La necrosi irreversible del múscul cardíac es coneix com infart de miocardi (MI) i es dóna quan la isquèmia supera el llindar crític y depassa els mecanismes cel·lulars de reparació. Després d’un MI, el teixit cardíac no té la capacitat suficient d’autoregeneració i com a conseqüència, la isquèmia pot causar la mort, moderada o severa, del teixit. L’enginyeria de teixits és un camp emergent interdisciplinari enfocat a l’obtenció de cultius tridimensionals (3D) emprats per a dos propòsits diferents: aportar eines biomèdiques amb potencial aplicació en la substitució, reparació i regeneració del teixit; o permetre l’estudi in vitro de la fisiologia i la fisiopatologia de manera més precisa. En aquesta tesi s’ha desenvolupat i analitzat un model 3D in vitro basat en el pèptid autoensamblant RAD16-I, i un implant bioactiu per a la reparació del teixit cardíac dins del marc del projecte europeu RECATABI. Els models 3D poden ajudar-nos a estudiar els paràmetres biofísics, biomecànics i bioquímics que regulen la diferenciació cel•lular. En la present tesis, s’ha desenvolupat un model 3D per analitzar el comportament de cèl·lules progenitores derivades de teixit adipós subcutani (subATDPCs) en termes de viabilitat, creixement i expressió gènica, sota la influència de diferents estímuls. Per una altra banda, s’ha desenvolupat un mètode simple i innovador per a l’estudi de l’efecte de l’estímul elèctric en cèl•lules cultivades en el model 3D proposat. L’objectiu final d’aquest model in vitro és entendre millor el comportament que poden tenir aquestes cèl•lules in vivo després de ser implantades. D’aquesta manera s’espera poder millorar la seva actuació en la regeneració o reparació del teixit infartat. S’ha proposat amb anterioritat que l’empelt de cèl·lules progenitores en l’àrea afectada pot contribuir en la generació d’un nou teixit de miocardi. La nostra hipòtesi es basa en que aquest mecanisme es pot millorar amb l’aplicació d’un implant bioactiu que pugui mantenir les cèl·lules en la localització d’implantació, suportar el comportament mecànic del cor i a la vegada proporcionar un micoambient adequat per a les cèl·lules implantades. Amb aquest objectius, es va preparar un material combinant consistent en la inclusió del RAD16-I dins dels microporus de membranes elastomèriques. L’objectiu d’aquest estudi és avaluar la capacitat de sembra d’aquesta plataforma i la supervivència, creixement i expressió gènica de les subATDPCs en el material combinat. Es descriu el desenvolupament i caracterització de bioimplants basats en dues membranes elastomèriques: polietilacrilat (PEA) i policaprolactona 2-metacrilociloxi etil ester (PCLMA). Ambdues són bons materials de suport i també són suficientment elàstiques per a suportar els esforços resultants del batec del cor. A més, ambdós materials compostos faciliten la propagació dels impulsos elèctrics i permeten el manteniment d’expressió gènica de les subATDPCs. Es proposa doncs que els implants bioactius (membranes elastomèriques amb pèptid autoensamblant i subATDPCs) poden millorar l’eficàcia de futures teràpies cel·lulars augmentant la immobilització i supervivència de les cèl·lules en l’àrea afectada. / La necrosis irreversible del músculo cardíaco se conoce como infarto de miocardio (MI) y se da cuando la isquemia supera el umbral crítico y rebasa los mecanismos celulares de reparación. Después de un MI, el tejido cardíaco no tiene la capacidad suficiente de autoregeneración y como consecuencia, la isquemia puede causar la muerte, moderada o severa, del tejido. La ingeniería de tejidos es un campo emergente interdisciplinar enfocado a obtener cultivos tridimensionales (3D) con dos propósitos distintos: aportar herramientas biomédicas con potencial aplicación en la substitución, reparación y regeneración del tejido; o permitir el estudio in vitro de la fisiología y la patofisiología de manera más precisa. En la presente tesis se ha desarrollado y analizado un modelo in vitro 3D basado en el péptido autoensamblable RAD16-I y un implante bioactivo para la reparación del tejido cardíaco dentro del marco del proyecto europeo RECATABI. Los modelos 3D pueden ayudarnos a estudiar los parámetros biofísicos, biomecánicos y bioquímicos que regulan la diferenciación celular. En esta tesis, hemos desarrollado un modelo 3D para analizar el comportamiento de células progenitoras derivadas de tejidos adiposo subcutáneo (subATDPCs) en términos de viabilidad, crecimiento y expresión génica, bajo la influencia de diferentes estímulos. Por otro lado, se ha desarrollado un método simple y novedoso para el estudio del efecto de un estímulo eléctrico en células encapsuladas en el modelo 3D. El objetivo final de este modelo in vitro es entender mejor el comportamiento que estas pueden tener células in vivo después de su implantación. De esta manera se espera poder mejorar su actuación en términos de regeneración o reparación del tejido infartado. Se ha propuesto con anterioridad que el injerto de células progenitoras en el área infartada puede contribuir en la generación de un nuevo tejido de miocardio. Nuestra hipótesis se basa en que este mecanismo puede ser mejorado con la aplicación de un implante bioactivo que pueda mantener las células en la localización de implantación, soportar el comportamiento mecánico del corazón y a la vez proporcionar un microambiente adecuado a las células implantadas. Con estos objetivos se preparó un material combinado consistente en la inclusión del RAD16-I dentro de los microporos de membranas elastoméricas. El objetivo de este estudio es evaluar la capacidad de siembra de esta plataforma y la supervivencia, crecimiento y expresión génica de las subATDPCs. Se describe el desarrollo y caracterización de bioimplantes basados en dos membranas elastoméricas: poli etil acrilato (PEA) y policaprolactona 2-metacriloxiloxi etil ester (PCLMA). Ambas son buenos materiales de soporte para la implantación de células y también son suficientemente elásticas para soportar los esfuerzos resultantes del latido del corazón. Se ha observado que los dos materiales compuestos facilitan la propagación de los impulsos eléctricos y permiten el mantenimiento de la expresión génica de las subATDPCs. Se propone que los implantes bioactivos (membranas elastomérica con péptido autoensamblable y subATDPCs) pueden mejorar la eficacia de futuras terapias celulares, aumentando la inmovilización y supervivencia de las células en el área afectada. / The irreversible necrosis of heart muscle (myocardial infarction, MI) occurs when ischemia exceeds a critical threshold and overwhelms myocardial cellular repair mechanisms. After MI, myocardial tissue lacks the ability to significantly regenerate itself and as a consequence, ischemia might cause moderate or severe tissue death. Tissue Engineering is an emerging interdisciplinary field focused on the obtaining of three-dimensional (3D) constructs with two different purposes: provide a set of biomedical tools with potential applicability in tissue replacement, repair and regeneration; or enable the in vitro study of cardiac human physiology and physiopathology more accurately. In this work, we have developed and analyzed a 3D in vitro model based on RAD16-I self-assembling peptide and a bioactive implant for cardiac tissue repair in the framework of RECATABI European Project. 3D models can help us to study the biophysical, biomechanical and biochemical parameters that regulate cell differentiation. In this thesis, we have developed a 3D in vitro model to analyze the behavior of subcutaneous adipose derived progenitor cells (subATDPCs) in terms of viability, growth, and gene expression, under different stimuli. Moreover, a novel and simple method to study the effect of electrical stimulus on cells growing in the 3D model has been achieved. The goal of these in vitro models is to better understand the behavior that these cells could have after their in vivo implantation with the hope to improve their performance in terms of regeneration or repair of the infarcted tissue. Stem cells have been previously proposed to be grafted into the infarcted area to contribute to the generation of new myocardial tissue. We hypothesize that this mechanism could be enhanced by the application of a bioactive implant that could maintain the cells in the implanted site, afford the mechanical heart behavior and, at the same time, provide to the implanted cells a proper microenvironment. Therefore, we have prepared a composite obtained from the combination of RAD16-I included within microporous of elastomeric membranes. The goal of the present study is to evaluate cell survival and growth, seeding capacity and gene expression of subATDPCs in the new synthetic composite scaffold platform. We have described the development and characterization of bioimplants based on two different elastomeric membranes: poly(ethyl acrylate) (PEA), and poly(caprolactone 2-(methacryloyloxy)ethyl ester, (PCLMA). Both biomaterials are a good support for cell delivery and elastic enough to withstand the stresses arising from the heartbeat. Additionally, the developed composites equally facilitated the propagation of electrical pulses and maintained subATDPCs gene expression. We have proposed that the bioactive implants (elastomeric membranes with self-assembling peptide, and subcutaneous adipose tissue derived progenitor cells) could increase the efficacy of future cardiac cell therapy by improving cell immobilization and survival at the affected site.

The design of smart biomaterial devices plays a key role to improve the way conventional therapies are being delivered, and to promote the development of new approaches for advanced therapies, such as regenerative medicine and targeted drug release. Injectable biodegradable materials, such as those consisting of suspensions of polymeric particles, are highly versatile devices that can be delivered through minimally-invasive injections. The physic-chemical properties of the particles can be engineered to obtain smart scaffolds for tissue engineering, carriers for drug release and cell therapy. The aim of this Thesis is to develop a novel class of biodegradable and injectable particulate carriers based on polylactic acid (PLA), that are capable to trigger and guide specific responses from the cells and the biological milieu. First, a novel route to fabricate PLA-based microcarriers (MCs) was set and characterized. The production method involved green, non-harmful chemicals and it is easy to scale-up. Such technique allowed tuning MC size and size distribution in the range suitable for drug and cell delivery applications. The favorable regulatory status of the materials and reagents may also be beneficial for the translation of the MCs from bench to bedside. The principles guiding the fabrication procedure can inspire techniques to generate nanocarriers for controlled drug delivery. Recent studies point out the importance of drug-loaded and submicron-sized materials in the treatment of severe clinical conditions, such as persistent biofilm infections. These nanoparticles (NPs) can be endowed with smart functionalities to enhance drug delivery within the biofilm matrix. In this way, NPs encapsulating the antibiotic ciprofloxacin were produced and functionalized with DNase I. The NPs improved the antimicrobial activity of the encapsulated drug and promoted biofilm eradication, targeting and degrading directly the biofilm matrix. On the other hand, larger particles such as MC, display a high surface area for cell expansion. MCs can also deliver cells with therapeutic potential as ¿living drugs¿, ideally in a spatio-temporal controlled fashion. This is especially important, as, in standard cell therapies, direct injection of cells is accompanied by massive cell mortality that renders the treatment ineffective. PLA MCs suitable for Mesenchymal Stromal Cells (MSCs) homing have been produced and modified with different functionalization approaches. The physic-chemical properties of the MCs and bioactive coatings modulated cell adhesion, proliferation, and migratory potential in response to chemokines that regulate MSC tissue localization, like SDF-1a. The results highlight the importance of carriers design to control cell delivery, and provide important guidelines to instruct a new generation of efficient biomaterial carriers. Another exciting application of injectable, cell-laden MCs is to use them as building blocks to fabricate living tissues in vitro. Combining MC technology and bioprinting is an appealing strategy to generate tissues grafts with controlled architectures. The suspension of injectable PLA cell-laden MCs within gelatin-based hydrogels formed an extrudable, composite bioink. MCs acted as mechanical reinforcement for soft gels and as means for cell expansion to encapsulate high cell payload. MSCs were shown to form MC-MSCs aggregates, with enhanced cell-to-cell contact on surface functionalized PLA MCs, and differentiated towards the osteogenic lineage. This result suggests potential applications of MC-MSCs laden bioinks for bone tissue engineering, and the composite bioink is proposed as component to build multimaterial, 3D-printed osteochondral graft models. Taken together, the injectable devices developed in the Thesis constitute promising and highly versatile biomaterial platforms for biomedical applications, and can be employed in a wide array of tissue engineering, and cell and drug delivery strategies. / El diseño de dispositivos basados en biomateriales inteligentes, juega un papel fundamental a la hora de mejorar las terapias convencionales, así como en el desarrollo de nuevas estrategias para la medicina regenerativa y la liberación controlada de fármacos. Materiales inyectables biodegradables, tales como las suspensiones de partículas poliméricas, constituyen dispositivos versátiles, que se pueden suministrar por medio de inyecciones mínimamente invasivas. Las propiedades físico-químicas de las partículas pueden ser modificadas para obtener andamios inteligentes para la ingeniería de tejidos, transportadores para liberación de fármacos y cultivo y terapia celular. El objetivo de esta Tesis es el desarrollo de una nueva clase de partículas transportadoras inyectables y biodegradables, basadas en ácido poliláctico (PLA), que sean capaces de desencadenar y guiar respuestas específicas por parte de las células y del entorno biológico. Primero, se ha creado y caracterizado una nueva ruta para fabricar microstransportadores (MCs) basados en PLA. Este método de producción utiliza reactivos verdes y no-tóxicos, y es sencillo de adaptar para la fabricación a gran escala. Esta técnica permite controlar parámetros fundamentales en las MCs, tales como su tamaño y dispersión, que pueden ser controlados dentro de los rangos adecuados para aplicaciones de liberación de fármacos y células. El hecho que los materiales y reactivos utilizados están bien aceptados por las agencias reguladoras, puede favorecer el traslado de las partículas fabricadas desde la investigación hasta la práctica clínica. Los principios de este método pueden adaptarse a otras técnicas de fabricación para generar nanotransportadores (nanopartículas, NPs) de fármacos. Estudio recientes subrayan la importancia de biomateriales submicrométricos cargados con compuestos bioactivos en el tratamiento de enfermedades, tal como las infecciones provocadas por biofilms. Estas NPs pueden ser modificadas con funcionalidades inteligentes, para mejorar la distribución del fármaco en la matriz del biofilm. De esta manera, se han producido NPs que encapsulan el antibiótico ciprofloxacino, modificadas superficialmente con DNasa I. Estos transportadores tienen como diana la matriz que compone el biofilm y pueden degradarla, incrementando la actividad antibacteriana del ciprofloxacino y promoviendo la erradicación de los biofilms. Por otra banda, las partículas más grandes, como las MCs, poseen una superficie adecuada para la expansión celular. Las MCs se pueden usar para transportar “drogas vivas”, es decir células con potencial terapéutico, posiblemente controlando su distribución espacial y su cinética de liberación. Esto es de particular importancia, porque la ineficiencia de muchas terapias celulares actuales se debe a la gran cantidad de células que no sobreviven una vez inyectadas in vivo. Se han producido MCs de PLA modificadas por diferentes estrategias de funcionalización y aptas para suportar en su superficie células madres mesenquimales (MSCs). La biofuncionalización y las propiedades físico-químicas de las MCs juegan un papel fundamental en la adhesión y proliferación célular, así como la capacidad de las MSCs de migrar en respuesta a estímulos quimiotácticos, que regulan su localización en los tejidos, tal como el SDF-1α. Los resultados subrayan la importancia del diseño de las MCs para controlar la liberación de las células, y a la vez aportan información para desarrollar una nueva y más eficiente generación de transportadores de células. Otra aplicación prometedora de las MCs inyectables es su uso como bloques de construcción para fabricar tejidos vivos in vitro. La combinación de la tecnología de las MCs con la bioimpresión 3D constituye una estrategia atractiva para obtener injertos de tejidos multimateriales con arquitectura controlada. Se han obtenido biotintas compuestas y capaces de ser extruidas mezclando materiales basados en hidrogeles de gelatina con las MCs de PLA cargadas con células. Las MCs actúan de refuerzo mecánico para el hidrogel y como vehículo para la expansión celular (por ejemplo, en un bioreactor “spinner flask”) para encapsular elevadas cantidades de células. Las MSCs forman agregados células-particulas, una vez sembradas en las superficies de las MCs, y estos complejos, ricos en contactos célula-célula, se demostraron capaces de suportar la diferenciación osteogénica de las MSCs. Este resultado sugiere potenciales aplicaciones de las biotintas cargadas de agregados de MCs y MSCs para la ingeniería del tejido óseo. Esta biotinta ha sido también utilizada como componiente para generar un modelo de injerto osteocondral, por medio de una técnica de impresión 3D. El conjunto de dispositivos inyectables desarrollados en esta Tesis constituyen una plataforma muy versátil y prometedora para aplicaciones biomédicas, en particular en estrategias de ingeniería de tejidos, y liberación de células y fármacos

This thesis is about challenges that currently concern in vitro production (IVP), sex determination procedures and sex-related survival of in vitro-produced porcine embryos. Specifically, the current thesis develops a new suitable PCR-based procedure based on the amplification of repetitive sequences for determining the sex of porcine embryos at different developmental stages. Furthermore, this work establishes new culture conditions and provides new knowledge about physiology, development and sexual dimorphisms in survival rates and kinetics of the development of in vitro-produced porcine embryos under specific in vitro culture conditions. The presence of optimal concentrations of hyaluronic acid and specific energy substrates at the appropriate time of embryo development, as well as the timing of several events during the earliest stages of development, essentially the timing of the first embryonic cleavage, appear to be linked amongst them and are related to subsequent embryonic competence, influencing development in a sex related manner / Aquesta tesi tracta alguns dels reptes que actualment afecten la producció in vitro (PIV), la determinació del sexe i la supervivència relacionada amb el sexe dels embrions de porcí. Concretament, presenta una nova tècnica de PCR basada en l’amplificació de seqüències repetitives apte per a determinar el sexe d’embrions porcins a diferents estadis de desenvolupament. També estableix noves condicions de cultiu i ofereix nous coneixements sobre la fisiologia, el desenvolupament i els dimorfismes sexuals en les taxes de supervivència i en la cinètica del desenvolupament d’embrions de porcí PIV sota unes determinades condicions de cultiu. Concentracions òptimes d’àcid hialurònic, i de glucosa, piruvat i lactat com a substrats energètics, en el moment adequat del desenvolupament embrionari, així com també el moment en el qual té lloc la primera divisió embrionària, estan relacionats entre sí i condicionen el posterior desenvolupament embrionari, tendint a desviar la proporció de sexes

According to a study of the European Commission, approximately one million hips are replaced by prostheses worldwide every year. The interaction of the human body with foreign materials that are subjected to alternating mechanical load in a highly corrosive environment still provides challenges. The main factors affecting prosthesis failure are stress shielding effect and poor osseointegration. In this thesis the problem of prosthesis failure has been approached from the material and from the osseointegration point of view trying to give a global solution to the problem. Niobium and hafnium, which are demonstrated to be totally biocompatible, were used to design a Ti-based alloy. The effect of the alloying elements regarding microstructure and elastic modulus was studied and the best composition was deeply characterized in terms of microstructure, elastic modulus, corrosion resistance and superficial energy. Recombinant fragments of fibronectin were synthesised spanning the cell attachment site and the heparin binding domain which are important for cell viability. These motifs were used to functionalise the surface of the TiNbHf alloy. Two tethering methods were studied: physisorption and silanisation. Silanisation was not used before to immobilise fibronectin recombinant fragments onto metallic substrates and in this thesis, its good performance was demonstrated. In vitro studies were made with each fragment and with different combinations of the fragments, which showed the importance of the heparin binding domain to obtain a cell response equivalent to that of fibronectin in terms of cell adhesion, proliferation and differentiation. / De acuerdo con un estudio de la Comisión Europea, aproximadamente un millón de caderas son remplazadas por prótesis en el mundo anualmente. La interacción del cuerpo humano con materiales externos sujetos a una carga mecánica alternante en un medio altamente corrosivo todavía presenta ciertos desafíos. Los factores que contribuyen principalmente al fallo de una prótesis son el apantallamiento de cargas y la pobre osteointegracion. En la presente tesis el problema de la fallida de prótesis ha sido abordado desde el punto de vista del material y de la osteointegracion en un intento de dar una solución global al problema. El niobio y el hafnio, cuya total biocompatibilidad ha sido demostrada, se han utilizado para diseñar una aleación de titanio. El efecto de dichos aleantes respecto a la microestructura y el módulo elástico ha sido estudiado y la mejor composición ha sido profundamente caracterizada en términos de microestructura, módulo elástico, resistencia a la corrosión y energía superficial. Fragmentos recombinados de fibronectina han sido sintetizados abarcando la zona de adhesión celular y la unión de heparina, las cuales son esenciales para la viabilidad celular. Dichos motivos han sido utilizados para funcionalizar la superficie de la aleación TiNbHf. Dos métodos de unión diferentes han sido estudiados: fisisorción y silanización. La silanización es un método que no se ha utilizado hasta el momento para inmovilizar fragmentos de fibronectina sobre superficies metálicas y en la presente tesis su idoneidad ha sido demostrada. Finalmente, estudios celulares in vitro se han llevado a cabo con cada fragmento y con diferentes combinaciones de ambos, lo cual ha mostrado la importancia de la zona de unión de heparina para obtener una respuesta celular equivalente a la obtenida con la molécula de fibronectina en cuanto a adhesión celular, proliferación y diferenciación.

El control del ciclo celular está altamente regulado mediante diferentes CDKs asociadas a ciclinas. En Saccharomyces cerevisiae, la CDK esencial Cdc28 es la que regula mayoritariamente este proceso. En la fase G1 del ciclo celular, otra CDK, Pho85, también colabora en este proceso asociada a las ciclinas Pcl1 y Pcl2. Pho85 se considera un enzima accesorio con funciones redundantes básicamente porqué: 1) su delección no da un fenotipo de letalidad (como si lo hace Cdc28) y 2) porqué los substratos descritos para Cdc28 lo son a su vez para Pho85. En esta tesis, hemos demostrado que, aunque es cierto que ambas CDKs regulan a los mismos substratos, lo hacen en condiciones ambientales distintas y que esto es facilitado por un mecanismo de destrucción de proteínas diverso. Hasta el inicio de este trabajo, se conocía el complejo SCF como el único capaz de degradar las ciclinas de G1 pero hemos observado que Dma1, otra E3 ligasa, es la que regula específicamente a Pcl1. Esta ciclina es ubiquitinada in vitro e in vivo por Dma1 y esto es necesario para la correcta degradación de Pcl1 in vivo. Como el SCF, Dma1 también se basa en una pequeña secuencia presente en sus sustratos a la que hemos llamado DDD, sin la cual, Pcl1 no era ubiquitinado correctamente in vitro y no era correctamente degradada in vivo. La fosforilación de Pcl1 mediante Pho85 en la Thr39 y la Ser43 es necesaria para su destrucción in vivo. Además, hemos podido demostrar que este mecanismo regulado mediante fosforilación y ubiquitinación, tiene un sentido fisiológico dado que en condiciones pobres en nutrientes, Pcl1 es la ciclina principal de la fase G1 del ciclo, siendo así acordes unos niveles mas bajos de la E3 ligasa Dma1. Por lo tanto, los complejos Pho85-Pcl1 ayudan a rearrancar el ciclo cuando no hay suficientes nutrientes en el medio y Cdc28 está downregulada y Dma1 es un mecanismo de degradación dependiente y controlado por la presencia de nutrientes en el medio. Así también, Pho85-Pho80 enlazan la regulación del metabolismo con la fase G1 del ciclo al fosforilar a Cln3 en presencia de fosfato, estabilizando a la ciclina mediante fosforilación. Hemos observado que esta fosforilación se da en lugares diversos a la que realiza su CDK Cdc28, seguramente dado que Pho85 la regula como sustrato y no como ciclina. Esto, nos llevó a sospechar que la degradación de Cln3 pudiese darse por un mecanismo diferente a la que sufre cuando es controlada por su propia CDK. Sabiendo que Pho85 está regulando también de diferentes maneras la autofagia, quisimos comprobar que no fuera este mecanismo el mecanismo de degradación de Cln3. Tras observar que no era así, también buscamos la posible E3 ligasa que estuviese ubiquitinando a esta proteína y, aunque no conseguimos encontrar, cabe destacar que observamos que Ubc4 se encuentra relacionada con el proceso de destrución de Cln3.

Understanding the evolutionary basis for human-specific phenotypes such as complex speech and language, advanced cognition or the unique preparation of their food is a topic of broad interest. Approaches focusing on comparisons of the genomic DNA (deoxyribonucleic acid) or RNA (ribonucleic acid) sequence between species, individuals or tissues allow for the identification of evolutionary sequence changes, some of these changes may underlie differences in phenotypes. In addition, differences in when, where and how much of a particular gene is present may also contribute to functional changes and therefore also to phenotypic differences. The resources to make such comparisons using genetic data are now available. The genome sequences of a number of outgroups: all living great apes, as well two archaic humans, are now publically available. Studying gene expression on the RNA level - a precursor of the protein expression - is considerably easier and cheaper than the measurement of expression of the protein itself. It has been shown that the RNA and protein expression levels are well correlated and therefore measuring RNA levels provides a good proxy for the expression of the protein. Using high-throughput sequencing techniques, relatively unbiased expression comparison is now possible because the RNA from any species can be sequenced directly, rather than being captured on arrays which are designed based on a particular reference sequence. The aim of this research was to use gene expression as a molecular phenotype to identify changes relevant to human-specific biology and study the difference between humans and their closest living relatives to understand patterns and differences in the gene expression and in gene expression regulation in multiple tissues in primates using high-throughput sequencing techniques. In my thesis, I describe two analyses to address open questions in the field of gene expression and genes expression regulation in humans. In the first part I will analyze how the effect of different diets impact gene expression using a mouse model. Two key components of the human diet that differ substantially from the diet of other primates, the frequent use of meat of many humans and the cooking of their food which is common for almost all human populations, are modeled in the experiment. I tested for their impact on liver gene expression. I found that both the differences in food substrates - meat and tuber - as well as in their preparation affect gene expression in mice significantly. The effect is bigger between food substrates than between methods of preparation. Differentially expressed genes between food substrates and food preparation were predominantly related to metabolic functions. In addition, immune-genes showed differential expression between the comparisons of raw meat to both, raw tuber and cooked meat, respectively. The results indicate that different food substrates and food preparations activate different metabolic pathways and that the cooking of food and particularly of meat has an influence on the immune also changes immune-reactions of the body. I showed that expression differences in these mice are correlated with the differences observed between humans and other primates, and that there is evidence that adaptation to these diets dates to more than 300.000 years. Finally, I showed that transcription factors play in important role in regulation of gene expression with respect to different food preparation. In the second part I analyzed the expression of one key regulator of gene expression: microRNAs (miRNAs). Using miRNA expression data from multiple primate species and for multiple tissues I found that expression differences vary between tissues. While heart and brain show only few expression differences between primates, other tissues are more variable in expression. The most extreme expression differences in all three primate species were found in the brain, which may reflect the importance of miRNAs in the regulation of gene expression in the brain. Expression differences in testis were significantly larger between humans and macaques than between chimpanzees and macaques, indicating that miRNAs evolved differently in human compared to chimpanzees. MiRNA expression differences were correlated with expression differences of their target genes genome-wide which underlines the regulatory importance of miRNAs. I also showed that differentially expressed miRNAs between species/tissues preferentially targeted transcription factors, which are important gene expression regulators as well. This finding that suggests complex regulatory pathways involving both miRNAs and transcription factors in the control of gene expression. Finally, I used the miRNA sequencing data to annotate new miRNAs in primates and was able to increase the number of annotated miRNAs substantially, especially for the non-human primates which were previously not extensively annotated. The overlap of miRNAs annotated in multiple primate species thereby also increased which will support future studies to investigate the evolutionary changes of miRNAs between these primates.

The aim of this doctoral thesis was to unravel mechanisms underlying primary resistance to trastuzumab regarding a putative new breast cancer subtype with mixed basal & ErbB2+ molecular features. Using the JIMT-1 breast cancer cell line as a model, we have been able to identify several candidate mechanisms responsible for trastuzumab resistance in basal/ErbB2+ breast cancer cells: 1) overexpression of survivin, an inhibitor of apoptosis protein family member; 2) Overactivation and sub-cellular re-localization of IGF-1R, a growth factor receptor involved in cellular proliferation and metastasis; and 3) Over-representation of breast cancer cells bearing the CD44+CD24-/low mesenchymal phenotype, which are enriched with putative breast cancer stem cells (CSCs) due to the activation of epithelia-to-mesenchymal transition (EMT) phenomena / El motiu d’aquesta tesi doctoral és l’estudi dels possibles mecanismes de resistència intrínseca al trastuzumab en el marc d’un nou subtipus intrínsec de càncer de mama basal/ErbB2+. Gràcies a l’ús de la línia cel·lular de càncer de mama JIMT-1 com a model d’estudi, hem identificat els possibles mecanismes pels quals el càncer de mama basal/ErbB2+ no respon al tractament amb trastuzumab: 1) augment dels nivells de survivina (una proteïna inhibidora de l’apoptosi), 2) augment dels nivells, activació, i canvi de localització del receptor IGF-1R (receptor implicat en la proliferació cel·lular i formació de metàstasi), i 3) augment de la subpoblació de cèl·lules mesenquimals amb fenotip de cèl·lules mare tumorals CD44+CD24-/low (CMTs) generades mitjançant la transició epiteli-mesènquima (TEM)

The initial molecular events that take place at biomaterials interface mimic to a certain extent the natural interaction of cells with the extracellular matrix (ECM). In this thesis we describe the fate of adsorbed type IV collagen (Col IV) - the main structural component of the basement membrane (BM) - as an important target in vascular tissue engineering. We studied the adsorption kinetic of Col IV on different model surfaces varying in wettability, chemistry and charge, and followed how it alters the molecular organization of the adsorbed protein layer. We strived to learn how it will affect the subsequent cellular interaction. AFM studies revealed specific substratum– dependent adsorption pattern of Col IV ranging from single molecular deposition to fine meshwork formation at high coating concentrations, which is characteristic for hydrophilic and NH2 functionalized substrates. Conversely, the formation of a complex networks consisting of molecular aggregates were found on hydrophobic and COOH modified surfaces. Complex structures were found also when a family of model substrates with tailored density of OH, CH3 and NH2 functions were used. Human umbilical endothelial cells (HUVEC) and fibroblasts were employed to study the biological response on these substrata. We found that fibroblast not only interact with adsorbed Col IV but also tend to reorganize it in fibril like pattern, which is strongly dependent on the materials surface properties. Following the trend of adsorption NH2>CH3>COOH>OH the reorganization pattern of Col IV improve with lowering the amount of protein. However, the cells interact better with hydrophilic and NH2 surfaces, thus acting independently on the amount of adsorbed Col IV. This trend was confirmed by the quantitative measurements of cell adhesion and spreading, as well as, the expression of p-FAK, α1 and α2 integrins – all reflecting the proper functioning of cell adhesion machinery. This is the first study that addresses the relationship between microscopic observation for remodeling of surface associated Col IV and it´s dynamic behavior in nano scale. We found that cells remodel Col IV in two ways: by mechanical reorganization and via proteolytic degradation. We identify the role of FN in the reorganization process and the involvement of MMP2 and MMP9 in the pericellular degradation activity of both HUVEC and fibroblasts. The later was further quantified via FITC labeled Col IV release and zymography. We found that in hydrophobic environment the degradation activity can override the Col IV organization process, which corroborates with the altered cell morphology, abrogated cell adhesion machinery and altered capability of HUVEC to form capillary-like structures. Taken together these results support our view that the ability of cells to remodel surface associated proteins affects strongly the biological performance of a biomaterial. They also show that the appropriate chemical functionalization (NH2, OH), combined with Col IV pre-adsorption, comprises a prospective biomimetic modification that might provide insights for the improved endothelization of cardiovascular implants.

The cell cycle genes homology region (CHR) has been identified as a DNA element with an important role in transcriptional regulation of late cell cycle genes. It has been shown that such genes are controlled by DREAM, MMB and FOXM1-MuvB and that these protein complexes can contact DNA via CHR sites. However, it has not been elucidated which sequence variations of the canonical CHR are functional and how frequent CHR-based regulation is utilized in mammalian genomes. Here, we define the spectrum of functional CHR elements. As the basis for a computational meta-analysis, we identify new CHR sequences and compile phylogenetic motif conservation as well as genome-wide protein-DNA binding and gene expression data. We identify CHR elements in most late cell cycle genes binding DREAM, MMB, or FOXM1-MuvB. In contrast, Myb- and forkhead-binding sites are underrepresented in both early and late cell cycle genes. Our findings support a general mechanism: sequential binding of DREAM, MMB and FOXM1-MuvB complexes to late cell cycle genes requires CHR elements. Taken together, we define the group of CHR-regulated genes in mammalian genomes and provide evidence that the CHR is the central promoter element in transcriptional regulation of late cell cycle genes by DREAM, MMB and FOXM1-MuvB.

Screening of a deeply sequenced transcriptome using Illumina sequencing as well as the genome of the tardigrade Hypsibius dujardini revealed a set of five opsin genes. To clarify the phylogenetic position of these genes and to elucidate the evolutionary history of opsins in Panarthropoda (Onychophora + Tardigrada + Arthropoda), we reconstructed the phylogeny of broadly sampled metazoan opsin genes using maximum likelihood and Bayesian inference methods in conjunction with carefully selected substitution models. According to our findings, the opsin repertoire of H. dujardini comprises representatives of all three major bilaterian opsin clades, including one r-opsin, three c-opsins, and a Group 4 opsin (neuropsin/opsin-5). The identification of the tardigrade ortholog of neuropsin/opsin-5 is the first record of this opsin type in a protostome, but our screening of available metazoan genomes revealed that it is also present in other protostomes. Our opsin phylogeny further suggests that two r-opsins, including an "arthropsin", were present in the last common ancestor of Panarthropoda. While both r-opsin lineages were retained in Onychophora and Arthropoda, the "arthropsin" was lost in Tardigrada. The single (most likely visual) r-opsin found in H. dujardini supports the hypothesis of monochromatic vision in the panarthropod ancestor, whereas two duplications of the ancestral panarthropod c-opsin have led to three c-opsins in tardigrades. Although the early-branching nodes are unstable within the metazoans, our findings suggest that the last common ancestor of Bilateria possessed six opsins: two r-opsins, one c-opsin, and three Group 4 opsins, one of which (Go opsin) was lost in the ecdysozoan lineage.