Immunoglobulin (Ig) diversification is essential for the generation of protective immune responses against intruding microbes. B cells require cognate interaction with T cells to generate protective antibodies, although signals from innate cells play also a key role in helping B cell responses. We have characterized that B cells of the human upper respiratory mucosa undergo T cell dependent and T cell independent IgM-to-IgD class switching. In addition to enhancing mucosal immunity, crosslinking of IgD on innate cells including basophils stimulates release of immunoactivating, proinflammatory and antimicrobial mediators, defining IgD as an important immunomodulator. Signals capable of inducing IgM-to-IgD class switching include not only T cell dependent signals, but also BAFF and APRIL, two CD40L-related factors released by innate immune cells. We have studied the signalling pathway of the BAFF and APRIL receptor TACI, which binds the adaptor MyD88 and induces class switching by triggering NF- activation. Overall, we elucidate novel cellular and signaling pathways required for the induction of Ig diversification and production. / La diversificació de les immunoglobulines és essencial per a la generació de respostes immunes protectores contra els patògens. Els limfòcits B requereixen interacció afí amb els limfòcits T per tal de generar anticossos protectors, tot i que les senyals de cèl.lules innates també juguen un paper clau en les respostes dels limfòcits B. Hem caracteritzat que en els limfòcits B de la mucosa del tracte respiratori superior humà tenen lloc respostes tant depenents com independents de limfòcits T que donen lloc al canvi d’isotip de IgM a IgD. A més a més de millorar la immunitat de la mucosa, la unió de la IgD a cèl.lules innates, incloent basòfils, estimula l'alliberament de molècules immunoactivadores i de mediadors proinflamatoris i antibiòtics. Senyals que poden induir el canvi d’isotip de IgM a IgD inclouen no només senyals dependents de limfòcits T, sinó també BAFF i APRIL, dos factors relacionats amb el CD40L produïts per les cèl.lules innates del sistema immunitari. Hem estudiat la via de senyalització de TACI, receptor de BAFF i APRIL, i hem observat que s'uneix l'adaptador MyD88 per induir el canvi d’isotip de les immunoglobulines mitjançant l'activació de NF-. En general, hem dilucidat noves vies cel.lulars de senyalització necessàries per a la inducció de la diversificació i la producció de les immunoglobulines.

Selenoproteins are a diverse class of proteins containing selenocysteine, the 21st aminoacid. Selenocysteine is inserted co-translationally, recoding very specific UGA codons through a dedicated machinery. Standard gene prediction programs consider UGA only as translational stop, and for this reason selenoprotein genes are typically misannotated. In the past years, we developed computational tools to predict selenoproteins at genomics scale. With these, we characterized the set of selenoproteins across many sequenced genomes, and we inferred their phylogenetic history. We dedicated particular attention to selenophosphate synthetase, a selenoprotein family required for selenocysteine biosynthesis, that can be used as marker of the selenocysteine coding trait. We show that selenoproteins went through a very diverse evolution in different lineages. While very conserved in vertebrates, selenoproteins were lost independently in many other organisms. Using genome sequencing, we traced with precision the path of genomic events that lead to recent selenoprotein extinctions in certain fruit flies. / Les selenoproteïnes s’agrupen en una classe heterogènia de proteïnes les quals contenen selenocysteïna, l’aminoàcid 21. La selenocisteïna és insertada durant el procés de traducció, recodificant codons UGA molt específics, mitjançant una maquinàiria dedicada. Els programes estàndard de predicció de gens interpreten el codó UGA només com a senyal d’stop de la traducció, i per aquesta raó els gens de selenoproteïness solen estar mal anotats. En els darrers anys, hem desenvolupat eines computacionals per a predir selenoproteïnes a escala genòmica. Amb aquestes, hem caracteritzat el conjunt de selenoproteïnes en aquells genomes que han estat seqüenciats, inferint la seva història filogenèitca. Hem dedicat especial ateníció a la família selenophosphate synthetase, selenoproteïna necessària per a la síntesi de selenocisteïna, i que per tant pot ser utilitzada com a marcador de codificació de selenocisteïna Mostrem que les selenoproteïnes han patit una evolució molt diversa en diferents llinatges. Tot i que es troben molt conservades en vertebrats, les selenoproteïnes van ser perdudes de manera independent en molts altres organismes. Gràcies a la sequenciació de genomes, vam traçar amb precisió els esdeveniment que van portar a l’extinció de selenoproteïnes a diverses espècies de drosòfila.

La Retinosi Pigmentària (RP) és una malaltia hereditària que provoca degeneració retiniana. Pot presentar diferents tipus d'herència: autosòmica dominant, autosòmica recessiva, lligada al cromosoma X i algunes formes digèniques i mitocondrials. La retinosi pigmentària autosòmica dominant (RPAD) està causada majoritàriament per mutacions en gens amb expressió específica a la retina però en els darrers anys, s'ha vist que mutacions en alguns gens amb expressió ubiqua provoquen patologia únicament a la retina. Aquesta Tesi es centra en l'estudi de mutacions genètiques que afecten la regulació de l'expressió gènica. Així, s'estudien mutacions en el factor de transcripció NRL, en el factor de splicing de pre-mRNA PRPF8 i mutacions en cis de splicing en el gen de la Rodopsina.Pel que fa a les mutacions en senyals de splicing del gen RHO, s'han investigat els efectes d'aquestes mutacions sobre el processament del pre-mRNA de RHO. Els resultats suggereixen que les mutacions de splicing g.3811A>G i g.5167G>T associades a RPAD utilitzen un splicing alternatiu mentre que la mutació g.4335G>T associada a RPAR provoca l'eliminació d'un exó. Estudis de localització i expressió cel·lular d'aquests mutants suggereixen un efecte dominant negatiu com a mecanisme patogènic.Estudis funcionals de la mutació M96T trobada en el gen NRL suggereixen un caràcter dominant de la mutació. La cosegregació familiar suggereix la presència d'un segon factor genètic implicat en l'aparició de la malaltia. Com a aproximació terapèutica a la RPAD, s'han fet diferents estudis utilitzant ribozims i la tècnica del RNA d'interferència (RNAi). Els resultats obtinguts demostren la possibilitat d'utilitzar aquesta tecnologia per a eliminar els productes mutats causants de la malaltia. No obstant, mostren també la dificultat de dissenyar una molècula de siRNA específica per cada producte mutat. Per evitar aquesta limitació, s'ha aplicat la tècnica de supressió i substitució gènica sobre mutants de NRL. / Retinitis pigmentosa (RP) is an inherited and degenerative disease of the retina. This disease presents different types of inheritance: autosomal dominant, autosomal recessive, X-linked and some digenic and mitochondrial forms. In most cases, autosomal dominant retinitis pigmentosa (ADRP) is caused by mutations in genes specifically expressed in the retina. However, in the last years it seems that mutations in certain genes with ubiquitous expression only cause pathology in the retina.This Thesis is focused in the study of mutations that affect the regulation of gene expression. Mutations in the transcription factor NRL, the pre-mRNA splicing factor PRPF8 and cis acting splicing mutations in RHO gene have been studied.Effects that splicing mutations in RHO produce on the pre-mRNA splicing have been investigated. Results obtained suggest that while mutations g.3811A>G and g.5167G>T associated to ADRP use an alternative splicing site, the mutation g.4335G>T associated to ARRP produces the skipping of one exon. Expression and localization experiments carried out suggest a dominant negative effect as the pathogenic mechanism of RP.Functional studies of mutation M96T found in NRL gene correlate with a dominant inheritance of RP. However, the co-segregation in the family suggests the presence of a second factor implicated in the expression of RP phenotype.As a therapeutic approach, different studies using ribozymes and RNA interference have been performed. The results obtained show the possibility to use these techniques to eliminate the mutant products causing ADRP. However, the design of a specific siRNA is not always possible. To circumvent this limitation, the technique of suppression and replacement has been assayed with NRL mutants.

En aquesta tesi s'ha realitzat un estudi genètic de les malalties complexes de forma específica en la població espanyola. El treball s'ha centrat en l'estudi de dues malalties inflamatòries, complementàries tant a nivell experimental, quant a l'aproximació realitzada en els mètodes de mapatge genètic, com també a nivell de l'etiopatogènia inflamatòria de la malaltia.L'estudi de la psoriasi en la població espanyola ha evidenciat la presència de dos loci de predisposició, un a la regió de 6p21 (PSORS1), definit com un locus de múltiples gens lligats (HLA-Cw*6, HCR, CDSN), i un altre possible a la regió 4q35 (PSORS3), que presenta una interacció positiva, però no epistàtica amb PSORS1, implicant dues vies diferents i independents en l'etiopatogènia de la malaltia. A més s'ha posat de manifest un efecte parental en l'herència de la predisposició genètica en PSORS1, possiblement mitjançant un efecte d'imprinting matern en la regió. D'altra banda, s'ha determinat la presència d'un haplotip comú en distintes poblacions, format per quatre de les variants codificants del gen HCR (HCR*WWCC), convertint-se en un dels determinants majors i més estesos dintre de PSORS1. L'estudi de l'asma ha demostrat la important heterogeneïtat fenotípica inclosa en la definició de la malaltia, posant de manifest però la important determinació genètica dels fenotips associats a la malaltia (principalment del control de la resposta de les IgEs). De forma clara s'ha evidenciat la important variació del risc genètic associat a determinades variants en els distints moments de l'evolució de la malaltia, sent en molts casos oposats en l'edat adulta i en l'edat infantil. A més s'ha pogut associar la predisposició a l'asma amb variants del gen CFTR (Cystic fibrosis transmenbrane conductance regulator gene), amb una alta prevalença de variants d'error de sentit en els individus (adults i infantils) amb asma. En resum, l'anàlisi genètica ha demostrat la utilitat de la combinació d'estudis d'anàlisi de lligament amb els mètodes d'associació, així com la necessitat d'una definició i restricció important en la definició del fenotip "genètic" a estudiar, això és la definició del tret fenotípic determinat genèticament. A més s'ha posat de manifest la importància del coneixement de les bases de predisposició genètica de determinats trets associats a la malaltia per a la millor definició de la mateixa, i també en el procés de la identificació de l'heterogeneïtat genètica de la malaltia.D'altra banda, encara que les variants estudiades difícilment poden ser utilitzades per a un diagnòstic genètic, sí que poden ser emprades com a pronòstic en l'evolució, o de la severitat de la malaltia, afavorint una intervenció mèdica més eficient i preventiva més que correctora.

La maduración de los frutos es un proceso fisiológico complejo y altamente regulado en el que se producen una serie de cambios bioquímiccos en el fruto: color, aroma, estructura del mismo; hasta el completo desarrollo del fruto maduro. Este proceso es regulado principalmente por el etileno en frutos climatéricos, mientras que en el caso de los frutos no climatéricos se desconoce el mecanismo de regulación aunque se ha demostrado el papel de otras hormonas como las auxinas, los brasinoesteroides y el ácido abcísico. La coexistencia en melón de variedades climatéricas y no climatéricas junto con disponibilidad de un gran número de herramientas genéticas y genómicas hacen del mismo un sístema adecuado para el estudio de la maduración de los frutos. Para el estudio genético de la maduración se generó una población F2 a partir del cruzamiento entre el parental no climatérico Piel de Sapo (PS) y la línea climaterica SC3-5-1, en la que previamente se había descrito un QTL en el GL III (ETHQB3.5), que inducía la maduración climatérica de los frutos. Durante este trabajo de tesis se detectó un segundo QTL (ETHQV6.3) en el GL VI de la misma línea. Ambos QTLs son capaces de inducir, de forma individual, la maduración climatérica de los frutos, siendo los efectos de ETHQV6.3 mayores que los de ETHQB3.5 sobre la misma. Éstos además interactuan de forma epistática resultando en una precocidad de los frutos, que requieren de un menor tiempo para madurar que en el caso de poseer exclusivamente uno de los QTLs. Se desarrolló un mapa genético de alta resolución en torno a ETHQV6.3, localizándo dicho locus en una región de 4.5 Mb en la región centrómerica del GL VI. Durante la segunda parte de este trabajo de tesis se llevó a cabo un análisis transcriptómico en fruto maduro de la línea climatérica SC3-5-1 y el parental no climatérico PS, que permitió definir una serie de genes candidatos en el intervalo del locus ETHQV6.3. Finalmente, se caracterizó un miembro de la familia de los factores de transcripción NAM/NAC, MELO3C016536, idéntificándose una mutación que produce un cambio aminoacídico en la secuencia de la proteína, una serina en el parental PS se convierte en prolina en la línea SC3-5-1. / Fruit ripening is a highly and complex physiological process, with a set of biochemical changes, including the conversion of starch to sugars, fruit softening, accumulation of pigments such as carotenoids, and synthesis of aroma volatiles. The ripening process is mainly regulated by ethilene in climacteric fruits; whereas in non-climacteric fruits other hormones such auxines, brassinosteroids, and abcisic acid seem to be more important though a general model still remains unclear. The co-existence in melon of both climacteric and non-climacteric varieties and the availabilty of a set of genetic and genomic resources make melon a suitable model for genetic studies of fruit ripening. A F2 population generated from the cross between the climacteric NIL SC3-5-1, that harbours a QTL (ETHB3.5) in LG III for fruit ripening, and the non-climacteric line Piel de Sapo (PS) was used to study the genetic control of fruit ripening in the climacteric line. In the current study a new QTL, ETHQV6.3, was detected in LG VI in the same NIL inducing climacteric fruit ripening. These QTLs are capable, individually, of inducing climacteric ripening in the nonclimacteric background, being the effects of ETHQV6.3 greater than that of ETHQB3.5. The QTLs interact epistatically advancing the timing of ripening, reducing the time needed to produce mature fruits. ETHQV6.3 was fine-mapped to a 4.5 Mb physical region of the melon genome, probably in the centromeric region of LG VI. The study of the transcriptome of ripe fruits from the climacteric line SC3--5-1 and the non-climacteric parental PS, allowed us to define a set of candidate genes in the region of ETHQV6.3. Finally, a member of the transcription factor family NAM/NAC, MELO3C016536, was characterized identifying a non synonimous mutation that results in the substitution of a serine in PS by a proline in the line SC3-5-1.

En aquesta tesis hem analitzat diferents qüestions antropològiques usant l’ADN de poblacions antigues de Catalunya i Balears. Primer, hem intentat millorar la nostra metodologia aplicant un protocol diferent en l’estudi d’un jaciment que inesperadament havia proporcionat resultats escassos. Hem vist que sota algunes circumstàncies el canvi del nostre protocol usant fenol-cloroform pel del kit QIAamp DNA investigator que usa l’afinitat de les partícules de silica és positiu i millora significativament els resultats, encara que sembla que el mètode òptim pot variar en cada cas i que s’hauria de fer una valoració específica per decidir el protocol més adeqüat. Seguidament, hem volgut anar fer l’anàlisi de les relacions intrapoblacionals en grups enterrats en comú per a examinar el paper de les famílies nuclears en l’antiguitat. Vam examinar una cova sepulcral amb múltiples individus de Catalunya de finals de l’Edat del Bronze, i vam comprovar que la hipòtesis que considerava als individus trobats en aquesta cova sepulcral catalana una família nuclear era errònia. L’alta variabilitat de l’ADNmt dins del grup i el fet que l’únic haplogrup compartit (4 individus) fos infreqüent en aquell moment en la regió, suggerien l’existència d’un grup patrilocal amb la integració de dones forànies i d’un possible parentiu entre alguns dels individus. Vam concloure que possiblement els llaços genètics no eren l’únic factor determinant en els grups de finals del Bronze contrastant amb la situació de les famílies nuclears actuals en la societat Occidental, i que possiblement hi havia grups familiars estesos amb lligams culturals. Pel què fa a les poblacions Balears antigues, vam fer l’anàlisi de les seves relacions intra e interpoblacionals. En general la freqüència amb què presenten l’haplogrup H ha estat important almenys des de l’Edat del Ferro, amb l’excepció de la necròpolis de Son Real que presenta unes característiques molt particulars. Això encaixa amb els valors alts de les poblacions contemporànies de l’Oest Mediterrani així com amb les actuals, amb l’excepció de Menorca actual que pot estar influenciada per la colonització anglesa durant el segle XVIII. Els nostres resultas en les necròpolis menorquines van demostrar l’absència de biaix respecte al sexe en els enterraments i suggerien un estil de vida diferent entre les poblacions que vivien en la zona plana i les que vivien en l’accidentada costa sud pel què fa a la reproducció. A Mallorca vam provar l’ús diferencial de les necròpolis. Exceptuant Son Real, totes les necròpolis Balears antigues semblen mostrar una dotació d’haplogrups Europea homogènia, així que trobar aquestes diferències evidencia el sentit de tractar individualment cada necròpolis perquè totes presenten les seves especificitats pròpies. El seu anàlisis haplotípic mostra que ja es troben dins de la variabilitat genètica Europea i mostren un pool genètic molt similar a la població Catalana antiga, reafirmant les seves interaccions històriques documentades, i descarta una relació directa entre els membres de les cultures Nuràgica i Talaiòtica pel què fa als llinatges femenins. Finalment, hem fet una primera aproximació a les malalties que acompanyaven a aquestes poblacions estudiant una infecció altament estesa com la càries. Estudiant el factor de virulència dextranasa de l’agent cariogènic Streptococcus mutans hem pogut usar dades directes des de l’Edat del Bronze a l’actualitat per proposar que ha estat evolucionant neutralment almenys des de llavors i que una tensió de la pressió selectiva en aquest segment sembla l’explicació més plausible per entendre els seus canvis al llarg del temps. / In the current thesis we have examined anthropological questions of ancient Catalonian and Balearic populations using DNA. First, we have tried to improve our methodology applying a different protocol in the study of a site which had provided unexpected poor results. We have seen that under some circumstances the change of our protocol using phenol-clorophorm for the kit QIAamp DNA investigator which uses DNA affinity to silica particles is positive and delivers significantly better results, although it seems that the optimal method can vary at any given site and a consideration on a site by site basis should be made when deciding the most suitable protocol. Next, we have aimed to go into the analysis of intrapopulation relationships in groups buried in close association to analyze the role of nuclear families in the antiquity. We examined a common burial cave from Catalonia in the Late Bronze Age, and proved that the hypothesis considering the individuals found in Catalonia’s burial cave a nuclear family was erroneous. The high mtDNA variability inside the group and the fact that the only shared haplogroup (4 individuals) was uncommon in the region at that time, suggested the existence of a patrilocal mating system with the integration of foreign women and pointed to the kinship of some of the individuals. Our conclusion is that possibly the genetic ties were not the only determinant factor in close groups in the Late Bronze Age in contrast to the situation in current nuclear families in Western society, with cultural issues also playing an important role in what could possibly seen as an extended family structure. Concerning ancient Balearic populations, we analyzed intra and interpopulational relationships. In general their frequency of haplogroup H was very important since at least the Iron Age, with the exception of one necropolis, Son Real, which has very particular characteristics. This fits with the high values from their contemporary populations from the Western Mediterranean as well as with the current ones, exception made of Current Minorca which may be influenced by the English colonization during the XVIIIth century. Our results in the Minorcan necropolises proved the lack of sex bias in the interments and suggested different lifestyles between the populations living in the plain and those living in the rugged southern coast regarding inbreeding. In Majorca we proved a differential use of the necropolises. With the exception of Son Real, all the ancient Balearic necropolises seem to have an homogeneous European haplogroup pool so these differences evidence that the individual treatment of each necropolis makes sense as they all have their own uniqueness. The haplotipic analysis confirms that they already belong to the European genetic variability and show a very similar genetic pool to the ancient Catalan population, reaffirming their already documented historic interactions, and rules out a direct relationship between the members of the Nuragic and the Talaiotic cultures regarding the feminine lineages. Finally, we have made a first approach to the illnesses which accompanied these populations studying a widespread infection as caries. Studying the virulence factor dextranase of the cariogenic agent Streptococcus mutans we have been able to use direct data from the Bronze Age to the current era to propose that it has been evolving under neutral evolution at least since then and that a constraint of the selective pressure in this segment seems the most plausible explanation to understand its changes over time.

Els grans simis són els nostres parents evolutius més propers i com a tals són la millor eina per entendre els nostres orígens més recents. Mitjançant la genòmica comparativa ara podem estudiar en profunditat aquesta qüestió, però la manca de genomes de grans simis no ha permès una anàlisi completa d’aquesta i d’altres qüestions relacionades amb la família Hominidae. En el context de la revolució de la seqüenciació, en aquesta tesi presento les meves contribucions en l’estudi de la genòmica de grans simis. Començant des de l’estudi de genomes individualment, faig un resum de les troballes més importants del panell més complet de genomes de grans simis, on vam incloure totes les espècies i la majoria de subespècies d’aquesta família i vam proporcionar una visió sense precedents en diversitat genètica, demografia i estructura de la població. També discuteixo les implicacions més rellevants d’aquest treball i com aquest pot ser una eina important en la conservació dels grans simis. / Great apes are our closest relatives and as such they are our best resource to understand our recent origins. Through comparative genomics we can fully investigate this question, but the lack of great ape genomes have precluded to have a complete view on this and many other questions related to the Hominidae family. In the context of the current sequencing revolution, herein I present the contributions I have made in the study of great ape genomes. Starting from studies studying single genomes and following with the analysis of diversity in multiple great ape genomes, I summarize the findings in the most complete dataset of great ape genomes, covering all great ape species and most subspecies, providing an unprecedented view on diversity, demography and population structure in great apes. I finally discuss the most relevant implications of this work and how this can boost the conservation efforts in the protection of great apes.

La nanotecnología es una ciencia emergente que investiga las propiedades de la materia en la escala nanométrica. En esta escala, las propiedades de los materiales empiezan a ser dominadas por los efectos cuánticos en lugar de por las leyes físicas por las que está regida la materia a escala micrométrica y superior. Son estas mismas propiedades, que despiertan tanto interés, las mismas que han levantado suspicacias sobre sus posibles efectos perniciosos sobre la salud humana. En consecuencia, el proyecto Nanogenotox se englobó dentro de los esfuerzos para desarrollar un marco para la regulación de los nanomateriales. Durante el desarrollo del proyecto, los resultados obtenidos en la fase de screening muestran que los distintos nanomateriales utilizados no inducen daño en el DNA de las líneas celulares Caco-2 y BEAS-2B (nanotubos de carbono), y 16HBE (SiO2), evaluados mediante el ensayo del cometa. El ensayo de validación, realizado con todos los laboratorios involucrados en el grupo de trabajo de genotoxicidad in vitro, se llevó a cabo mediante los ensayos del cometa y de micronúcleos, analizando cuatro tipos de nanomateriales, en líneas celulares. Los resultados obtenidos no han mostrado una buena repetibilidad entre laboratorios que, más que atribuirse a deficiencias en los protocolos, puede ser debida a la baja potencialidad genotóxica de los nanomateriales seleccionados. Experimentos adicionales basados en tratamientos crónicos con bajas dosis con nanotubos de carbono y de TiO2 en la línea BEAS-2B muestran que los primeros son capaces de inducir incrementos de ROS y alteraciones cromosómicas en estas condiciones, así como una disminución en la expresión de factores proinflamatorios y una inducción de la transformación celular in vitro. Las nanopartículas de TiO2, pese a ser rápidamente internalizadas, no son capaces de inducir los efectos observados con los nanotubos de carbono. En conclusión, el desarrollo y la información obtenida en este proyecto ayudarán al establecimiento de criterios y metodologías específicas, y en consecuencia un marco regulatorio, para la correcta evaluación del potencial genotóxico de los nanomateriales. / Nanotechnology is an emerging field that investigates the properties of matter at the nanometer scale. On this scale, the material properties begin to be dominated by quantum effects rather than by the physical laws by which matter is governed in the micrometer scale and above, and it is these same properties that arouse much interest the same that raise suspicions about its potential effects on human health. Consequently, the Nanogenotox project was encompassed in the efforts carried out by the European authorities to develop a framework for regulation of nanomaterials. During the development of the project, the results of the screening phase showed that the different nanomaterials used do not induce DNA damage in Caco-2 and BEAS-2B cell lines ( by carbon nanotubes) and 16HBE (by SiO2 nanoparticles), evaluated by the comet assay. The Round Robin test was conducted by all laboratories involved in the in vitro genotoxicity work package of the project by the comet assay and micronucleus assay, analyzing the treatments with 4 types of nanomaterials on two different types of cell lines. The methodology used was not validated due to the absence of clear trends and comparable set of results. Additional experiments based on low dose chronic experiments with carbon nanotubes and TiO2 in the BEAS-2B cell line showed that the former are capable of inducing ROS increases and chromosomal alterations in these conditions as well as a decreased expression of proinflammatory factors and an induction of tumor initiation in vitro. Although internalization of carbon nanotubes in the cells was not observed until the third week of exposure. In contrast, the TiO2 nanoparticles were unable to induce these effects despite being quickly internalized. In conclusion, the development and the information obtained in this project will help to establish criteria and a specific methodology, and therefore a regulatory framework, for the correct evaluation of the genotoxic potential of nanomaterials.

Las aberraciones cromosómicas representan cambios citológicamente visibles que afectan al número o a la estructura de los cromosomas que constituyen el cariotipo de la especie. La asociación entre desórdenes genéticos y presencia de aberraciones cromosómicas las convierte en marcadores de riesgo, especialmente a las aberraciones de tipo estructural (ACs). Se considera que las aberraciones estructurales se generan a partir de roturas de doble cadena (DSBs) no reparadas o reparadas incorrectamente. Sin embargo, no se conocen los factores que pueden modular la formación de las ACs. En este sentido, la estructura y la organización del DNA en los organismos eucariotas generan diferentes niveles de condensación que podrían afectar la distribución de las ACs. Así, la organización de la cromatina relacionada con la actividad génica podría afectar la inducción y el procesamiento de las DSBs, como consecuencia de las posibles diferencias en accesibilidad entre las regiones activas e inactivas transcripcionalmente tanto a los agentes clastogénicos como a las enzimas de reparación. Por otra parte, la persistencia de las ACs es un requisito esencial sobre todo en los estudios retrospectivos o exposiciones crónicas. La estabilidad de las ACs se ha definido en función de su comportamiento durante el proceso de división celular. Sin embargo, ACs consideradas estables desde un punto de vista mitótico pueden también producir células desequilibradas si el cambio estructural afecta la expresión de uno o más genes esenciales para la supervivencia celular. Por lo tanto, la frecuencia y distribución de las ACs entre los cromosomas será el resultado de la inducción, procesamiento y persistencia del daño cromosómico.Teniendo en cuenta estas consideraciones, en esta Tesis doctoral se planteó evaluar in vivo e in vitro el efecto del tamaño y densidad génica de los cromosomas sobre la distribución y persistencia de las ACs, así como estudiar el efecto de la estructura de la cromatina en la inducción, procesamiento y persistencia del daño cromosómico. Para ello se analizó la distribución de las ACs bajo diferentes condiciones de exposición, utilizando diferentes marcadores y modelos celulares en función de los objetivos concretos. La distribución de las ACs se analizó utilizando la técnica de FISH.Así, en esta tesis doctoral se analizó la distribución de las ACs entre los cromosomas de mayor tamaño (cromosomas 1 y 4) y los de menor tamaño (cromosomas 18 y 19) que más difieren en densidad génica. Los estudios se realizaron in vitro después del tratamiento con un agente químico, como la bleomicina, o después de dosis altas de radiación ionizante y, in vivo después de dosis bajas de radiación ionizante. Los resultados obtenidos indican que la distribución de las ACs es proporcional al tamaño de los cromosomas estudiados independientemente de la densidad génica de éstos. Tampoco se detectaron diferencias entre los cromosomas al realizar el seguimiento de las ACs en el tiempo. Así, el tamaño y densidad génica de los cromosomas no afectan la distribución de las ACs ni la persistencia de las translocaciones. Por lo tanto, el tamaño y la densidad génica de los cromosomas no son factores a tener en cuenta a la hora de seleccionar los cromosomas a partir de los cuales estimar la frecuencia de ACs en estudios retrospectivos.Por otra parte, al utilizar un inhibidor de la reparación, como el ara-C, se detectaron diferencias intercromosómicas en la capacidad de reparación por escisión de las lesiones inducidas por la bleomicina. Además, de obtenerse resultados que indican la implicación de otras lesiones, además de las DSBs, en la formación de las ACs.La distribución y persistencia de las ACs se comparó también entre una región de heterocromatina constitutiva y una región de eucromatina. En este caso el estudio se realizó en células de hámster chino debido a que los cromosomas de hámster chino presentan grandes regiones de heterocromatina constitutiva. El análisis se realizó a nivel de los cromosomas sexuales tanto en interfase como en metafase utilizando FISH específica de brazo. El estudio en interfase se realizó mediante la técnica de condensación prematura de cromosomas (PCC) con el objetivo de analizar la inducción inicial y la dinámica de reparación durante las primeras horas después de la exposición. Los resultados indican que la estructura de la cromatina afecta a la inducción pero no al procesamiento de las DSBs. Por otra parte, la mayor frecuencia de intracambios respecto la de intercambios reflejó el efecto de proximidad en la interacción de las DSBs y el papel de la organización territorial de los cromosomas interfásicos en la formación de las ACs. En cuanto a la persistencia de las ACs, se observó una tendencia a una menor persistencia de las ACs que implican a regiones heterocromáticas. Para contrastar los resultados obtenidos en células de hámster chino, se comparó en células humanas la distribución de las ACs entre una región de heterocromatina constitutiva, la banda 1q12, y una región principalmente eucromática, la región 17cen-p53. En este caso, no se detectó el efecto de la estructura de la cromatina en la distribución de las ACs pero sí se detectó el efecto en la persistencia de las ACs. De hecho, la elevada inestabilidad de las translocaciones que afectan a la banda 1q12 puede tener implicaciones al utilizar las roturas en esta banda como un biomarcador de daño cromosómico en los estudios de biomonitorización. Por otra parte, la banda 1q12 presenta mayor capacidad fusigénica que otras regiones del genoma. / Chromosome aberrations cytologically represent visible changes that affect the number or the structure of the chromosomes that constitute the karyotype of a species. The association between genetic disorders and the presence of chromosome aberrations makes them good risk markers, specially the structural type aberrations (CAs).It is considered that structural aberrations are generated from unrepaired, and/or incorrectly repaired, double strand breaks (DSBs), but the factors that can modulate the formation of the CAs are unknown. In this sense, the structure and the organisation of the DNA in eukaryotic organisms generate different levels of condensation that might affect the CAs distribution. Thus, the organisation of the chromatin related to gene activity could affect the induction and the processing of the DBSs which may be due to the possible differences in accessibility between the transcriptionally active and inactive regions. The persistence of CAs is an essential requirement in retrospective studies or chronic exposures. The definition of CAs stability has been based on their behaviour during the cellular division process. Nevertheless, CAs that are considered stable from a mitotic point of view can also produce unbalanced cells when the expression of one or more essential genes affects cell survival. Therefore, the frequency and distribution of the CAs between the chromosomes will be the result of the induction, the processing and the persistence of chromosome damage. In this PhD Thesis, the aim was to evaluate, both in vivo and in vitro, the effect of the size and gene density of the chromosomes on the distribution and persistence of the CAs, including a study of the effects of chromatin structure in the induction, processing and persistence of chromosomal damage. The distribution of the CAs was analysed using the FISH technique under different conditions of exposure by using different markers and cellular models based on the concrete objectives. Thus, in this PhD Thesis the distribution of CAs between the bigger chromosomes (chromosomes 1 and 4) and the smaller ones (chromosomes 19 and18) that have the most gene density difference was analysed. The studies were carried out in vitro after treatment with a chemical agent (bleomycin), or after high doses of ionizing radiation and, in vivo after low doses of ionizing radiation. The results indicate that the distribution of CAs is proportional to the size of the chromosomes independently of their gene density. Moreover, when the persistence of the CAs was analysed, no differences were detected. Thus, the size and gene density of the chromosomes do not affect the distribution of CAs or the persistence of the translocations, therefore, in retrospective studies these are not factors to consider when selecting chromosomes from which to consider the frequency of CAs. On the other hand, when using a repair inhibitor, such as ara-C, interchromosome differences in the capacity of excision repair were detected. In addition, the results indicate the implication of other lesions in the formation of the CAs apart from the DSBs. The distribution and persistence of the CAs were also compared in a region of constitutive heterochromatin and a region of euchromatin. In this case the study was performed using Chinese hamster cells because their chromosomes present large regions of constitutive heterochromatin. The analysis was carried out in the sex chromosomes both in interphase and metaphase by FISH, using chromosome arm-specific probes. The interphase study was performed using the PCC technique to analyse the initial induction and repair dynamics during the first hours after exposure. The results indicate that the structure of the chromatin affects the induction but not the processing of the DSBs. The higher frequency of intra- changes when compared to interchanges reflects the proximity effect in the interaction of DSBs and the role of the territorial organisation in the formation of the CAs. With regards to the persistence of CAs, there is a tendency towards less persistence when the heterochromatin regions are involved. In order to contrast the results from Chinese hamster cells with human cells, the distribution and persistence of the CAs was analysed in the constitutive heterochromatin band (1q12), and in a mainly euchromatic region (17cen-p53). In this case, there is no effect of the chromatin structure on the CAs distribution, whilst the effect on the persistence of CAs is detected. In fact, the high instability of the translocations involving the 1q12 band could lead to an underestimation of the damage when using the breaks in this band as biomarkers of chromosomal damage in biomonitorization studies. On the other hand, the 1q12 band presents greater fusigenic capacity than other regions of the genome.

La importancia de los plaguicidas recae tanto en los numerosos beneficios que tienen para la sociedad (protectores de plagas de las cosechas, erradicación de vectores que propagan enfermedades, etc.); como en los efectos negativos que representan para la salud (problemas reproductivos, sarcomas, linfomas, etc.). Los colectivos en contacto más directo con estos productos, como son los agricultores, tienen un mayor riesgo de sufrir los efectos adversos que se han asociado con los plaguicidas.Esta Tesis comprende una serie de trabajos sobre la evaluación del daño genotóxico de los plaguicidas en cuatro poblaciones agrícolas europeas, mediante la técnica de micronúcleos (MN) en dos tipos celulares: linfocitos de sangre periférica y células de descamación de la mucosa bucal. Paralelamente, también se determinó el índice de proliferación celular (CBPI).Las poblaciones que se han estudiado pertenecen a colectivos agrícolas con una continua exposición a plaguicidas, procedentes de Almería (España), Malopolska (Polonia), Nea Makri (Grecia) y del sudeste de Hungría. Cada población ha sido evaluada individualmente y finalmente se han agrupado y analizado los datos conjuntos, para obtener una visión general de los efectos de la exposición.Además, en la población almeriense se realizó un estudio longitudinal, para evaluar la existencia de diferencias estacionales en dos periodos de distinta aplicación de plaguicidas. Asimismo, en esta población se evaluó la posible influencia de los genotipos GSTM1 y GSTT1 sobre la susceptibilidad individual en al respuesta genotóxica a la exposición a plaguicidas. Únicamente se observó una relación entre GSTM1 y CBPI disminuyendo este último en presencia del producto del gen GSTT1 en los agricultores.A pesar de que en alguna población se observa una tendencia a un mayor número de células binucleadas con micronúcleos (BNMN), en los linfocitos de los individuos expuestos a plaguicidas, en ninguna de las poblaciones evaluadas individualmente ni en el análisis global de la población, las diferencias observadas llegan a alcanzar un nivel estadísticamente significativo. Lo mismo ocurre con las células bucales con MN (CBMN).Respecto del CBPI, en la mayoría de poblaciones se observan descensos, significativos o no, de los valores del mismo en el colectivo agrícola. Al valorar toda la población en global estas variaciones se traducen en un descenso significativo del CBPI en los individuos expuestos a plaguicidas, lo que refleja el efecto citotóxico de los mismos.En el análisis global, observamos que el hecho de pertenecer a un país u otro confiere una serie de características particulares a cada grupo, que se reflejan en una mayor frecuencia de un determinado tipo de daño genético según el sistema celular estudiado.Otro de los objetivos de la Tesis era valorar los factores higiénicos, de salud, de exposición a plaguicidas, de protección laboral, de alimentación, etc., que podían influir en las variaciones de la frecuencia de micronúcleos y en la proliferación celular. Entre los factores que han mostrado tener un efecto significativo en la variación de las frecuencias de las variables de estudio están la edad, el hecho de ser mujer, el tabaco, la exposición a rayos X por diagnóstico médico, así como factores de la dieta (consumo de vegetales crudos, pescado y aceite de oliva). Hay que destacar el incremento significativo en el porcentaje de abortos encontrados en la población agrícola de Polonia, lo que junto con el elevado número de intoxicaciones y el descenso del CBPI en este colectivo nos indica que, a pesar de no observarse un incremento significativo de daño genético detectable mediante el ensayo de MN, los plaguicidas están ejerciendo efectos biológicos adversos sobre los agricultores. / The importance of pesticides can be reflected as much on the benefits that they represent for society (crops pest prevention, vector erradication); as on the negative effects they have on health (reproductive problems, sarcomas, lymphomas, etc.). These adverse effects mainly affect occupationally exposed populations, such as farmers.This PhD Thesis comprises a series of works on the evaluation of genotoxic damage caused by pesticide exposure of four agricultural European populations, using the micronucleus assay (MN). Both lymphocytes of peripheral blood and exfoliated cells of the oral mucosa were used. The cytokinesis-block proliferation index (CBPI) was also calculated to detect possible variations in the proliferative kinetics of lymphocytes (due to the pesticide exposure).Populations from Greece, Spain, Poland and Hungary, all with an intense and continuous agriculture activity, were evaluated individually. Finally, in order to obtain a general effect of the exposure to pesticides, all the data was pooled and analysed together.Furthermore, a follow-up study was carried out in the Spanish population to determine, at two different periods of time and different pesticide intensity application, if there were season-related differences in the MN frequency.In this population, to look for relationship between the genotypes and the cytogenetic response, each donor was assessed for the presence or absence of glutathione S-transferase M1 and GSTT1. Only in the exposed individuals, the CBPI appeared to be affected, decreasing in the presence of GSTT1.Although in some populations we observed a trend to a high number of BNMN (binucleated cells with micronucleus) in the lymphocytes of farmers exposed to pesticides, none of the statistical analysis showed significant differences between controls and farmers, for neither lymphocytes nor buccal cells with MN.Regarding the CBPI, decreases were observed in most of the pesticide-exposed populations. In the evaluation of all the populations, the group occupationally exposed to pesticides showed a significantly lower CBPI level, indicating some cytotoxicity due to the exposure.The global analysis showed us that the increases in genetic damage seemed to be related to different cellular systems for each country, revealing the particular characteristics of the populations evaluated.One of the aims was to assess the hygienic and health factors, exposure to pesticides, work protective measures, diet, etc., that could influence on the frequency variations of MN and cell proliferation. From the studied variables, those with a significant effect on the frequencies studied were age, the fact of being woman, tobacco, X-ray medical exposure and some diet factors (consuming raw vegetables, fish and olive oil).The agricultural Polish population showed a significant increase in the percentage of miscarriages, which together with the high number of intoxications and the CBPI decrease in this group, showed us that pesticides do have biological adverse effects on the farmers despite the lack of a significant increase of cytogenetic damage evaluated by the MN assay.