοποίηση του ρυθμού σωματικής αύξησης των ατόμων, όπως αυτή εκτιμήθηκε από το ολικός μήκος σώματος στην ηλικία των 45 ημερών μετά την εκκόλαψη. Όσον αφορά στους μεριστικούς χαρακτήρες, αυξανομένης της συγκέντρωσης της ρετινόλης οι προ-αιματικοί σπόνδυλοι τείνουν να αυξηθούν ενώ ο αριθμός των ραχιαίων στοιχείων όπως και των δερματοτρίχιων φαίνεται να μειώνεται. Τα αποτελέσματα συζητούνται ως προς τα αποτελέσματα παρόμοιων εργασιών για άλλα είδη ψαριών, ως προς τους πιθανούς μηχανισμούς δράσης της ρετινόλης, καθώς και ως προς την υπόθεση της αλλαγής των διατροφικών προτιμήσεων του λαβρακιού κατά τη διάρκεια της οντογένεσης. / The goal of the current MSc Thesis was to examine the effect of Vitamin A both on the development of skeletal deformities and of the meristic characters in European sea bass. The experimental design involved 7 different dietary levels of retinol (0, 5, 10, 15, 25, 35, 70 mg retinol kg-1 of dry food) and included 3 repetitions. Due to the fact that both the meristic characters and the skeletal deformities develop during early developmental stages, the application of the experimental dietary levels took place during the first 45 days post hatching. In total 1098 larvae and 1053 juveniles were examined. Results demonstrated that the different dietary levels of Vitamin A significantly affected the development of skeletal deformities in both the larval and juvenile stage, as well the meristic characters. The different anatomical areas exhibited different sensitivity in Vitamin A. There was a significant effect on cephalic structures such as the branchiostegal rays, hyoid arch and the jaws and on the internal skeletal elements of the fins. The optimum levels of dietary Vitamin A where the lowest frequencies of skeletal deformities were observed differed between the different anatomical areas. However, the dietary level of 5-10 mg Kg-1 was identified as the common optimum. In this range of dietary retinol the growth rate was maximized, as it was estimated by the body fork length at the age of 45 days post hatching. As far as the meristic characters are concerned, the number of pre-haemal vertebra tended to increase whereas the number of dorsal elements and caudal dermatotrichia to decrease at elevated retinol levels. The results are discussed in respect to similar studies for other fish species, the presumable molecular mechanisms of retinol action, as well as the hypothesis of switching dietary preferences of sea bass during ontogeny.

Les protéoglycanes (PGs) sont des protéines présentes au niveau de la matrice extracellulaire et à la surface des cellules. Ils sont constitués d’une protéine sur laquelle sont attachées des chaînes de glycosaminoglycanes. Ils jouent un rôle essentiel dans plusieurs processus biologiques. Des mutations au niveau des gènes codant pour la protéine porteuse ou les enzymes impliquées dans la biosynthèse des GAGs sont associées à plusieurs syndromes et pathologies chez l’homme. L’initiation de la synthèse des GAGs est catalysée par la xylosyltransférase I (XT-I). La XT-I joue un rôle clé dans la régulation de la synthèse des PGs au niveau du cartilage et il a été montré récemment que les mutations hypomorphiques de la XT-I sont associées au syndrome du Desbuquois de type II (DBQD2) caractérisé par des anomalies squelettiques (ostéochondrodysplasie). Afin d’élucider le rôle de la XT-I dans le développement ostéoarticulaire, nous avons généré une souris transgénique conditionnelle Col2α1-CreERTM ;XylT1flox/flox permettant l’invalidation de la XT-I au niveau du cartilage. De façon intéressante, l’invalidation de la XT-I induit des anomalies du développement ostéoarticulaire caractérisées par un nanisme important et des défauts des éléments squelettiques. Des études histologiques et la microscopie SHG (génération de seconde harmonique) de la plaque de croissance ont permis de montrer l’importante de la XT-I dans la formation de la matrice extracellulaire (MEC), la fibrillation du collagène II, la maturation des chondrocytes et leur organisation en colonne dans la plaque de croissance. L’analyse des mécanismes moléculaires impliqués indique la perturbation de la voie de signalisation du TGF-β dans la plaque de croissance. D’autre part, des études histomorphométriques et histologiques des os ont révélé que la déficience en XT-I entraîne une accélération du processus d’ossification avec une stimulation de l’activité des ostéoclastes au niveau de l’os spongieux conduisant à une résorption osseuse importante et à une ossification accrue de l’os cortical. Ces travaux ont permis de révéler le rôle de la XT-I dans le développement ostéoarticulaire et dans le maintien de l’homéostasie du cartilage et du tissu osseux et ont mis en évidence le rôle de la voie du TGF-β dans les anomalies du développement. Ces travaux ouvrent également la voie pour le développement de thérapeutiques potentielles pour le traitement des patients atteints du syndrome de Desbuquois type II / Proteoglycans (PGs) are proteins present in the extracellular matrix and on the surface of cells. They consist of a protein to which chains of glycosaminoglycans (GAGs) are attached. PGs play an essential role in many biological processes and in the homeostasis of different tissues including cartilage, bone and skin. Mutations in the genes encoding PG core proteins or the enzymes involved in GAG biosynthesis are associated with several syndromes and pathologies in human. Initiation of GAG synthesis is catalyzed by xylosyltransferase I (XT-I). XT-I plays a key role in the regulation of the synthesis of PGs in cartilage and it has been shown recently that hypomorphic mutations of XT-I are associated with the Desbuquois syndrome type II (DBQD2), characterized by skeletal abnormalities (osteochondrodysplasia). To elucidate the role of XT-I in skeletal development, we generated a conditional transgenic mouse, Col2α1-CreERTM; XylT1flox/flox allowing the invalidation of XT-I gene in the cartilage. Interestingly, the invalidation of XT-I induces skeletal developmental abnormalities characterized by significant dwarfism, and defects in many skeletal elements. Histological studies and SHG microscopy (second harmonic generation) of the growth plate showed the importance of XT-I in extracellular matrix formation, fibrillation of collagen type II, maturation of chondrocytes and their organization in column in the growth plate. The analysis of the molecular mechanisms involved indicates the disruption of the TGF-β signaling pathway in the growth plate. On the other hand, histomorphometric and histological studies of the bones revealed that the XT-I deficiency causes an acceleration of the ossification process with a stimulation of the osteoclasts activity in spongy bone leading to bone resorption, and increased ossification of the cortical bone. This work revealed the role of XT-I in skeletal development and in the maintenance of cartilage and bone homeostasis and highlighted the role of the TGF-β pathway in developmental abnormalities. This work also paves the way for the development of potential therapeutics for the treatment of patients with Desbuquois syndrome type II

Les protéoglycanes (PGs) jouent un rôle essentiel dans plusieurs processus physiologiques majeurs tels que la signalisation cellulaire, la prolifération et la migration ; ceci grâce aux interactions entre leurs chaînes de glycosaminoglycanes (GAGs) avec des médiateurs solubles et leurs récepteurs. L'initiation de la synthèse des chaînes de GAGs des PGs est catalysée par la xylosyltransferase I (XT-I). Récemment plusieurs études ont montré différentes mutations au niveau du gène de la XT-I associées au syndrome Desbuquois de type II, caractérisée des anomalies ostéoarticulaires. Afin d’étudier le rôle de la XT-I dans le développement ostéoarticulaire, nous avons généré des souris invalidées pour le gène de la XT-I (XT-I KO). L'analyse morphologique des embryons montre que les souris XT-I KO présentent un nanisme prononcé et une hypoplasie frontonasale apparente, indiquant des anomalies du développement ostéoarticulaire. L'évaluation du contenu en PGs a révélé une forte diminution de la synthèse des PGs chez les souris XT-I KO. L'examen des différentes zones chondrocytaires au niveau de la plaque de croissance des os longs a révélé la perte de l’organisation en colonne des chondrocytes prolifératifs et une réduction importante de la zone hypertrophique. Afin d'identifier les mécanismes et les facteurs à l’origine des anomalies squelettiques chez les souris XT-I KO, l'expression de plusieurs gènes impliqués dans le développement du squelette et dans la régulation de la chondrogenèse a été analysée par hybridation in situ à l'aide de la technique RNAscope. Les résultats ont montré une forte expression des marqueurs de l’hypertrophie chondrocytaires suggérant ainsi une maturation précoce des chondrocytes chez les souris XT-I KO. Les embryons XT-I KO montrent également une formation précoce du centre d'ossification secondaire, indiquant une ossification précoce qui participerait aux anomalies de croissance observées chez les souris XT-I KO. L’étude des voies de signalisation impliquées dans la différenciation et la maturation chondrocytaire a révélé une surexpression du récepteur FGFR3 et une activation importante de la signalisation sous-jacente, suggérant ainsi des perturbations de la signalisation du FGF. Compte tenu du rôle important du FGFR3 dans la régulation de la chondrogenèse et de l’ossification endochondrale, ces résultats suggèrent fortement l’implication de la voie de FGF dans le développement des anomalies squelettiques chez les souris XT-I KO et ouvrent la voie pour le développement de de nouvelles thérapeutiques pour le traitement des patients atteints du syndrome Desbuquois de type II. / Proteoglycans (PGs) play an essential role in several major physiological processes such as cell signaling, proliferation and migration; this is mainly due to the interactions between their glycosaminoglycan chains (GAGs) with soluble mediators and their receptors. The initiation of the synthesis of GAG chains of PGs is catalyzed by Xylosyltransferase I (XT-I). Recently several studies have shown that mutations in XT-I gene are associated with Desbuquois syndrome type II which is characterized by skeletal abnormalities. To study the role of XT-I in skeletal development, we generated knockout mice for the XT-I gene (XT-I KO). XT-I KO mice show pronounced dwarfism and apparent frontonasal hypoplasia reflecting abnormalities in skeletal development. Evaluation of PG content revealed a strong decrease in PG synthesis in XT-I KO mice. Analysis of the different chondrocyte zones in the growth plate revealed a loss of columnar organization of proliferative chondrocyte and a significant reduction of the hypertrophic zone. To identify the mechanisms and factors underlying skeletal abnormalities in XT-I KO mice, the expression of several genes involved in skeletal development and in the regulation of chondrogenesis were analyzed by in situ hybridization using RNAscope technique. The results showed a strong expression of markers of chondrocyte hypertrophy thus suggesting early maturation of chondrocytes in XT-I KO mice. The XT-I KO embryos show also a premature formation of the secondary ossification center, indicating a precocious ossification which ultimately leads to the growth abnormalities showed in XT-I KO mice. The study of the signaling pathways involved in differentiation and chondrocyte maturation revealed an overexpression of the FGFR3 receptor and a significant activation of the downstream signaling pathways, thus suggesting disturbances of FGF signaling. Given the important role of FGFR3 in the regulation of chondrogenesis and endochondral ossification, these results strongly suggest the involvement of the FGF pathway in the development of skeletal abnormalities in XT-I KO mice and pave the way for the development of new therapeutics for the treatment of patients with Desbuquois syndrome type II.

Les polluants environnementaux, en particulier les perturbateurs endocriniens (PE), agissent à très faibles doses sur des cibles multiples. Les effets rapportés portent en majorité sur les organes de reproduction. Très peu d’études ont porté sur le squelette alors que le cartilage et l’os sont sous un puissant contrôle hormonal, depuis le stade fœtal où le système hormonal se met en place jusqu’au vieillissement, en passant par la naissance (hormones thyroïdiennes, hormone de croissance), la puberté et la ménopause chez la femme (stéroïdes sexuels). L’objectif de ce travail est d’étudier les effets de polluants anti-androgènes (vinclozoline, V et métabolite actif M2) ou xenestrogènes (génistéine, G; bisphénol A, BPA), in vivo sur le développement du squelette du rat Wistar et in vitro sur les marqueurs de différenciation chondrogéniques. Les effets in vivo ont été étudiés à des doses inférieures aux “No Observed Adverse Effect Levels ” (NOAEL) fixés par les instances européennes (EFSA) et internationales (US EPA). Des rattes ont été exposées à V, G seuls, combinés (GV) et/ ou associés au BPA (BGV), et ce de la conception des petits jusqu’à leur sevrage (J30) ou leur sacrifice (J30, J110). Les effets ont été recherchés sur des petits de mères et portées différentes, quatre pour chaque traitement, âge et sexe. Les effets in vitro du métabolite M2 de la Vinclozoline, associé ou non avec G et BPA, ont été étudiés sur l’expression de marqueurs chondrogéniques en utilisant : 1) un modèle murin de cellules souches inductibles vers la voie chondrogénique (C1) pour les effets sur la différenciation chondrogénique précoce et 2) des chondrocytes de souriceaux nouveau-nés, différenciés en culture primaire ou dédifférenciés (passages répétés). Comparaison avec les effets du bFGF, facteur de dédifférenciation chondrogénique. Résultats : In vivo, l’exposition à V, seule ou associée à G ou au BPA induit chez les rattes F1 exposées, une cannelure de la queue, discrète mais perceptible à la palpation en regard de chaque articulation intervertébrale. Les xénestrogènes tendent à réduire cet effet de V. Les rats et les animaux F2 ne sont pas atteints. L’examen par micro CT-scan montre une augmentation significative de la largeur des apophyses transverses (ITA) des vertèbres, et une diminution de la hauteur des corps vertébraux chez les rattes F1 exposées en regard des contrôles. Ces modifications anatomiques rappellent certaines pathologies génétiques des collagènes (dysplasies épiphysaires) chez l’homme Elles sont absentes chez les rats F1 et les animaux F2. Elles sont en partie transitoires car présentes à J30 (effets sur ITA et longueur) quand seul l’effet sur l’ITA perdure à J110. L’examen histologique des cartilages de croissance des corps vertébraux montre un déséquilibre entre les zones de prolifération et d’hypertrophie qui évoque une modification de la maturation du cartilage de type estrogénique. Ces effets sont ici aussi transitoires et majoritairement observés chez les rattes. L’effet plus prononcé du BPA lisse toutes les autres activités. Cela suggère que les PE pourraient moduler la différenciation du cartilage de croissance. C’est ce qui a été étudié in vitro. In vitro. Le premier objectif était d’évaluer les effets des PE sur la dynamique d’induction chondrogénique (cellules C1). Nous montrons que l’addition de M2 seul ou avec G ou BPA modifie le processus de maturation du collagène2 sans effet sur les autres marqueurs (SOX9, Agrécane, Col10). M2 prolonge l’expression de COL2A immature et retarde son remplacement par l’isoforme COL2B. Le second objectif était d’étudier les effets des PE sur la régulation de l’expression de COL2A au cours du processus de dé-différenciation des chondrocytes in vitro. L’expression de COL2A augmente avec le degré de dédifférenciation cellulaire (passages successifs) et double en présence de M2, G et BPA. Cet effet dépend des récepteurs aux estrogènes (ER) et des voies p38-MAPK. (...) / Environmental pollutants, particularly Endocrine Disruptors (ED), show effects on multiple targets at very low doses. Mostly known effects target reproductive organs. Very few studies are conducted on skeleton, although cartilage and bone are under potent hormonal control, from fetal stage, where hormonal system takes place, until aging, through birth stage (thyroid hormones, growth hormones), puberty and menopause for women (steroid hormones). The aim of this work is to study effects of anti-androgenic pollutants (vinclozolin, V, and its active metabolite M2) or xenoestrogens (genistein, G; bisphenol A, BPA), in vivo on Wistar rat skeletal development and in vitro on chondrogenic differenciation markers.In vivo effects were studied at doses below the “No Observed Adverse Effect Levels” (NOAEL) established by European and American agencies (EFSA and US EPA respectively). Female Wistar rats were exposed to V and G alone, in combination (GV) and/or associated to BPA (BGV), from pups conception until weaning (d30) or sacrifice (d30, d110). Effects were investigated on offsprings from different mothers and litters, on four animals by treatment, age and gender. In vitro effects of M2 metabolite of Vinclozolin, combined or not to G and BPA, were studied on chondrogenic markers expression using : 1) inducible murine stem-cells model towards chondrogenesis (C1) to sudy effects on early chondrogenic differentiation and 2) post-natal mouse differentiated chondrocytes, in primary culture or dedifferenciated chondrocytes by successive passages. Comparison with bFGF, a dedifferentiation factor for chondrocytes.Results : In vivo, exposure to V, alone or combined to G or BPA, induce discrete but palpable annealing in F1 treated female rat tails, in front of each intervertebral articulation. Xenoestrogens tend to decrease V effect. Male rats and F2 offsprings were not affected. Micro-CT Scan analysis shows significative increase of vertebrae inter transverse apophyses (ITA) distance, and decrease of vertebral body height in F1 female rats comparing to control animals. Anatomical modifications recall human collagen genetic diseases (epiphyseal dysplasias). They are absent in F1 male rats and F2 offsprings. Furthemore they are partly transient, ITA and height effects being present at d30 whereas ITA effect alone remains until d110. Histological analysis of vertebral body growth plate shows unbalance between proliferative and hypertrophic zones, which evokes estrogenic acceleration of cartilage maturation. Those effects are still transient and mainly observed in female rats. BPA activity is dominant above G and V effects. This result suggests ED can modulate growth plate cartilage differentiation, which was studied in vitro. In vitro : First, we aimed to evaluate eventual role of ED on the dynamic of the chondrogenic differentiation process. We show that M2 addition, alone or in combination with G or BPA, modifies collagen 2 maturation process without any effect on other markers (SOX9, Agrecan, COL10). M2 addition extends immature isoform COL2A expression and delays its replacement by mature isoform COL2B. Second, we studied the effects of ED on the regulation of COLA expression through the dedifferentiating process of chondrocytes in vitro. COL2A expression increases with cell dedifferenciation degree (successive passages) and double with M2, G and BPA. No other chondrogenic marker was modified. This effect depends on estrogen receptors (ER) and p38-MAPK pathway. (...)