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L'objectiu principal d'aquest treball ha estat la caracterització del procés demort cel·lular en la isquèmia en els cardiomiòcits. En el nostre estudi hem demostratque l'expressió de les principals proteïnes reguladores de la mort cel·lular dependentde caspases es reprimeix durant el desenvolupament cardíac. En correlació ambaquest fet hem observat que la mort cel·lular induïda per isquèmia és dependent decaspases als cardiomiòcits embrionals, mentre que els cardiomiòcits postmitòticsmoren de forma independent de caspases. En el nostre treball també hem demostratque Endonucleasa G (EndoG) és la principal nucleasa responsable de la degradacióde l'ADN, i en particular del senyal positiu de TUNEL, als cardiomiòcits postnatalsdurant la isquèmia, mentre que Apoptosis-inducing Factor (AIF) podria protegir lasupervivència dels cardiomiòcits durant la reoxigenació. La rellevància d'ambduesmolècules correlaciona amb els nostres resultats en què AIF i EndoG augmenten laseva expressió durant el desenvolupament cardíac. Per últim, hem determinat queBNIP3, membre de la família de Bcl2, controla el procés de degradació d'ADNdependent d'EndoG en la isquèmia cardíaca sense impedir l'alliberament d'aquestaproteïna del mitocondriFa més d'una dècada que es va suggerir per primera vegada la rellevància dela mort apoptòtica al cor en contraposició a la mort necròtica. Tot i que s'ha suggeritla implicació de la via apoptòtica dependent de receptors de mort, així com la viamitocondrial i, fins i tot s'ha descartat la implicació de caspases en la mortisquèmica, avui en dia encara es desconeixen molts dels mecanismes involucrats enaquests procés. En aquest context el nostre treball és rellevant perquè: descarta laimplicació de les caspases en la mort cardíaca durant la isquèmia, identifica aEndonucleasa G com a un executor de mort durant la isquèmia cardíaca i identifica aBNIP3 com a proteïna mitocondrial que indueix aquest mecanisme de mort. Lesnostres dades poden ajudar a interpretar la sortida de citocrom c i el senyal positiu deTUNEL, ja que hem determinat que Endonucleasa G origina el senyal de TUNEL enels cardiomiòcits i que la sortida de citocrom c no activa mort dependent de caspasesen els cardiomiòcits postnatals. / El objetivo principal de este trabajo ha sido la caracterización del proceso demuerte celular en cardiomiocitos durante la isquemia. En nuestro estudio hemosdemostrado que la expresión de las principales proteínas reguladoras de muertecelular dependiente de caspasas se reprime durante el desarrollo cardíaco. Encorrelación con este hecho hemos observado que la muerte celular inducida porisquemia es dependiente de caspasas en cardiomiocitos embrionales, mientras que loscardiomiocitos postmitóticos mueren de forma independiente de caspasas. En nuestrotrabajo hemos demostrado también que Endonucleasa G (EndoG) es la principalnucleasa responsable de la degradación de ADN en los cardiomiocitos postnatalesdurante la isquemia, y en particular de la señal positiva de TUNEL, mientras queApoptosis-inducing factor (AIF) podría proteger la supervivencia de loscardiomiocitos durante la reoxigenación. La relevancia de ambas moléculascorrelaciona con nuestros resultados en los que EndoG y AIF aumentan su expresióndurante el desarrollo cardíaco. Por último, hemos determinado que BNIP3, miembrode la familia de Bcl2, induce el proceso de degradación de ADN dependiente deEndoG durante la isquemia cardiaca sin impedir la salida de esta proteína de lamitocondria.Hace más de una década que se sugirió por primera vez la relevancia de lamuerte apoptótica en el corazón en contraposición a la muerte necrótica. A pesar deque se ha sugerido la implicación de la vía apoptótica dependiente de receptores demuerte, así como de la vía mitocondrial, e incluso se ha descartado la implicación decaspasas en la muerte isquémica, hoy en día aún se desconocen muchos de losmecanismos implicados en este proceso. Dentro de este contexto nuestro trabajo esrelevante porque: descarta la implicación de las caspasas en la muerte cardiacadurante la isquemia, identifica a Endonucleasa G como a un ejecutor de muertedurante la isquemia cardiaca e identifica a BNIP3 como a una proteína mitocondrialque puede controlar este mecanismo de muerte. Nuestros datos pueden ayudar ainterpretar la salida de citocromo c y la señal positiva de TUNEL, ya que hemosdeterminado que Endonucleasa G origina la señal de TUNEL en los cardiomiocitos yque la salida de citocromo c no activa muerte dependiente de caspasas encardiomiocitos postnatales. / Our main objective has been the characterization of the cell death mechanismin cardiomyocytes under ischemic conditions. In our research we demonstrated thatthe whole caspase-dependent pathway is silenced during heart development. Incorrelation to these results, we showed that ischemia-induced cell death is caspasedependentin embryonic cardiomyocytes, yet postmitotic cardiomyocytes die in acaspase-independent manner. Our work also disclosed that Endonuclease G (EndoG)is the main nuclease responsible for DNA degradation in postnatal cardiomyocytesand induces the TUNEL-positive labeling, while Apoptosis-Inducing Factor (AIF)plays a prosurvival role in cardiomyocytes during reoxygenation. The relevance ofboth molecules correlates with the observation that AIF and EndoG are upregulatedduring heart development contrary to the genes involved in caspase-dependent celldeath. Finally, our results show that BNIP3, a pro-death Bcl2 family member,induces EndoG-dependent DNA degradation without preventing EndoG release frommitochondria during ischemia.More than one decade ago, the relevance of apoptotic cell death wassuggested in heart in opposition to necrotic cell death. Death receptors and themitochondrial intrinsic pathway have been suggested to be involved in ischemiainducedcell death. Several authors have refused the implication of caspases inischemic cell death. However most of the mechanisms involved in that process arestill unknown. In that context our study is relevant because: it discards theinvolvement of caspases in ischemia-induced cardiac cell death, it identifiesEndonuclease G as a cell death executor during cardiac ischemia, and it identifiesBNIP3 as a mitochondrial protein controlling this cell death mechanism. Our datacontribute to understand cytochrome c release and TUNEL-positive labeling, as wehave determined that Endonuclease G produces TUNEL labeling in cardiomyocytesand that cytochrome c release doesn't activate caspase-dependent cell death inpostmitotic cardiomyocytes.

La citocina TWEAK pertany a la família del TNF i està implicada en diverses activitats biològiques com la proliferació, la diferenciació, la inflamació, la migració, i fins i tot la mort cel•lular; i senyalitza a través del seu receptor Fn14. Aquesta citocina es troba unida a la membrana (mTWEAK) o bé en forma soluble (sTWEAK) després d'un processament proteolític. Els nivells de sTWEAK estan disminuïts en malalties cardiovasculars. A més, s'ha descrit que sTWEAK pot interferir de forma negativa en l'activitat proinflamatòria de TNFα. Les dades que es mostren a continuació indiquen que TWEAK i Fn14 es sobreexpressen en el teixit adipós d'obesos severs. Curiosament, els adipòcits del teixit adipós subcutani d'aquests pacients mostren una major expressió de Fn14, mentre que els macròfags de tipus M2 expressen mTWEAK. A més, vam demostrar que TWEAK actua com una citocina proinflamatòria sobre l'adipòcit i que només la inflamació, però no la hipòxia ni l'estrès de reticle, pot regular l'expressió de TWEAK al macròfag i de Fn14 en l'adipòcit. Malgrat aquesta capacitat inflamatòria, hem demostrat una activitat competitiva de sTWEAK amb TNFα, en interferir amb aquest en esdeveniments de senyalització en l'adipòcit, provocant una modulació de la resposta inflamatòria induïda pel TNFα sobre aquest tipus cel•lular. Pel que fa a sTWEAK, la disminució observada en sèrum dels pacients amb obesitat severa podria afavorir la resposta inflamatòria del TNFα en aquest context. Els resultats que recull aquesta tesi apunten que l'eix TWEAK/Fn14 té un paper rellevant en la fisiopatologia de l'obesitat. / La inflamación sistémica crónica que existe en la obesidad está mediada por la presencia de citocinas proinflamatorias, tanto a nivel sistémico como local. Esta inflamación se ve favorecida por la presencia de hipoxia local y estrés de retículo endoplasmático en el tejido adiposo. TWEAK es una citocina de la familia del TNF implicada en diversas actividades biológicas como proliferación, diferenciación, inflamación, migración, incluso muerte celular, y señaliza a través de su receptor Fn14. Esta citocina se encuentra unida a membrana (mTWEAK) o en forma soluble (sTWEAK) tras un procesamiento proteolítico. Los niveles de sTWEAK están disminuidos en enfermedades cardiovasculares. Además, se ha descrito que sTWEAK puede interferir de forma negativa en la actividad proinflamatoria de TNFα. Los datos que se muestran a continuación indican que TWEAK y Fn14 se sobreexpresan en el tejido adiposo de obesos severos. Curiosamente, los adipocitos del tejido adiposo subcutáneo de éstos pacientes muestran una mayor expresión de Fn14, mientras que los macrófagos de tipo M2 expresan mTWEAK. Además, demostramos que TWEAK actúa como una citocina proinflamatoria sobre el adipocito y que sólo la inflamación, pero no la hipoxia ni el estrés de retículo pueden regular la expresión de TWEAK en el macrófago y de Fn14 en el adipocito. A pesar de esta capacidad inflamatoria, hemos demostrado una actividad competitiva de sTWEAK con TNFα, al interferir con éste en eventos de señalización en el adipocito, provocando una modulación de la respuesta inflamatoria inducida por TNFα sobre este tipo celular. Respecto a sTWEAK, la disminución observada en suero de los pacientes con obesidad severa podría favorecer la respuesta inflamatoria de TNFα en dicho contexto. Los resultados que recoge esta tesis apuntan a que el eje TWEAK/Fn14 tiene un papel relevante en la fisiopatología de la obesidad. / Chronic systemic inflammation in obesity is mediated by the presence of pro-inflammatory cytokines. This inflammation is favored by the presence of local hypoxia and endoplasmic reticulum stress in the adipose tissue. TWEAK is a TNF family member cytokine involved in various biological activities such as proliferation, differentiation, inflammation, migration, and even cell death. TWEAK signals through its receptor, Fn14. This cytokine is found as membrane-bound (mTWEAK) form or in soluble form (sTWEAK) due to proteolytic processing. sTWEAK levels are decreased in cardiovascular diseases. Morevoer, sTWEAK may interfere negatively on the proinflammatory activity of TNFα. The data presented in this Thesis indicates that TWEAK and Fn14 are overexpressed in adipose tissue of severely obese subjects. Interestingly, the adipocytes isolated from subcutaneous adipose tissue of these patients showed increased expression of Fn14, while M2 macrophages expresed mTWEAK form. Furthermore, we demonstrate that TWEAK acts as a proinflammatory cytokine over the adipocyte. Only inflammatory stimuli can regulate the expression of TWEAK in the macrophage and Fn14 on the adipocyte, not hypoxia or reticulum stress stimuli. Despite the inflammatory capacity observed for TWEAK, we have observed a competitive activity of sTWEAK over TNFα, interfering with signaling events in the adipocyte, causing a modulation of TNFα induced inflammatory response in this cell type. Regarding sTWEAK, the decrease in serum levels observed in severely obese subjects may favor the inflammatory response of TNFα in this context. The data from this Thesis suggest that TWEAK/Fn14 axis plays an important role in the pathophysiology of obesity.

La dispersion, caractérisée par les mouvements d’individus dans l’espace conduisant à la production d’un flux de gènes, permet la connectivité des populations. L’étude de la dispersion est devenue d’une importance primordiale pour prédire les conséquences des changements globaux sur la structure et la dynamique des populations. Les espèces à dispersion limitées, comme les chéloniens, sont particulièrement menacées par ces phénomènes. Cette étude se propose d’analyser la dispersion chez la Cistude d’Europe (Emys orbicularis), en régression en Europe, dans un contexte de fragmentation d’habitats et de déterminer les causes de ce comportement via l’analyse de la dynamique et de la génétique des populations. Nos résultats montrent, d’une part, que les temps de générations lents chez les cistudes (environ 12 ans) peuvent ralentir les phénomènes d’érosion génétique par dérive. Cette érosion lente est accentuée en présence de grandes populations même en milieu très fragmenté. D’autre part, la sélection aurait favorisée la philopatrie chez les femelles cistudes dans les milieux peu riches en site de ponte et de faible densité d’individus car elles ont un avantage à la territorialité. A l’inverse, le coût à la dispersion diminuerait pour les mâles car ce comportement éviterait la consanguinité. Les cistudes semblent donc très sensibles à la compétition intra-spécifique. En effet, la relaxation de la densité-dépendance des adultes permet un recrutement important de juvéniles. Cette dynamique favoriserait une récupération rapide des effectifs après une importante perturbation, ce qui est surprenant pour une espèce longévive dont les temps de résilience sont supposés lents. / Dispersal, characterized by the movements of individuals in space leading to gene flows, allows populations to connect. The study of dispersal has become of essential importance to predict the consequences of global changes on the population structures and dynamics. Species with limited dispersal, such as chelonians, are particularly threatened by these phenomena. Our study aimed at analyzing the dispersal of the European pond turtle (Emys orbicularis), in decline in Europe, in a habitats fragmentation context and determining the causes of this behavior through analysis of population dynamics and genetics. Our results show, firstly, that the slow generation time in Emys orbicularis (about 12 years) may slow the genetic erosion by drift. This slow erosion is accentuated with large populations such as Kerkini populations, even with a strong fragmentation. On the other hand, selection would have favored philopatry in females in habitats with few nesting site and deers, because they have the advantage of territoriality. In contrast, the cost of dispersal decreases for males because this behavior allows inbreeding avoidance. The European pond turtles seem very sensitive to intra-specific competition. Indeed, the relaxation of adult density-dependence allows for a significant recruitment of juveniles. This dynamic promotes an unexpected rapid response of the population after a major disturbance, because chelonians are long-lived animals with a late age of first reproduction and very high generation time, therefore, the time of resilience to perturbations is also expected to be high.

L’atrazine, un des herbicides les plus utilisés pour contrôler le développement des plantes adventices dans les cultures, a conduit à la contamination de l’environnement. L’exposition chronique à cet herbicide a conduit à l’émergence de populations microbiennes du sol capables de dégrader l’atrazine et de l’utiliser comme une source d’azote pour leur croissance. Ces populations microbiennes sont responsables de la biodégradation accélérée (BDA) de l’atrazine, un service écosystémique contribuant à diminuer la persistance de cet herbicidedans l’environnement. L’objectif de ce travail était d’étudier les mécanismes génétiques et physiologiques responsables du fonctionnement et de l’amélioration de ce service écosystémique. Nous avons appliqué une démarche expérimentale allant des gènes codant la dégradation à des communautés microbiennes afin d’identifier les processus adaptatifs impliqués dans l’évolution de la fonction de BDA de l’atrazine.Le premier volet a consisté à évaluer l’importance de mutations accumulées dans le gène atzA dans la transformation de l’atrazine en hydroxyatrazine catalysée par AtzA. Le séquençage de gènes atzA de différents isolats bactériens dégradant l’atrazine (Pseudomonas sp. ADP WT, Pseudomonas sp. ADP Ps et différents Chelatobacter heintzii) a montré que la séquence du gène atzA était très conservée. Toutefois quatre mutations non silencieuses ont pu être identifiées (1 chez Pseudomonas sp. ADP MSE et 3 chez Chelatobacterheintzii). La modélisation de la structure de la protéine AtzA a permis de montrer que trois des mutations étaient situées dans des régions importantes (site actif, poche de liaison avec l’atrazine et liaison avec le métalFe2+. [...] Le second volet a consisté à étudier la plasticité de la voie de biodégradation de l’atrazine dans deux conditions opposées : (i) la première visait à évaluer la persistance de la capacité de dégradation en absence de pression de sélection et (ii) la seconde visait à évaluer l’évolution de la capacité de dégradation en présence d’une pression de sélection élevée. Pour conduire ces études, des manipulations d’évolution expérimentale sur Pseudomonas sp. ADP ont été menées. (i) L’exposition à l’acide cyanurique, intermédiaire métabolique de l’atrazine, a conduit à la sélection d’une population nouvellement évoluée capable de croître plus rapidement dans un milieu de culture ne contenant que l’acide cyanurique comme source d’azote. Cette population est caractérisée par une délétion d’une région de 47 kb du plasmide ADP1 contenant les gènes atzABC. Les analyses conduites ont permis de conclure que le gain de compétitivité de la population évoluée résidait dans la perte du fardeau génétique représenté par la région de 47 kb, la capacité de dégradation de l’acide cyanurique restant inchangée. (ii) L’exposition à l’atrazine a conduit à la sélection d’une populationnouvellement évoluée caractérisée par l’insertion du plasmide ADP1 en quasi-totalité sur le chromosome bactérien. [...] Le troisième volet a consisté à développer un outil permettant d’évaluer, à l’échelle d’une communauté microbienne synthétique, l’évolution du potentiel génétique dégradant. Pour ce faire quatre souches dégradantes dont une, Arthrobacter sp. TES6, isolée au cours de cette étude, ont été choisies. [...] Ces travaux montrent que la fonction de biodégradation accélérée de l’atrazine est très versatile et qu’elle est en constante évolution. Il met en évidence que le principal facteur pilotant cette évolution est le niveau d’exposition des populations dégradantes au pesticide. / Atrazine, one of the most used herbicide to control the development of weeds in crop, has led to the contamination of the environment. Repeated exposure to this herbicide resulted in the emergence of microbial populations able to degrade atrazine and to use it as a nitrogen source for its growth. These microbial populations are responsible for accelerated biodegradation of atrazine (BDA), a key ecosystemic service diminishing the persistence of this herbicide in the environment. The aim of this PhD work was to study genetic and physiological mechanisms responsible for functioning and improving of this ecosystemic service. We applied an experimental approach starting from genes to communities degrading atrazine in order to identify processes of adaptation involved in the evolution of accelerated biodegradation function.The first part of the PhD aimed at evaluating the importance of accumulation of single mutations in the atzA gene for the activity of AtzA transforming atrazine to hydroxyatrazine. Sequencing or atzA genes amplified from different atrazine-degrading isolates (Pseudomonas sp. ADP WT, Pseudomonas sp. ADP Ps and differents Chelatobacter heintzii) showed that atzA sequence was conserved. However, four non synonymous mutations were identified (1 for Pseudomonas sp. ADP Ps and 3 for Chelatobacter heintzii). Modeling of AtzA structure showed that three mutations were located in important regions (active site, interaction with atrazine and with the metal Fe2+). [...] The second part aimed at studying the plasticity of the atrazine-degrading pathway in two opposed conditions: (i) one aiming at evaluating the persistence of degrading capability in absence of selection pressure and (ii) a second one aiming at evaluating the evolution of degrading capability under high selection pressure exerted by atrazine. With these aims, experimental evolutions were carried out with Pseudomonas sp. ADP. (i) We showed that cyanuric acid exposure led to the selection of a newly-evolved population characterized by increased growing ability on culture medium containing this substance as nitrogen source. This population is characterized by the deletion of a 47 kb region containing atzABC genes from ADP1. We showed that increased fitness of newly-evolved population was due to the selective loss of the genetic burden represented by the 47 kb region, the cyanuric acid degrading ability remaining unchanged. (ii) Atrazine exposure led to the selection of population characterized by the insertion of ADP1 plasmid in the bacterial chromosome. [...] The third part aimed at developing a tool allowing monitoring the evolution of atrazine-degrading genetic potential at the scale of a synthetic microbial community. To do so four degrading strains among which, one was isolated in this study, were chosen. [...] Altogether, these results showed that the atrazine accelerated biodegradation function is highly versatile and under constant evolution. Furthermore, they highlight that the exposure to atrazine is the key parameter driving the evolution of degrading population

Les éléments transposables (ET) sont des séquences d’ADN capables de catalyser son propre mouvement et d’entrer dans de nouvelles régions du génome. Dans la présente étude, nous avons étudié Helena, un élément LINE qui est à différents stades de son cycle évolutif et donc, il est un bon modèle pour l’étude de la dynamique évolutive des TE. À travers une analyse de bio-informatique dans les douze génomes séquencés de la drosophile nous avons étudié l’évolution de Helena, et nous proposons un scénario possible pour l’évolution de cet élément. Helena est à différents stades de son cycle de vie, allant d’un état complet (D. simulans et D. mojavensis) à très dégradé (D. yakuba, D.erecta, D. ananassae et D. virilis) ou absent (D. pseudoobscura, D. persimilis, D. grimshawi et d. willistoni). L’analyse phylogénétique a montré que Helena était présent chez l’ancêtre commun du genre Drosophila et a été transmis verticalement dans des lignées dérivées. De plus, nous avons détectées des copies intactes uniquement chez D. mojavensis et nous avons étudié plus en détail sa région 5’ (extrémité). Nous avons utilisé un gène rapporteur et confirmé la présence du promoteur interne pour Pol II qui est associé à des modifications épigénétiques de l’histone : hétérochromatine permissive (H3K4me2) et répressive (H3K27me3). Ces « marques bivalents » indiquent que Helena peuvent être exprimés en réponse à un stimulus spécifique. Une étude de l’élément BS, un TE étroitement liée à Helena, a montré que la dynamique évolutive des deux ETs sont très similaires. Les résultats montrent que CET élément, comme Helena, se trouve à différents stades de son cycle évolutif / The transposable elements (TEs) are DNA sequences capable of catalyze its own movement and to enter into new regions of the genome. In the present study we studied Helena, a LINE element that is at different stages of its evolutionary cycle and therefore, it is a good model for studies of TEs evolutionary dynamics. Through bioinformatics analysis of 12 Drosophila species which have their genomes sequenced, we found Helena in different stages of its evolutionary cycle, that varies of at least one full active copy (D. mojavensis) an putatively complete copy, but inactive (D. simulans) to highly degenerate (D. yakuba, D. erecta, D. ananassae and D. virilis) or absent (D. pseudoobscura, D. persimilis, D. willistoni and D. grimshawi) sequences. Phylogenetic analysis showed that Helena was present in the common ancestor of the Drosophila genus and has been vertically transmitted in derived lineages, but lost on some of them. Since a complete highly active copy was observed only in D. mojavensis, we studied in more detail its 5' end region. We used a reporter gene and verified the presence of internal promoter for Pol II that is associated with epigenetic histone modifications for permissive (H3K4me2) and repressive heterochromatin (H3K27me3). These “bivalent marks” indicate that Helena can be expressed in response to specific stimulus. A study of BS element, a TE closely related to Helena, showed that the evolutionary dynamics of both TEs are very similar. Bioinformatics analysis of the 12 Drosophila genomes revealed that BS is also widely variable in the species analyzed regarding to distribution, abundance, degree of degradation and also about their evolutionary cycle

Le code génétique est la table de correspondance entre codons (unité structurelle d'un gène) et acides aminés (brique élémentaire des protéines). Le code génétique est (1) universel, tous les êtres vivants ou presque partagent le même code; (2) univoque, chaque codon spécifie un seul acide aminé et (3) dégénéré, les acides aminés peuvent être codés par plusieurs codons. Ce code dégénéré est donc utilisé par l'ensemble du vivant mais pas de la même manière, certains codons synonymes étant utilisés préférentiellement chez des espèces et pas d'autres. Pour comprendre l'émergence des biais d'usage du code (BUC) génétique entre espèces, je me place dans un contexte évolutif.Dans ce manuscrit, je présente mes travaux de recherche en quatre parties. La première partie introductive décrit la mise en évidence et les propriétés du code génétique, son biais d'usage et les diverses caractéristiques de précédents modèles de codons. La deuxième partie présente le modèle d'évolution de codons SENCA pour Sites Evolution at the Nucleotides, Codons and Amino-acids layers que j'ai développé durant ma thèse. SENCA prend en compte la structure du code génétique. Je valide sa paramétrisation par des simulations numériques et une étude sur des espèces bactériennes ou archées. La partie suivante décrit deux extensions de SENCA qui modélisent plusieurs hypothèses d'origines évolutives du BUC et une application de SENCA sur les conséquences génomiques d'adaptations environnementales. La dernière partie étudie les origines de variations de BUC le long du génome humain par une approche de génomique comparative / In this manuscript, I introduce my doctoral research in four parts. The first introductive part highlights the properties of the genetic code and its usage bias but also the caracteristics of previous published codons models. The second part presents an evolutionary codons models named SENCA for Sites Evolution at the Nucleotides, Codons and Amino-acids layers that I developped. SENCA takes into account the genetic code structure. I perform simulations and study prokaryotes species to confirm its parametrization. The following part provides two extensions of SENCA to test the hypotheses concerning the evolutive origins of CUB and an application of SENCA to study the genomic consequences of an environmental adaptation. The last part studies the origins of CUB variation within the human genome using a comparative genomic strategy

Le cilié Paramecium tetraurelia est un modèle intéressant pour l'étude de la diversité et de l'évolution des voies d'ARN interférence (ARNi) chez les eucaryotes. L'une des voies d'ARNi végétatives peut être induite en nourrissant les paramécies de bactéries produisant un ARN double-brin (ARNdb) homologue à un gène donné, dont l'expression est inactivée de manière post-transcriptionnelle par la production de siARN de 23 nt. Un crible de mutagénèse a permis d'obtenir des mutants mendéliens déficients pour l'ARNi, dont les génomes ont été séquencés afin d'identifier sans a priori des gènes impliqués dans cette voie. 6 gènes ont été identifiés: un Dicer, deux ARN polymérases ARN-dépendantes (RDR1 et 2), une nucléotidyl-transférase (CID1) et deux gènes codant de nouvelles protéines (PDS1 et 2). Pour étudier leur rôle dans la biosynthèse ou l'action des siARN, ces derniers ont été séquencés à partir de cellules sauvages ou mutantes, nourries d'un ARNdb homologue à un gène non essentiel. L'analyse bio-informatique a montré que des siARN dits 'primaires' sont produits à partir de l'ARNdb bactérien, tandis que des siARN dits 'secondaires' sont produits à partir de la totalité de l'ARNm endogène ciblé, et sont majoritairement de polarité anti-sens. Alors que la production des siARN primaires dépend de tous les gènes étudiés, les résultats n'impliquent que RDR2 dans celle des siARN secondaires. Enfin, j'ai montré que certains clusters de siARN endogènes dépendent de RDR1 et de CID1, tandis que d'autres dépendent de RDR2. La paramécie produit également des siARN antisens aux ARN ribosomaux bactériens, suggérant de nouvelles hypothèses quant à la fonction naturelle de cette voie. / The ciliate Paramecium tetraurelia is an interesting model to study the diversity and evolution of RNA interference (RNAi) pathways. One of the vegetative RNAi pathways is induced by feeding cells with bacteria producing double-stranded RNA (dsRNA) homologous to a given gene, which is then post-transcriptionally silenced through the production of 23-nt siRNAs. A forward genetic screen allowed us to obtain Mendelian mutants deficient in dsRNA-induced RNAi, and mutated genes were identified by whole-genome resequencing. 6 genes were identified: one Dicer, two RNA-dependent RNA polymerases (RDR1 et 2), one nucleotidyl-transferase (CID1) and two genes encoding novel poteins (PDS1 and 2). To study their roles in siRNA biosynthesis or action, we sequenced small RNAs from wild-type or mutants cells fed with a dsRNA homologous to a non-essential endogenous gene. Bioinformatic analyses showed that 'primary' siRNAs are produced from the bacterial dsRNA trigger, while 'secondary' siRNAs, predominantly of antisense polarity, are produced from the whole length of the targeted endogenous mRNA. While primary siRNA production requires all of the genes studied, the results only implicate RDR2 in the production of secondary siRNAs. Finally, I showed that some clusters of endogenous siRNAs depend on RDR1 and CID1, whereas others depend on RDR2. Paramecium was also shown to produce siRNAs that are antisense to bacterial ribosomal RNAs, suggesting new hypotheses about the possible natural functions of this pathway.

La proteína Alex3 forma parte de la familia de genes exclusiva de los mamíferos euterios Armcx, caracterizada por presentar una alta expresión en el SNC, por encontrarse localizada en clúster en el cromosoma X y porque se originaron a partir de la retrotransposición del gen Armc10 y una rápida duplicación en tándem en una evolución temprana de los mamíferos euterios. Las proteínas Armcx/Armc10 poseen primariamente una localización subcelular bimodal, encontrándose asociadas a la membrana externa mitocondrial y en el núcleo celular, localización que concuerda con sus secuencias proteicas que poseen putativos dominios de localización en estos compartimentos. La sobreexpresión de las proteínas Armcx/Armc10 produce una profunda alteración de la red mitocondrial, demostrando que esta familia de proteínas juega un papel importante en la regulación de la dinámica y agregación mitocondrial y al menos, la sobreexpresión de la proteína Alex3, no induce cambios en los parámetros bio-energéticos mitocondriales, tales como el consumo de oxígeno, el potencial de membrana, el contenido de DNA mitocondrial, la actividad de la citocromo c oxidasa o la recaptación de Ca2+, ni alteran el balance de fisión/fusión mitocondrial. Tanto la sobreexpresión como el silenciamiento de las proteínas Alex3 y Armc10 en neuronas hipocampales se ha visto alteran la distribución y transporte mitocondrial. Las proteínas Alex3 y Armc10 interaccionan con el complejo Kinesina/Miro/Trak2, regulador del transporte mitocondrial, lo cual sugiere que esta familia de proteínas regularían el transporte y dinámica mitocondrial a través de este complejo de proteínas. La interacción de Alex3 con este complejo también se ha visto es dependiente de los niveles de Ca2+, reduciéndose la interacción de estas proteínas cuando los niveles de Ca2+ son elevados. Por otra parte, la vía de señalización asociada a proteínas Wnt se ha visto induce la degradación de la proteína Alex3 por un proceso independiente del proteosoma. Esta degradación no depende de los componentes de la vía canónica Dishevelled, GSK3-β y β-catenina ni de los componentes no canónicos JNK, CAMKII y calcineurina, habiéndose demostrado que la PKC y la CK2 juegan un papel principal en el control y degradación de los niveles de la proteína Alex3 de forma dependiente e independiente de las vías de señalización de Wnt. De manera similar, la depleción de los niveles intracelulares de Ca2+ también reproduce la degradación de Alex3. Además, la degradación de Alex3 a través de las vías de señalización asociadas a las proteínas Wnt revierte los fenotipos de agregación mitocondrial inducidos por la sobreexpresión de Alex3 y es evitado por la activación de la PKC, lo que sugiere que las proteínas Wnt podrían jugar un papel en el control de la dinámica mitocondrial mediante la regulación de las proteínas Armcx. / Alex3 protein belongs to the eutherian specific family of genes Armcx, characterized by a high expression on the CNS, to be localized in a cluster on the X chromosome and to be originated by retrotransposition of Armc10 gene in a fast duplication in tandem. The Armcx/Armc10 proteins have a primary bimodal localization, both in nucleus and mitochondria as indicate their putative domains. Overexpression of Armcx/Armc10 proteins causes a profound alteration on the mitochondrial net showing that this family of proteins plays an important role in the regulation of the mitochondrial dynamics and at least, the overexpression of Alex3 protein neither change the bioenergetic parameters of mitochondria such as respiration, mitochondrial DNA content or calcium uptake nor alters the mitochondrial fusion/fission rate. Both the overexpression and knock-down of Alex3 and Armc10 proteins in hippocampal neurons alters the mitochondrial distribution and transport. Alex3 and Armc10 interact with the Kinesin/Miro/Trak2 mitochondrial transport regulator complex, suggesting that the Armcx protein family regulates mitochondrial dynamics through this complex. Moreover the interaction of Alex3 with this complex is dependent of calcium levels, diminishing the interaction when calcium levels are high. On the other hand, the Wnt signalling pathway induces the degradation of Alex3 protein in a proteosome independent process. This degradation is independent of the Wnt canonical and non-canonical members Dishevelled, GSK3β, β-catenin, JNK, calcineurin and CAMKII, but showing that the PKC and CKII members play a principal role in the control and degradation of Alex3 protein levels dependently and independently of Wnt pathways. Moreover, Alex3 degradation through Wnt signalling pathways, reverts the mitochondrial aggregation phenotypes and is avoided by PKC activation, suggesting that Wnt proteins can play a role in the control of mitochondrial dynamics through the regulation of Armcx proteins.

En els últims anys, diversos treballs han demostrat que els astròcits participen activament en el desenvolupament i la plasticitat del sistema nerviós central, així com en la modulació de la neurotransmissió. Característicament, la majoria de les accions descrites dels astròcits sobre la fisiologia i la patologia neuronal són mitjançades per secreció vesicular. En el aquest treball s’han identificat les molècules implicades en l’exocitosi de cèl•lules astroglials. Malgrat que alguns components són comuns amb les neurones, altres com sintaxina 4, VAMP3 i SNAP23 s’expressen de forma específica en les cèl•lules astroglials. Tractaments activadors o de maduració diferencialment regulen l’expressió de diferents isoformes de proteïnes exocítiques en cèl•lules glials in vitro. Així, l’activació amb citocines proinflamatòries augmenta l’expressió d’algunes SNAREs i els seus reguladors en glia, com sintaxina4 i munc18b. La correlació entre els nivells d’expressió d’aquestes proteïnes exocítiques i l’augment de la secreció de mediadors d’activació i inflamació suggereix un important paper d’aquestes molècules en la secreció de cèl•lules activades. Amb l’objectiu d’estudiar la secreció regulada per calci en astròcits madurs s’ha obtingut un fenotip madur glial in vitro mitjançant l’activació de la via del AMPc. L’anàlisi global amb "gene set enrichment analysis" del transcriptoma astrocitari ha demostrat que l’increment en els nivells intracel•lulars d’AMPc reprimeix la immaduresa i activació dels astròcits i promou la seva maduració. Aquesta maduració dependent de la via del AMPc augmenta l’expressió de proteïnes exocítiques, com per exemple VAMP2, així com la via de secreció regulada per calci dels pèptids ANP i SgII. Finalment, mitjançant assajos de pèrdua de funció, es demostra un paper d’aquestes proteïnes en la secreció de pèptids glials. Aquests resultats suggereixen que diferents molècules d’exocitosi mitjancen diferents processos de secreció glials. Per altra banda, en aquesta tesi s’ha identificat un nou component de la via de secreció astroglial, tant in vitro com in vivo, la SgIII. En cèl•lules neuroendocrines SgIII actua com un receptor de direccionament a grànuls secretors. En cèl•lules astroglials SgIII presenta una forma molecular i una dinàmica de secreció diferencial a cèl•lules neuroendocrines. A més, hem demostrat una notable sobreexpressió d’aquesta proteïna en astròcits reactius en lesions traumàtiques, la qual cosa suggereix una participació de SgIII en els mecanismes de protecció o dany cerebral en lesions del sistema nerviós central. / In recent years, several studies have demonstrated that astrocytes influences neuronal development, function and plasticity through vesicular transmitter release. However, secretory pathways and the involved molecular mechanisms in astroglial cells are poorly known. In this study, we showed that a variety of SNARE and Munc18 isoforms were expressed by cultured astrocytes, with syntaxin-4, Munc18c, SNAP-23 and VAMP-3 being the most abundant variants. Exocytotic protein expression was differentially regulated by activating and differentiating agents. Specifically, proteins controlling Ca2+-dependent secretion in neuroendocrine cells were up-regulated after long-term 8Br-cAMP administration in astrocytes, but not by proinflammatory cytokines. We also analyzed the global transcriptome of cultured astroglial cells incubated with activators of cAMP pathways. cAMP analogs strongly upregulated genes involved in typical functions of mature astrocytes, whereas they downregulated a considerable number of proliferating and immaturity-related transcripts. Gene Set Enrichment Analysis and evaluation in situ of gene expression in astrocytes in different states showed that cAMP signaling conferred a mature and in vivo–like transcriptional profile to cultured astrocytes. Moreover, 8Br-cAMP treatment greatly increased the cellular content of exocytotic proteins such as VAMP-2 and stimulated Ca2+-dependent secretion of secretogranin-2 and ANP. Regulation of both exocytotic protein expression and Ca2+-dependent peptide secretion in astrocytes by differentiating and activating agents suggested that glial secretory pathways were adjusted in different physiological states. In this thesis, we showed the expression, transcriptional regulation, trafficking and release of the secretory pathway component SgIII in astroglial cells. In endocrine cells, SgIII is a key sorting receptor for peptide hormones while astrocytes produced and released a non-processed form. Moreover, SgIII expression was specifically upregulated in reactive astrocytes after perforating brain injury. These results showed that SgIII is a reliable component of the astrocyte secretory pathway and suggest important roles for glial SgIII in the glia–neuron communication.