Els individus portadors de translocacions cromosòmiques equilibrades presenten un risc incrementat de produir gàmetes amb anomalies cromosòmiques, ja sigui per una segregació desequilibrada dels cromosomes reorganitzats o per la formació d’anomalies numèriques derivades de l’efecte intercromosòmic. Es desconeix si existeix una relació entre les anomalies derivades d’ambdós esdeveniments, que podria residir en l’aparició de fenòmens d’heterosinapsi entre els multivalents i altres cromosomes durant la profase I. D’altra banda, l’heterosinapsi s’ha relacionat amb canvis en l’arquitectura nuclear dels cromosomes en espermatozoides, que en última instància també podrien afectar la fertilitat dels individus portadors. Els objectius d’aquesta tesi han estat: i) Desenvolupar un mètode d’anàlisi seqüencial basat en tècniques d’hibridació in situ fluorescent (FISH) que permeti identificar anomalies cromosòmiques numèriques i determinar el mode de segregació dels cromosomes reorganitzats sobre els mateixos espermatozoides; ii) Caracteritzar els patrons de segregació de diferents reorganitzacions cromosòmiques en espermatozoides no seleccionats i en espermatozoides portadors d’anomalies numèriques; iii) Determinar si existeix una relació entre els diferents modes de segregació dels cromosomes reorganitzats i la producció d’espermatozoides amb anomalies numèriques; iv) Desenvolupar una tècnica d’anàlisi que permeti valorar la disposició tridimensional dels territoris cromosòmics en nuclis d’espermatozoides. S’han recollit mostres de semen de vuit individus portadors de translocacions recíproques, onze portadors de translocacions Robertsonianes i un portador d’una triple translocació. En la primera ronda de FISH seqüencial s’han detectat espermatozoides amb anomalies numèriques per cinc cromosomes no relacionats amb la reorganització. En la segona ronda s’han analitzat els productes de segregació dels cromosomes reorganitzats en els espermatozoides amb anomalies numèriques detectats prèviament, així com en espermatozoides no seleccionats. L’optimització del sistema d’anàlisi de la disposició dels territoris cromosòmics en el nucli espermàtic ha inclòs la selecció de nuclis segons el seu genotip, la captura d’imatges tridimensionals, la relocalització dels nuclis d’interès, el tractament digital de les imatges, la normalització de les dades i l’obtenció dels valors de posicionament dels centròmers en l’eix longitudinal i radial de l’espermatozoide. Els resultats de l’anàlisi de segregació en espermatozoides no seleccionats mostren una elevada homogeneïtat dels patrons de segregació entre portadors del mateix tipus de translocació, caracteritzats per una elevada freqüència dels modes de segregacions que impliquen la disjunció a pols cel·lulars oposats dels cromosomes amb centròmers homòlegs. Els resultats de segregació en espermatozoides aneuploides i diploides/múltiples disòmics mostren un patró de segregació alterat respecte els espermatozoides no seleccionats, on s’afavoreixen els modes de segregació desequilibrats, en detriment dels productes de segregació equilibrats. Els espermatozoides amb diferents tipus d’aneuploïdies i amb diferents cromosomes implicats, influeixen per igual al patró de segregació alterat. Els resultats sobre el posicionament tridimensional dels cromosomes han permès validar la metodologia desenvolupada, ja que s’ha obtingut informació sobre la localització preferent dels cromosomes estudiats en nuclis amb diferents genotips. Els resultats obtinguts demostren una associació entre la presència d’anomalies numèriques i un contingut desequilibrat dels cromosomes reorganitzats. L’acumulació d’anomalies cromosòmiques en els mateixos gàmetes pot ser atribuïble a un efecte bidireccional de l’heterosinapsi, que comportaria un canvi en la localització nuclear dels cromosomes afectats i una alteració en la formació dels quiasmes. Els problemes d’orientació dels cromosomes a la placa metafàsica poden provocar una aturada meiòtica prolongada, que en cas de no corregir-se, es podria resoldre a través de l’evasió del punt de control. Aquest fet afavoriria la producció de gàmetes que podrien acumular anomalies procedents de segregacions desequilibrades, a més d’aneuploïdies d’altres cromosomes. La tècnica desenvolupada per estudiar l’arquitectura nuclear dels espermatozoides permetrà determinar si les anomalies cromosòmiques presents en els gàmetes dels individus portadors de reorganitzacions cromosòmiques afecten l’organització nuclear global dels cromosomes i condicionen la seva fertilitat. / Carriers of chromosomal translocations present a high risk of producing chromosomally abnormal gametes, as a consequence of an unbalanced segregation of the rearranged chromosomes, or the presence of numerical chromosomal anomalies derived from an interchromosomal effect. It is not known whether there exists a relationship between anomalies produced by these two events, but it might be based on the occurrence of heterosynapsis at the meiotic prophase I between multivalents and other chromosomes. Moreover, heterosynapsis has been associated related to changes in the nuclear chromosome architecture in sperm, which may also affect the fertility of reorganization carriers. The objectives of this thesis have been: i) To develop a sequential fluorescence in situ hybridization (FISH) protocol in order to detect numerical chromosomal abnormalities and to establish the segregation mode of rearranged chromosomes in the same spermatozoa; ii) To establish the segregation pattern of different chromosomal rearrangements in random sperm and in sperm with numerical abnormalities; iii) To determine whether there exists a relationship between certain segregation modes and the occurrence of numerical chromosome abnormalities; iv) To develop a methodology to evaluate the tridimensional distribution of chromosome territories in sperm nuclei. Semen samples of eight carriers of reciprocal translocations, eleven carriers of Robertsonian translocations and one carrier of a three-way translocation have been included in the study. In the first sequential FISH round, numerical anomalies for five chromosomes unrelated to the rearrangements have been analysed. In the second round, a segregation analysis has been performed both in the numerically abnormal sperm detected in the first round as well as in randomly assessed sperm. The optimization of the analysis of chromosome territories in sperm nuclei has included: nuclei classification according to their genotype, 3D image recording, relocalization of selected nuclei, digital images editing, data normalization, and prediction of the preferred position of each hybridization signal along the longitudinal and radial axis of spermatozoa. The segregation patterns obtained in randomly assessed sperm show high homogeneity among carriers of the same translocation. These patterns involve high frequencies of segregation modes that entail disjunction to opposite cellular poles of chromosomes with homologous centromeres. Data obtained from segregation analysis in aneuploid and diploid/multiple disomic sperm show altered segregation patterns when compared to randomly assessed sperm, in which unbalanced segregation modes are favoured while balanced segregation products decrease. Aneuploid sperm with different types of chromosomal abnormalities or different chromosomes involved in the aneuploidy have the same effect over the altered segregation pattern. The results obtained in the analysis of chromosome territories allow for the validation of the developed methodology. It has allowed the prediction of the preferred positioning of analysed chromosomes in sperm nuclei with different genotypes. In conclusion, data obtained point out that indeed there exists a relationship between the presence of numerical chromosome abnormalities and an unbalanced segregation content in sperm. This accumulation of chromosome anomalies in the same gametes would be driven by a bidirectional effect of heterosynapsis, which could entail changes in the nuclear positioning of the affected chromosomes, as well as alterations in chiasmata formation. The chromosome misalignment at metaphase plate would cause a meiotic arrest. If unresolved, cells could eventually evade this checkpoint favouring the accumulation of both unbalanced segregation products and aneuploidies for other chromosomes in the same gametes. The developed methodology to study the sperm nuclear architecture can be potentially used in carriers of chromosomal rearrangements, in order to assess whether chromosomal abnormalities in sperm affect the global nuclear chromosome organization and disturb their fertility.

L’arsènic inorgànic es presenta com un carcinogen molt ben establert en humans. Milions de persones es troben exposades arreu del món, fonamentalment a través de l’aigua de consum contaminada per aquest compost. Encara que existeixen múltiples mecanismes d’acció pels quals l’arsènic pot exercir els seus efectes carcinògens, la generació de dany oxidatiu en el DNA a partir de les espècies reactives d'oxigen derivades de la seva biotransformació es presenta com un dels mecanismes importants a l’hora d’explicar l’aparició dels fenòmens tumorals associats amb la seva exposició. En aquest context, l’objectiu principal d’aquesta Tesi ha estat demostrar la connexió existent entre la presència de dany oxidatiu i la carcinogènesi associada a una exposició amb arsènic inorgànic. Per arribar a aquest objectiu s’ha implementat una estratègia innovadora de treball en el qual s’emulen les condicions d’exposició ambiental a les que es troben exposades les poblacions humanes. Concretament, aquesta estratègia es basa a desenvolupar un model d’exposició crònica in vitro a dosis subtòxiques d’arsènic inorgànic. A més, s’ha utilitzat un model cel·lular particular constituït per dues línies cel·lulars isogèniques de fibroblasts embrionaris de ratolí (MEF), una de les quals és deficient en la reparació de lesions oxidants del DNA que requereixen el mecanisme BER, exhibint un genotip knockout pel gen Ogg1, un dels gens principals de l’esmentada ruta de reparació del DNA. Al llarg d’aquest període d’exposició crònica a dosis de 0,5, 1 i 2 µM d’arsenit sòdic, es van avaluar diferents paràmetres en ambdues línies cel·lulars, els valors dels quals van ser comparats amb els corresponents controls temporals. Dits paràmetres mesuren els nivells acumulats de dany oxidatiu (8-OH-dG), la capacitat de reparar el dany en el DNA, l’estudi de possibles mecanismes d’adaptació i, finalment, l’adquisició d’un fenotip tumoral in vitro en ambdues línies cel·lulars al llarg d’un procés d’exposició arsenit sòdic del voltant 40 setmanes. Els resultats obtinguts donen suport a la hipòtesi reflectida en l’objectiu principal. Així, les línies cel·lulars Ogg1 deficients (MEF Ogg1 -/-) crònicament exposades a l’arsènic mostren una acumulació progressiva de dany oxidatiu en el DNA, mentre que l’increment d’aquest dany no es detecta en la línia salvatge. Paral·lelament, l’eficiència dels mecanismes de reparació del dany induït en el DNA es veu afectada en ambdues línies cel·lulars, manifestant-se així l’activitat cocarcinògena de l’arsènic. Pel que fa referència a l’adquisició del fenotip tumoral, trobem que l’arsènic és capaç d’induir un fenotip tumoral de manera primerenca en la línia deficient, el que indicaria que el dany oxidatiu en el DNA juga un paper fonamental en la carcinogènesi associada a l’exposició. Així, les cèl·lules Ogg1 -/- manifesten un fenotip tumoral al cap de 30 setmanes d’exposició, caracteritzat per canvis morfològics, un increment en proliferació cel·lular, el descontrol en estat de diferenciació, l’ increment en la secreció de metal·loproteïnases de la matriu extracel·lular, l’adquisició de la capacitat de créixer independent d’ancoratge, i la capacitat de promoure el creixement tumoral i la invasió. A manera de conclusió, aquesta Tesi demostra, principalment i per primera vegada, que el fons genètic referent al gen OGG1 i la inducció de 8-OH-dG són factors rellevant en el procés de carcinogènesi associada a l’arsènic. Indirectament, el treball posa de manifest el risc associat dels individus amb polimorfismes al gen OGG1, fent-los més susceptibles a l’aparició dels efectes genotòxics i carcinògens derivats de l’exposició. / Inorganic arsenic is presented as a very well established human carcinogen. Millions of people around the world are exposed to this compound mainly through contaminated drinking water. Although there are multiple mechanisms of action by which arsenic may exercise their carcinogenic effects, the generation of oxidative DNA damage from reactive oxygen species derived from its biotransformation is presented as one of the most important mechanisms explaining the associated cancer phenomena. In this context, the main objective of this thesis was to demonstrate the connection between the presence of oxidative damage and carcinogenesis, linked to inorganic arsenic exposure. In order to reach this objective, we have implemented an innovative strategy plan which emulated environmental conditions in which human populations are exposed. Specifically, this strategy is based on developing an in vitro model of chronic exposure to subtoxic inorganic arsenic doses. In addition, we used a particular cell model comprising two isogenic cell lines from mouse embryonic fibroblasts (MEF), being one of them deficient in the repair of oxidative DNA lesions that require the BER mechanism, showing a knockout genotype for Ogg1, one of the major genes of this DNA repair pathway. Throughout this period, cells were exposed to 0.5, 1 and 2 µM of sodium arsenite for 40 weeks. Different parameters were evaluated in both cell lines, the values of which were compared with the corresponding time-matched controls. These parameters were the accumulated levels of oxidative damage (8-OH-dG), the ability of repairing DNA damage, the mechanisms of adaptation and, finally, the acquisition of an in vitro tumor phenotype. Results supported the main hypothesis. Thus, Ogg1 deficient cell lines chronically exposed to arsenic showed a progressive accumulation of oxidative DNA damage, whereas that increase was not detected in its wildtype counterparts. Moreover, the efficiency of DNA repair mechanisms in repairing the induced damage was affected in both cell lines, manifesting the arsenic co-carcinogen activity. Taking into account the acquisition of the tumor phenotype, we found that arsenic can induce an early tumor phenotype in the deficient Ogg1 cell line, indicating that oxidative DNA damage plays a role in carcinogenesis associated with the exposure. Thus, Ogg1 - /- cells expressed a tumor phenotype after 30 weeks of exposure, characterized by morphological changes, an increase in cell proliferation, the lack of a correct differentiation status, the increase in secretion of extracellular matrix metalloproteinases, the acquirsition of the ability to grow independent of anchor, and the acquisition of the ability to promote tumor growth and invasion. In conclusion, this thesis shows for the first time that the genetic background of the reference gene OGG1 and the induction of 8-OH-dG are key factors in the arsenic-associated carcinogenesis. Indirectly, the work highlights the associated risk of individuals carrying OGG1 gene polymorphisms, as they are expected to be more susceptible to the genotoxic and carcinogenic effects of the exposure.

Williams-Beuren syndrome is a neurocognitive disorder with multisystemic manifestations of variable expressivity caused by a 1.55-1.83 Mb at chromosomal band 7q11.23. In this thesis project we have characterized the 7q11.23 deletion to refine the breakpoint location of the deletion, identify hospots and search for putative cis and trans-acting mechanisms involved. We have also characterized novel and previously reported metabolic alterations in a cohort of patients and explored its association with putative candidate genes using different mouse models and gene association analyses. Finally, we have increased the knowledge of cardiovascular disease by analyzing a complete and detailed database; as well as specific diagnostic procedures, including echocardiogram and ambulatory blood pressure monitoring. Hypertensive patients were treated with losartan with a reevaluation at 12 months after treatment. We have explored clinical-molecular associations with the cardiovascular phenotype, including an association analysis with possible genetic modifying factors / El síndrome de Williams-Beuren es un trastorno del neurodesarrollo causado por una deleción de 1.55-1.83 en la banda cromosómica 7q11.23. El síndrome de Williams-Beuren se caracteriza por manifestaciones multisistémicas de expresividad variable. En este proyecto de tesis hemos caracterizado la deleción 7q11.23 para determinar el punto de quiebre de la deleción, identificado puntos calientes y buscado posibles factores en cis y trans que puedan influir en la recombinación. Hemos descrito alteraciones metabólicas, previamente reportadas y nuevas, en una cohorte de pacientes y buscado su asociación con posibles genes candidatos mediante el uso de modelos murinos y estudios de asociación. Finalmente hemos descrito en mayor detalle el fenotipo cardiovascular mediante el análisis de una base de datos completa y detallada, así como el estudio de algunas herramientas diagnósticas incluyendo ecocardiograma y monitorización ambulatoria de la tensión arterial. Pacientes hipertensos fueron tratados con losartán y reevaluados un año después. Hemos explorado las correlaciones clínico-molecular del fenotipo cardiovascular e incluido estudios de asociación con posibles genes modificadores del fenotipo.

La anemia de Fanconi (AF) es un trastorno genético raro de inestabilidad genómica que se caracteriza por insuficiencia de la médula ósea y predisposición al cáncer. Las 19 proteínas AF conocidas hasta el día de hoy están implicadas en la reparación de los enlaces entrecruzados del ADN (ICL). El diagnóstico molecular es de capital importancia para los pacientes AF y sus familias. La caracterización de las mutaciones permite el diagnóstico prenatal y preimplantacional, de identificar portadores en las familias y de descartar la enfermedad en donantes emparentados para el trasplante de médula ósea (TMO). Las mutaciones pueden ser utilizadas como marcadores para monitorizar el éxito del TMO y también son importantes para el desarrollo de nuevas terapias como la terapia génica o las últimas técnicas de "edición de genoma" para corregir el gen mutado AF. Debido a la heterogeneidad genética de la AF la identificación del gen mutado puede requerir varios meses de trabajo altamente especializado. El uso de las tecnologías de nueva generación para la secuenciación del ADN como la secuenciación del exoma (whole exome sequencing; WES) pueden ser una válida alternativa para caracterizar molecularmente los pacientes AF independientemente del subtipo. En este estudio se presentan los resultados de la caracterización molecular de 49 pacientes deAF utilizando WES. Para simplificar el proceso de diagnóstico molecular, se utilizó un kit comercial para el enriquecimiento de las secuencias exómicas y caracterizamos las grandes deleciones por análisis de cobertura. Todas las mutaciones encontradas fueron confirmadas por secuenciación de Sanger o Multiplex ligation-dependent probe amplification (MLPA). Fuimos capaces de caracterizar por completo 42 de 49 pacientes (85,7%) y 91 de 99 alelos mutados (92,8%) demostrando así el potencial de la WES para la caracterización molecular de la AF. El análisis por WES de individuos AF no clasificados nos permitió descubrir como causa de AF mutaciones bialélicas en ERCC4, un gen que codifica para la nucleasa XPF previamente conectada con la reparación por escisión de nucleótidos (NER) y con los síndromes Xeroderma Pigmentosum y progeria XFE. La complementación del fenotipo de las líneas celulares de AF con el cDNA wt de ERCC4, proporcionó la evidencia genética de que las mutaciones en ERCC4 causaban este subtipo de AF (FA-Q). Análisis bioquímicos y funcionales demostraron que las mutaciones en ERCC4 que causan AF- alteraban la función de XPF en la reparación de los ICL sin comprometer la NER. Nuestros datos demuestran que, dependiendo de las mutaciones en ERCC4 y el resultante equilibrio entre ambas actividades de reparación del ADN, los individuos pueden presentar tres trastornos distintos, Nuestros estudios destacan la naturaleza multifuncional de la endonucleasa XPF en la estabilidad del genoma y las enfermedades humanas. Para investigar el papel de ERCC4 en la susceptibilidad al cáncer de pecho y ovario, como ocurre con otros genes AF, examinamos los 11 exones y las regiones intrónicas proximales de ERCC4 in1573 casos de cáncer familiar de mama y ovario, que habían dado negativo para mutaciones en BRCA1 y BRCA2 y 854 controles. La prevalencia de los portadores de mutaciones en ERCC4 no difiere entre los casos y los controles, sugiriendo que ERCC4 no es un gen de susceptibilidad al cáncer de mama y ovario. Curiosamente, la prevalencia de portadores de mutaciones en ERCC4 (1/288 individuos) es similar a la reportada para FANCA, mientras que hay 100 veces más pacientes FA-A que FA-Q. Esto indica que la mayoría de las combinaciones de mutaciones bialélicas en ERCC4 son letales a nivel embrionario. Por último, se identificaron mutaciones adicionales en ERCC4 capaces de interrumpir específicamente la reparación de los ICLs. / Fanconi anemia (FA) is a rare genomic instability disorder characterized by progressive bone marrow failure and predisposition to cancer. 19 FA-associated proteins are involved in the repair of DNA interstrand crosslinks (ICLs). Molecular diagnosis is a capital issue for FA patients and their families. The characterization of the mutations allows prenatal and preimplantacional diagnosis, permit to identify carriers in FA families and to rule out the disease in related donors’ bone marrow transplantation (BMT). Mutations can be used as markers to monitor the success of BMT and their characterization is also required for the development of new therapies such as gene therapy or the latest techniques of "genome editing" to correct the defect in the mutated FA gene. Due to the genetic heterogeneity of FA the identification of the mutated gene in a given FA patient can require several months of highly specialized work. The use of the latest Next Generation Sequencing technologies such as whole exome sequencing (WES) could be a valid alternative to subtype and molecularly characterize all FA patients regardless of their complementation groups. In this study we present the results of the molecular characterization of 49 FA patients using WES. To simplify even more the molecular diagnosis process, we used a commercial kit for target enrichment of our samples and we characterized large deletions by coverage analysis. All mutations found were confirmed by Sanger sequencing or Multiplex ligation-dependent probe amplification (MLPA). We were able to completely characterize 42 out of 49 patients (85,7%) and 90 out of 97 mutated alleles (92,8%) thus demonstrating the potential of WES in FA molecular characterization. WES of unclassified FA individuals allowed us to discover biallelic germline mutations in ERCC4 (XPF) as a cause of FA: ERCC4 encodes for XPF a structure-specific nuclease- previously connected to nucleotide excision repair (NER) and to Xeroderma pigmentosum and XFE progeroid syndromes. Genetic reversion with wild-type ERCC4 cDNA of FA cell lines phenotype, provided genetic evidence that mutations in ERCC4 cause this FA subtype (FA-Q). Further biochemical and functional analysis demonstrated that the identified FA-causing ERCC4 mutations strongly disrupt the function of XPF in DNA ICL repair without severely compromising NER. Our data show that depending on the type of ERCC4 mutations and the resulting balance between both DNA repair activities, individuals present with one of three clinically distinct disorders, highlighting the multifunctional nature of the XPF endonuclease in genome stability and human disease. To investigate the possible role of ERCC4 in breast and ovarian cancer susceptibility, as occurs with other FA genes, we screened the 11coding exons and exon–intron boundaries of ERCC4 in1573 index cases from high-risk Spanish familial breast and ovarian cancer pedigrees that had been tested negative for BRCA1 and BRCA2 mutations and 854 controls. The frequency of ERCC4 mutation carriers does not differ between cases and controls, suggesting that ERCC4 is not a cancer susceptibility gene. Interestingly, the prevalence of ERCC4 mutation carriers (1/288) is similar to that reported for FANCA, whereas there are approximately100-fold more FA-A than FA-Q patients, indicating that most biallelic combinations of ERCC4 mutations are embryo lethal. Finally, we identified additional ERCC4 mutations specifically disrupting ICL repair.

Una inversió és una reordenació genòmica que altera l'orientació d'una seqüència genòmica específica. Les inversions són reordenaments balancejats i no impliquen necessàriament un guany o pèrdua d'ADN, però tot i així poden alterar el contingut genètic original i causar-hi mutacions. A més, les inversions poden modificar els patrons de recombinació d’ADN tan de la seqüència genòmica continguda en la inversió com també en regions flanquejants. Conseqüentment, les inversions poden estar associades a certs fenotips o malalties, influir en l’evolució dels individus portadors a través de processos adaptatius o jugar un paper clau en l’origen de noves espècies. Per tot això, expandir el nostre coneixement de les inversions és clau per a la comprensió en profunditat de la variació del genoma i les seves conseqüències. Tanmateix, la nostra comprensió tan de l’abundància com de l’impacte funcional de les inversions en el genoma humà és escàs, i se sap ben poc sobre la seva associació a canvis d'expressió gènica en aquesta espècie. Durant els últims 10 anys, l’aparició de noves tecnologies de seqüenciació genòmica ha fet permès l'estudi de les variacions estructurals a gran escala, incloent les inversions. Aprofitant aquesta oportunitat,, el projecte INVFEST ha dedicat esforços en la construcció del catàleg d' inversions polimòrfiques en humans més precís i exhaustiu fins a la data. Per aconseguir-ho,, hem demostrat que GRIAL, l’únic mètode disponible dissenyat específicament per identificar inversions a partir de l’alineament de fragments aparellats (“PEM”), prediu inversions amb més precisió i eficiència que altres mètodes de detecció basats en “PEM”, i sobretot refina molt millor els punts de trencament. A més, les prediccions d’inversió de GRIAL s’han filtrat utilitzant diversos filtres pre i post mapeig, juntament amb la inspecció manual de casos complexos, aconseguint així una reducció de la taxa de falsos positius. A continuació, per obtenir una major comprensió sobre l'impacte funcional de les inversions polimòrfiques en el genoma humà, hem examinat el solapament de 44 inversions amb gens. En general, els nostres resultats mostren que les inversions tendeixen a estar ubicades en regions intergèniques encara que hem identificat un 13,6% dels casos on les inversions afecten exons de gens. Per tal d’analitzar com les inversions afecten l’expressió gènica, s’han realitzat dos estratègies complementaries. La primera consisteix en un anàlisi d’expressió diferencial en línies cel·lulars limfoblàstiques (“LCLs”) de 527 mostres de poblacions HapMap europees, asiàtiques i africanes. La segona està basada en l’anàlisi de marcadors d’inversió (“tag-SNPs”) associats a canvis en l’expressió de gens en diferent teixits. Conjuntament, hem identificat 19 inversions que modulen l'expressió gènica de 43 gens en múltiples teixits. Aquests resultats semblen coherents, ja que un subconjunt (N = 11) de les associacions trobades en “LCLs” ha estat identificat per ambdós mètodes. En concret, hem identificat una inversió que afecta l'expressió de gens paràlegs codificants de les proteïnes IFITM2 i IFITM3 en limfoblasts. Hem validat també la metodologia emprada per a l'anàlisi d'expressió diferencial reproduint associacions conegudes amb gens de dues inversions àmpliament estudiades (17q21.31, 8p23.1), identificant així noves associacions no descrites entre 17q21.31, 8p23.1 i l'expressió de 6 gens en total. A més, en el cas de 17q21.31, observem que almenys 2 d'aquests gens estan associats a reordenaments estructurals en la regió estudiada. Finalment, hem buscat possibles associacions d’inversions amb malalties, i hem identificat un cas on la inversió sembla estar associada amb esclerosi lateral amiotròfica en dos estudis d’associació genòmica (“GWAS”) diferents. El coneixement adquirit en aquest estudi contribueix així a una millor comprensió del paper de les inversions polimòrfiques en la regulació de l'expressió gènica i en les conseqüències d'aquest tipus de variant estructural tan poc estudiada en humans. / An inversion is a balanced genomic rearrangement that alters the orientation of a specific genomic sequence. Despite not usually causing gain or loss of DNA, inversions can alter the original genetic background and produce mutational and positional effects on genes. In addition, inversions can alter recombination patterns both on the DNA sequences encompassed by them and in their vicinity. Therefore, inversions may associate with certain phenotypes or diseases, shape the evolutionary fate of the carriers by adaptive processes or even play a role in the origin of new species. For all that, increasing our knowledge of inversions constitutes a key issue for in-depth understanding of genome variation and its consequences. However, little is known about the prevalence and functional impact of inversions in the human genome, and in particular of their association with gene expression changes in humans. For the last 10 years, the advent of novel genomic technologies has enabled the study of SVs, including inversions, in a high-throughput fashion within and across species. State of the art genomic research provides the means and tools to explore the human genome in detail and expand our knowledge of inversions. Against this backdrop, the INVFEST project has devoted efforts to build the most accurate and exhaustive catalogue of human polymorphic inversions to date. For that, we have benchmarked GRIAL, currently the only paired-end mapping (PEM) based algorithm specifically designed to predict inversions, and demonstrated that performs with more accuracy and efficiency compared to other PEM based SV-detection methods, particularly in refining inversion BPs. In addition, we have curated GRIAL inversion predictions by using several pre and post PEM mapping filters coupled with manual inspection of complex cases and minimized the rate of false positive predictions. Next, to gain further insight on the functional impact of polymorphic inversions in the human genome, we examined the overlap of 44 different inversions with genes. Overall, our results show that inversions tend to be located in intergenic regions but in 13.6% of the cases gene exons are affected. We performed two complementary approaches to identify inversion associations with gene expression. First, we performed a linear regression analysis in three different expression datasets derived from 527 lymphoblastoid cell lines (LCLs) of European, Asian and African HapMap individuals. Second, we interrogated blood and non-blood tissues by contrasting expression quantitative trait loci (eQTL) data with inversion tag-SNPs. We report 19 inversion rearrangements that modulate gene expression of 43 genes in several tissues. These results seem consistent as a subset (N = 11) of the associations found in LCLs has been identified by both approaches. Interestingly, we have identified an inversion that affects the expression of paralogous protein-coding genes (IFITM2/IFITM3) in lymphocyte-derived cells. We have also validated the methodology used for differential expression analysis by reproducing known effects of two well-studied inversions (17q21.31, 8p23.1) and identified novel associations of both inversion haplotypes with the expression of 6 genes. Moreover, we observe that at least 2 of these genes are associated to 17q21.31 structural rearrangements. Finally, we have looked for possible associations of inversions with disease and found one inversion that seems to be associated with amyotrophic lateral sclerosis in two different GWAS studies. Insight gained in this study could therefore contribute to a better understanding of the role of polymorphic inversions in the regulation of gene expression and the consequences of this understudied type of genetic variants in humans.

Tesi realitzada a l'Institut de Biologia Evolutiva (IBE / CSIC-UPF) / Els telòmers són estructures dels extrems dels cromosomes linials d’organismes eucariotes. La longitud telomèrica es manté mitjançant l’enzim telomerasa en la majoria d’eucariotes, on s’hi troba altament conservat. Drosophila, en canvi, empra un mecanisme de replicació telomèrica alternatiu: els retrotransposons de tipus no-LTR anomenats HeT-A, TART i TAHRE. Estudis anteriors han hipotetitzat el cicle de vida que duen a terme aquests transposons per elongar els telòmers, no obstant, aquest encara no ha estat demostrat ni es coneixen els factors cel•lulars que hi participen. A més, no s’ha estudiat mai anteriorment la localització de les proteïnes endògenes de HeT-A i TART, així com només s’ha pogut observar la localització dels seus trànscrits en organismes mutants que sobreexpressen aquests retrotransposons. Aquesta tesi doctoral presenta una caracterització detallada de les proteïnes i els RNAs de HeT-A i TART a diferents teixits salvatges i mutants de Drosophila melanogaster. S’hi identifiquen també diverses proteïnes cel•lulars que interaccionen amb les proteïnes telomèriques de Drosophila, i que podrien estar participant en el seu cicle de vida. D’aquestes, les més rellevants són Nap-1, Z4, Lost i Tral, les quals s’han analitzat en major detall. Algunes de les funcions que aquestes proteïnes estarien duent a terme en el cicle de vida telomèric de Drosophila són: regular l’expressió de HeT-A, localitzar i ajudar al transport correcte de les proteïnes i els RNAs telomèrics dins la cèl•lula, processar els trànscrits telomèrics o regular-ne la traducció, i participar en l’estabilitat telomèrica. En global, aquest estudi contribueix a incrementar els coneixements que es tenien fins ara sobre el cicle de vida telomèric de Drosophila, així com obre tot un ventall de noves proteïnes i factors a investigar en futurs estudis sobre els telòmers d’organismes eucariotes. / Telomeres are structures at the end of the chromosomes of eukaryote organisms. Telomere length is maintained by telomerase enzyme in most eukaryotes, however, Drosophila uses an alternative mechanism to replicate telomeres: the non-LTR retrotransposons HeT-A, TART and TAHRE. Previous reports have hypothesized the life cycle that these transposons perform in order to increase telomere length but it has never been confirmed, and little is known about which cellular factors may participate in it. Even more, the localization of the endogenous proteins of HeT-A and TART has never been studied, and their transcripts have only been observed in mutant flies that overexpress these retrotransposons. This PhD thesis analyzes the localization of HeT-A and TART proteins and RNAs in wild-type and mutant tissues of Drosophila melanogaster. Different cellular proteins that interact with the telomere proteins, and might be involved in the life cycle of HeT-A and TART, are identified. Among them, Nap-1, Z4, Lost and Tral are the most relevant, so we have studied them in detail. Some of the roles that these proteins may be doing in the life cycle of Drosophila telomeres are: regulation of HeT-A expression, cellular localization and transport of the telomere proteins and RNAs, processing and translation regulation of HeT-A and TART transcripts, and telomere stability. Overall, this study contributes to increase the knowledge about the life cycle of Drosophila telomeres, and opens up a range of new proteins and factors to be investigated in future studies about eukaryote telomeres.

La citogenètica convencional detecta un 3-5% dels pacients amb retard global del desenvolupament / discapacitat intel·lectual (RGD / DI) i / o malformacions congènites (MC). L'amplificació de sondes múltiples dependents de lligació (MLPA) permet incrementar la taxa diagnòstica entre 2,4-5,8%. Actualment els arrays d'hibridació genòmica comparada (aCGH) constitueixen l'eina diagnòstica amb major rendiment en pacients amb RGD / DI, MC i trastorns de l'espectre autista (TEA). L'objectiu del present treball ha estat avaluar l'eficiència de l'ús dels aCGH com a tècnica de primera opció diagnòstica en aquestes i altres indicacions (epilèpsia, talla baixa). Per assolir aquest objectiu, s'han estudiat 1.000 pacients afectats de les patologies abans esmentades mitjançant la tècnica de aCGH, utilitzant una estratègia d'hibridació pacient versus pacient i afegint el suport de la tècnica de MLPA en el 50% dels pacients estudiats. En primer lloc es va validar la tècnica i es va escollir la plataforma d’oligoarrays. Per tal de minimitzar costos i incrementar la eficiència, es va utilitzar l’estratègia d’hibridació de pacient versus pacient amb MLPA confirmatòria i es van establir criteris de diagnòstic per optimitzar la detecció de desequilibris patogènics. Per facilitar la interpretació dels resultats es va dissenyar un programa informàtic EasyArray. Es van detectar desequilibris d'efecte patogènic en un 14% dels pacients (140 / 1.000). En funció del fenotip es van diagnosticar un 18,9% dels pacients afectats de RGD / DI; un 13,7% de les MC; un 9,75% de les patologies psiquiàtriques, 1 7,01% dels casos amb epilèpsia i un 13,3% dels pacients amb talla baixa. Dins de les MC destaquen les del sistema nerviós central amb un 14,9% i les cardiopaties congènites amb un 10,6% de diagnòstics. Dins de les patologies psiquiàtriques, destaquen els pacients amb TEA amb un 8.9% de diagnòstics. Podem concloure que la tècnica d’arrayCGH té un rendiment diagnòstic molt superior al del cariotip amb bandes G. La seva utilització com a eina diagnòstica de primera opció juntament amb el disseny d’estratègies d’hibridació no estàndards, suposa una reducció considerable de costos. Els nostres resultats demostren l'efectivitat i eficiència de la utilització de l’arrayCGH com a primera opció en el diagnòstic genètic dels pacients amb sospita de desequilibris genòmics. Tot això avala la seva inclusió dins del Sistema Nacional de Salut. / Conventional cytogenetics diagnoses 3-5% of patients with unexplained developmental delay / intellectual disability (DD / ID) and / or multiple congenital Anomalies (MCA). Multiplex ligation probes Amplification (MLPA) increases diagnostic rate between 2.4 to 5.8%. Currently the array comparative genomic Hybridization (CGH) is the highest performing diagnostic tool in patients with DD / ID, MC and autism spectrum disorders. Our aim was to evaluate the efficiency of the use of aCGH as first-line test replacing the karyotype and MLPA in these and other pathological indications (epilepsy, short stature). A total of 1000 patients referred by one or more of the above mentioned disorders were analysed by aCGH using a methodology / strategy hybrid alternative patient versus patients adding support MLPA technique in 50% of patients studied. Following a validation period, an oligoarray platform was chosen. In order to minimize costs and increase efficiency, a patient versus patient hybridization strategy plus MLPA confirmation was used, and analysis criteria were set to optimise detection of pathogenic imbalances. In order to facilitate interpretation of results, a database application named Easy Array was designed. Pathogenic genomic imbalances were detected in 14% of the cases (140/1000), with a variable distribution of diagnosis according to the phenotypes: 18.9% of patients with DD / ID, 13.7% of MCAS, 9.75% of Psychiatric pathologies, 7.01% of patients with Epilepsy and 13.3% of patients with short Stature. Within the MCA, central nervous system abnormalities and congenital heart diseases accounted for 14.9% and 10.6% of diagnosis respectively. Among the Psychiatric disorders, patients with ASD accounted for 8.9% of diagnosis. We can conclude that Array-CGH provides a substantially higher diagnostic yield tan G-banded chromosomes analysis. Its use as first line test and the development of non-standard hybridization strategies reduces consumable costs considerably. Our results demonstrate the effectiveness and efficiency of the use of arrayCGH as the first line test in genetic diagnosis of patients suspected of genomic imbalances, supporting its inclusion within the National Health System.

Estudios previos de la distribución de los sitios de inserción de los elementos transponibles (ETs) bilbo y gypsy, en cromosomas de Drosophila subobscura se han realizado en aras de entender, con más claridad, la implicación de los ETs a nivel evolutivo y los mecanismos susceptibles de promover su actividad. D. subobscura es una especie interesante para el estudio de estos aspectos ya que colonizó Suramérica y Norteamérica recientemente (hace 30 años aproximadamente). Este escenario de colonización hace que esta especie sea valiosa para el estudio del impacto de la colonización en la dinámica y distribución de los ETs en el genoma. Los resultados de la presente investigación, comparando copias de elementos móviles en poblaciones originales y colonizadoras, apoyan la hipótesis de que la deriva fundadora es la responsable de la distribución bimodal de dos ETs previamente observada en el genoma de las poblaciones colonizadoras. Sin embargo, no podemos descartar, de manera categórica, la existencia de un incremento de las tasas de transposición hacia determinados lugares cromosómicos en las poblaciones colonizadoras. Con el objetivo de determinar si la actividad de los ETs era diferente en poblaciones originales y colonizadoras se realizó un estudio de las tasas de expresión y transposición de los ETs gypsy y bilbo. Las tasas de expresión se analizaron en el tejido total de individuos adultos, ovarios y testículos. Los resultados de los análisis de individuos completos mostraron diferencias en las tasas de expresión de estos elementos, siendo gypsy el que presentó tasas de expresión más altas que bilbo. A este nivel de comparación, las poblaciones colonizadoras mostraron un patrón generalizado de mayores tasas de expresión que las originales. Esto nos hace suponer que existe un aumento de actividad de estos dos elementos a nivel somático en las poblaciones colonizadoras. No obstante, en los análisis de la línea germinal no se observó este patrón: entre las poblaciones colonizadoras y originales no se observaron diferencias generalizadas en las tasas de expresión. Uno de los puntos destacables de este trabajo es la diferencia en las tasas de expresión a nivel de sexos. Gypsy presentó en los análisis de individuos completos tasas de expresión más altas en las hembras, mientras que en la línea germinal dicho incremento se presentó en los machos. Sin embargo, en el caso de bilbo tanto los análisis de individuos completos como los de la línea germinal muestran mayores tasas de expresión en los machos. Los estudios de las tasa de transposición de gypsy mostraron una mayor incidencia de nuevos eventos de transposición en machos de las poblaciones colonizadoras, mientras que en las originales estas diferencias a nivel de sexos no parecen tan evidentes. Los resultados del presente estudio evidencian que existen diferencias en las tasas de expresión de gypsy y bilbo, a diferentes niveles de comparación (sexo, tipo celular y población). Estas diferencias pueden estar determinadas por mecanismos de control diferentes para cada elemento. Se sabe que el control epigenético de la expresión de muchos ETs sigue mecanismos diferentes en tejido germinal y somático. Además este control puede verse influenciado por el ambiente al que esté sometido cada población y por su contenido genético (también influido por la colonización). Esto explicaría las diferencias observadas entre tipos celulares y poblaciones. El conjunto de mecanismos de regulación desplegados por el genoma huésped afectaría la expresión y la dinámica poblacional de estos ETs en el genoma de D. subobscura. / Previous studies about the distribution of the transposable elements (TEs), bilbo and gypsy in Drosophila subobscura chromosomes were done to a better understanding of the role of TEs and the mechanisms triggering their activity. D. subobscura is an interesting species of study because it recently colonized South America and North America (~ 30 years ago); which makes this species valuable for studying the impact of the colonization in the dynamic and distribution of TEs in the genome. This research work where we compare the copies of mobile elements in original and colonizer populations, supports the hypothesis that the founding drift is the responsible for the bimodal distribution, previously observed in two TEs in the genome of colonizer populations. However, we cannot categorically discard the existence of an increase of transposition rates towards particular sites of chromosomes in colonizer populations. In order to assess whether TE activity was different in original vs. colonizer populations, a study of expression and transposition rates of gypsy and bilbo was performed. The expression rates were analyzed in whole adult individuals, ,ovaries and testes. The results of the of whole individual analysis showed differences in expression rates of both elements, being gypsy which showed the highest rate . Moreover, colonizing populations showed a generalized pattern of higher expression rates than original ones. This result suggests an increase in the activity of these two elements at somatic level in colonizing populations. However, this pattern was not observed in the germline analysis of where no differences in expression rates were observed between colonizing and original populations. A major point of this work are the differences in expression rates between sexes. (i.e. between males and females at both levels Gypsy showed the highest expression rate in females, whereas in the germline the largest increase was found in males. However, the expression rates of bilbo were the same when germinal line and the whole individuals males were checked. Studies of gypsy transposition rates showed a higher incidence of new transposition events in males from colonizing populations whereas in original populations these differences were not clear. Results of this study show differences in the expression rates of gypsy and bilbo at different levels: sex, cellular type, and population. These differences could be determined by different control mechanisms specific of each element. It is known that the epigenetic control of expression of many TEs follows different mechanisms in germinal and somatic tissues. Moreover, this control can be influenced by the environment to which each population is exposed and their genetic content (at the same time affected by the colonization). This would explain the observed differences between germinal line, somatic tissues and populations. The regulation mechanisms displayed by the host genome would affect the expression and the population dynamics of these TEs in the D. subobscura genome.

En las inmediaciones de la ciudad de Barcelona existe una zona de polimorfismo robertsoniano (Rb) de ratón doméstico de Europa Occidental (Mus musculus domesticus) que abarca unos 5.000 km2 y se halla rodeada por poblaciones cuyos individuos presentan un cariotipo estándar (St) de 40 cromosomas telocéntricos. En dicha zona se han detectado siete metacéntricos diferentes y animales Rb con números diploides comprendidos entre 27 y 40 cromosomas. El sistema robertsoniano ‘Barcelona’ (SRbB) representa un modelo único dentro del conjunto de las zonas Rb de M. musculus domesticus descritas hasta el momento puesto que carece de una raza cromosómica propia y el conjunto de cromosomas metacéntricos presenta una distribución geográfica clinal escalonada. Si bien al inicio de la presente investigación se disponía de información sobre la estructura de este sistema Rb, la dinámica de dispersión de los metacéntricos era totalmente desconocida. Con el objeto de evaluar posibles cambios en el proceso de fijación de las fusiones Rb y en el grado de aislamiento genético entre poblaciones de individuos con distintas características cariotípicas, se ha efectuado un estudio de la variación espacio-temporal de la estructura del SRbB entre los periodos 1996-2000 y 2008-2010. Asimismo, conociendo previamente la existencia de diferencias en el epitelio seminífero entre individuos St y Rb, se ha estudiado el posible efecto de las translocaciones Rb sobre el grado de muerte celular programada (apoptosis) durante los distintos estadios de la espermatogénesis. Finalmente, se ha investigado la relación entre las fusiones Rb y el tamaño y forma de la cabeza del espermatozoide, aplicando análisis de morfometría geométrica a imágenes obtenidas mediante microscopia electrónica de barrido, así como la existencia de modularidad variacional en dicha estructura. Si bien se detectaron fluctuaciones locales en el grado de fijación de los metacéntricos, la estructura clinal de la zona permaneció relativamente estable a lo largo del periodo considerado. Este resultado indica la presencia de cierto grado de aislamiento genético entre poblaciones diferenciadas cariotípicamente y, por tanto, corrobora la existencia de barreras reproductivas entre ellas. Los animales con números diploides reducidos mostraron un elevado grado de muerte en células germinales, irregularidades en los procesos de recombinación genética y alteraciones morfológicas en espermátidas redondas y en espermatozoides maduros. No obstante, la gran variabilidad detectada entre individuos sugiere que la magnitud de los efectos ocasionados por las fusiones puede variar en función de las características estructurales de los cromosomas implicados en las fusiones y el grado de heterocigosis génica. El análisis morfométrico de la cabeza del espermatozoide reveló diferencias substanciales entre grupos cromosómicos. Concretamente, se apreciaron divergencias en la morfología de las crestas ventrales entre espermatozoides de ejemplares St y Rb, y en la amplitud de la región post-acrosómica entre gametos de animales Rb. Dichas modificaciones podrían estar relacionadas con alteraciones en el proceso de citodiferenciación gamética debidas a las fusiones Rb. Los análisis de modularidad indican que la cabeza del espermatozoide está dividida en tres módulos variacionales que coinciden con la compartimentación citoesquelética de la teca perinuclear. Si bien no se han detectado diferencias en el patrón de modularidad entre grupos cromosómicos, la disminución en los porcentajes de covariación entre pares de módulos en ejemplares Rb indica que las reordenaciones cromosómicas pueden inducir cambios en el mapa fenotípico-genotípico. / A Robertsonian (Rb) polymorphism zone of the western European house mouse (Mus musculus domesticus) is found in the vicinity of the city of Barcelona. This Rb system covers about 5.000 km2 and is surrounded by populations whose individuals show a standard (St) karyotype of 40 telocentric chromosomes. In that area, up to seven different metacentrics and Rb specimens with diploid numbers ranging from 27 to 40 chromosomes have been detected. The ‘Barcelona’ Robertsonian system (BRbS) constitutes a unique model among the whole Rb systems described to date, since it lacks an exclusive chromosomal race and the set of metacentrics are geographically distributed following a staggered clinal pattern. Although information on the structure of the system was available at the beginning of the present research, little was known about the dispersal dynamics of the fusions throughout time. Thus, in order to evaluate possible changes in the fixation rates of the Rb fusions and in the degree of genetic isolation among populations differing in some karyotypic characteristics, a study on the spatio-temporal variation of the structure of the BRbS during the periods 1996-2000 and 2008-2010 has been carried out. Likewise, taking into account the finding of differences in the seminiferous epithelium between St and Rb specimens, the possible effect of Rb fusions on the rate of apoptotic germ cell death has been analyzed in all stages of the spermatogenesis in M. musculus domesticus. Finally, the relationship between the Rb fusions and the shape and size of the sperm head has been tested by applying geometric morphometrics to images obtained through a scanning electron microscope, a technique also applied to evaluate the existence of variational modularity in such sperm structure. Although local fluctuations in the fixation rate of metacentrics were detected, the clinal structure of the zone remained relatively stable over the period considered. This result indicates the existence of certain degree of genetic isolation between populations karyotypically differenciated, which corroborates the existence of reproductive barriers among them. Specimens with low diploid numbers showed a relevant signal of germ cell death, abnormalities in the genetic recombination and morphological alterations both in round spermatids and in mature spermatozoids. However, the great variability detected among individuals suggests that the magnitude of the effects caused by Rb fusions on the seminiferous epithelium may vary depending on the structural characteristics of the chromosomes involved in the fusions and on the degree of genic heterozygosity. Morphometric analysis on the sperm head revealed substantial differences among chromosomal groups. Divergences in the shape of the ventral spurs were detected between sperms from St and Rb specimens, while variation in the post-acrosomal width was also noticed among Rb gametes. These changes might be related to alterations in the gamete morphogenesis promoted by Rb fusions. Modularity analyses indicated that the sperm head is divided into three variational modules that fit with the cytoskeleton compartmentalization of the perinuclear theca. Although no differences in the modularity pattern were found among chromosomal groups, the decrease in the covariation rates between pairs of modules in Rb specimens suggests that Rb fusions might induce changes in the phenotype-genotype map of individuals.

L'objectiu d'aquesta tesi és la recerca de gens candidats de resistència o susceptibilitat a leishmaniosi canina. Aquesta malaltia, que és endèmica en l'area mediterranea, és una zoonosi causada pel paràsit Leishmania infantum, on el gos és el principal reservori. A més, està guanyant molta importància en l'home, ja que ha esdevingut una de les coinfeccions principals en malalts del virus de la SIDA.El món dels gossos aporta un material molt valuós per a l'estudi de malalties amb un component genètic: les diferents races presenten una elevada homogeneïtat genètica i existeix la possibilitat de tenir extenses famílies i de realitzar creuaments dirigits. El problema de les famílies en el món dels gossos és la fiabilitat de les mateixes. És per això que un dels objectius d'aquesta tesi fou posar a punt un sistema d'identificació individual i control de paternitats en extenses famílies amb un cert grau de consanguinitat. Per tal d'assolir aquest objectiu analitzàrem el polimorfisme i les freqüències al·lèliques de 10 microsatèl·lits en una família de 3 generacions formada per 360 Rottweilers amb un coeficient màxim de consanguinitat del 16% i ho compararem amb dos tipus diferents de poblacions de gossos: una formada per animals no relacionats de raça pura i una altra formada per individus no relacionats d'una barreja de races. Tot i que la població consanguínia mostrà una reducció del polimorfisme respecte la població mixta de gossos, aquests nivells foren similars als existents en les poblacions d'animals no emparentats de pura raça, concloent que els 10 microsatèl·lits analitzats són suficients per resoldre aquests tipus de proves en extenses famílies amb un cert grau de consanguinitat.La manca del mapa genètic al començar aquest estudi ens va obligar però, a analitzar els factors genètics involucrats en la diferent resistència o susceptibilitat a la leishmaniosi canina basant-nos en l'estratègia de gens candidats, que es fonamenta en aprofitar els coneixements ja existents en d'altres espècies on l'estudi genètic està més avançat. En ratolí s'ha demostrat que la primera línea de defensa natural vers la leishmaniosi visceral està sota el control del gen Nramp1, mentre que la progresió de la malatia està sota la influència dels gens del MHC. La caracterització del Nramp1 caní es portà a terme mitjançant primers ortòlegs de PCR que, donat l'alt grau de conservació d'aquesta família de gens, poden ser utilitzats com a primera aproximació d'anàlisi del polimorfisme d'aquest gen en d'altres espècies de mamífers, així com a marcador de tipus I per a dur a terme un anàlisi comparatiu del genomes. La caracterització complerta del Nramp1 del gos, posicionat al cromosoma 37, s'extén 9 kb que comprenen la regió promotora, 15 exons i un microsatèl·lit polimòrfic situat a l'intró 1. El gen codifica per una proteïna de 547 aminoàcids que presenta una identitat de fins al 87% amb les proteínes Nramp1 descrites en les diferents espècies de mamífers, conservant els motius estructurals. El residu G169 està conservat en el Nramp1 del gos. El microsatèl·lit situat a l'intró 1 s'utilitzà com a marcador per portar a terme un estudi de casos controls en 33 gossos resistents i 84 gossos susceptibles. La manca de distribució aleatòria d'un dels al·lels del microsatèl·lit suggereix una associació entre el gen Nramp1 i la susceptibilitat a la leishmaniosi canina. La identificació de mutacions amb una possible implicació funcional es dugué a terme mitjançant seqüenciació directe del cDNA i la regió promotora de quatre Beagles infectats experimentalment amb L. infantum. Dos dels gossos foren classificats com a resistents (R1 i R2) i dos com a susceptibles (S1 i S2) en funció de la seva resposta immunitària, que fou predominantment cel·lular o humoral respectivament. Les variants de seqüència a destacar foren: una zona rica en Gs a la regió promotora possiblement involucrada en la diferent expressió del gen, i una deleció complerta de l'exó 11, que conté el motiu consens de transport de la proteïna, en l'únic animal susceptible que ha necessitat un tercer tractament per evitar les continues recaigudes que patia.Pel que fa al segon gen candidat, i donat l'estat encara incipient en que es trobava la caracterització dels gens de classe II dels MHC en el gos, ens centràrem en l'anàlisi del polimorfisme present en els gens DRB1 i DQB1 on identificarem, mitjançant un sistema de PCR-RFLP, 3 i 6 nous al·lels per a cadascun d'ells respectivament. La gran heterogeneitat en la caracterització dels diferents al·lels d'aquests gens i d'altres gens del MHC caní, que anaven augmentant amb celeritat, mostrà la necessitat de crear un comité de nomenclatura que els estandaritzés, permetent d'ara endavant, la realització d'estudis d'associació amb una assignació inequívoca dels al·lels presents. / The aim of this research is to contribute in the characterisation of candidate genes related with resistance or susceptibility to canine leishmaniosis. Leishmaniosis, which is endemic in the Mediterranean basin, is a zoonosis caused by the parasite Leishmania infantum in which the dog is considered to be the main host. This disease is also important in humans where it has became a common complicating factor in adults infected with HIV.Dog world presents a unique opportunity to study diseases with a genetic component since there is high genetic homogeneity within each breed and the possibility of having large families and performing directed crosses. The problem with dog families is their credibility. For this reason our first objective was addressed to implement a system for parentage testing and individual identification in large populations of closely related dogs. We have analysed the polymorphism of a set of 10 microsatellites over three generations of 360 pedigree Rottweilers that reached a maximum inbreeding coefficient of 16%. Results were compared with pure-breed populations of unrelated animals and with one population constituted by unrelated dogs of mixed breeds. Although microsatellite polymorphism was reduced in the Rottweiler pedigree if compared to the mixed breed population, it was similar to the populations composed of unrelated pure-breed dogs, concluding that 10 microsatellites could be considered sufficient to solve this type of analysis in large populations of closely related dogs.Due to the lack of the canine genetic map at the beginning of this project, our aim was to search for genes responsible of the resistance or susceptibility to canine leishmaniosis based on the candidate gene strategy. Nramp1 gene has been described in mouse as the determinant of natural resistance or susceptibility to Leishmania infection, while MHC genes have been described to be responsible for the disease progression. Nramp1 characterisation was performed using orthologous gene-specific PCR primers that allow the specific amplification of this gene in mammals due to the high degree of conservation shown in this gene family. This could be used as a first approach in the search of genes responsible for disease susceptibility, but also to map this gene as a type I marker for direct comparison between genetic maps of divergent species. The canine Nramp1 gene has been mapped to dog chromosome CFA37 and covers 9 kb, including 700 bp of the promoter and 5' UTR regions, 15 exons and a polymorphic microsatellite in intron 1. It encodes a 547 amino acid protein that has over 87% identity with the Nramp1 proteins of different mammalian species and with the same structure as the other Nramp1 proteins described up to date. The G169 residue in TM4 is conserved in the dog Nramp1 protein as it is in other species. We performed a case-control study with 33 resistant and 84 susceptible dogs and the intron 1 microsatellite as a marker. Significant differences were observed for one allele of the microsatellite between the two populations suggesting an association between Nramp1 gene and susceptibility to canine leishmaniosis. Sequence variant analysis was performed by direct sequencing of the cDNA and the promoter region of four Beagles experimentally infected with L. infantum to search for possible functional mutations. Two of the dogs were classified as susceptible (S1 and S2) and the other two were classified as resistant (R1 and R2) based on their predominant immune response, which was humoral and cellular respectively. It is important to remark a G-rich region in the promoter of the susceptible animals possibly involved in gene expression and a complete deletion of exon 11, which resulted in the elimination of the consensus transport motif of the protein, in the only dog that needed a third, sustained treatment to avoid continuous relapses.For the other candidate gene, we performed polymorphism analysis of the MHC class II genes, DRB1 and DQB1. Based on a PCR-RFLP protocol, we identified 3 and 6 new alleles for each gene respectively. The high heterogeneity of the MHC genes characterisation showed the necessity of creating a Nomenclature committee for canine MHC. Since now, it will allow to achieve association studies with a correct assignation of the alleles present in a population.