Doctor en Bioquímica / En la neocorteza de mamíferos, la transición de progenitores neurales a neuronas de proyección y la mantención de la identidad neuronal recaen en la combinación de programas genéticos y epigenéticos que modulan eventos celulares como salida del ciclo celular, migración y diferenciación en neuronas funcionales. Estudios in vitro e in silico han mostrado que CoREST (REST Corepressor-1) es un factor importante en la coordinación de cambios de la estructura de la cromatina y actividad de genes durante la neurogénesis. CoREST es un componente fundamental de complejos de represión transcripcional y contribuye al ensamblaje de la maquinaria de remodelamiento de la cromatina en genes asociados con la identidad celular de progenitores neuronales y con la adquisición del fenotipo celular apropiado. CoREST puede formar complejos con diferentes proteínas como REST/NRSF, Nurr1, Tlx, Hsf1 y Znf198 (entre otras). Ejerce su función a través de enzimas que introducen modificaciones post traduccionales en las histonas, tales como la demetilasa de histonas específica de lisinas, LSD1 y las histonas desacetilasas, HDAC 1/2. Sin embargo, no existían estudios asociados al papel de CoREST sobre la neurogénesis durante el desarrollo. En esta tesis, se realiza un análisis de la función in vivo de CoREST. Estudios de inmunofluorescencia revelaron que CoREST está ampliamente expresado en la corteza cerebral durante el desarrollo y en etapas postnatales. Se utilizó la estrategia de electroporación in utero para introducir plasmidios que codifican horquillas cortas de RNA (shRNA) contra CoREST y así disminuir su expresión en progenitores neuronales localizados en la zona ventricular telencefálica. Esta aproximación reveló que la disminución de CoREST produce una alteración en la migración radial neuronal y a la vez cambios en la morfología. La inmunodetección de proteínas asociadas con distintos estadios de diferenciación celular no evidenció alteraciones en la adquisición del fenotipo neuronal (neuronas Tuj1+ y Vglut+), ni cambios significativos sobre la proliferación o sobrevida celular. En contraste, se observó un aumento en la proporción de progenitores neuronales Sox2+ y Tbr2+. Para profundizar en estos hallazgos, se realizaron experimentos de rescate utilizando variantes truncadas de CoREST para explorar cual dominio era relevante para recuperar la posición normal de las neuronas en la corteza. En estos experimentos el shRNA contra CoREST fue co-electroporado con el vector que codifica cada versión truncada de CoREST. La pérdida de función de CoREST fue revertida por una construcción desprovista del dominio de interacción con REST/NRSF (región N-terminal). Al mismo tiempo, la disminución en la expresión de REST/NRSF no generó perturbaciones significativas del desarrollo de las neuronas de projección. Por otra parte, la variante de CoREST carente del dominio de interacción con LSD1 (región C-terminal) no rescató el defecto en el posicionamiento neuronal causado por la disminución de CoREST. En estas condiciones experimentales, los datos presentados muestran que la función de CoREST en asociación con LSD1, pero no con REST/NRSF es requerida durante la ejecución del programa de desarrollo de las neuronas de projección. / In the developing mammalian neocortex, the transition from proliferating neural progenitors to projection neurons and the maintenance of neuronal identity relies on genetic and epigenetic programs that combine to establish the cell cycle exit, migration and differentiation into mature neurons. The in vitro evidence and biochemical data show that a key factor in the coordination of changes of chromatin structure and gene activity during neurogenesis is REST Corepressor-1 (CoREST). CoREST is a component of transcriptional repression complexes, contributing to the assembly of chromatin remodeling machinery at genes related with neural progenitors identity and cell fate decisions. CoREST can form complexes with different partners as REST/NRSF, Nurr1, Tlx, HSF1 and Znf198, and exerts its function through chromatin modifying enzymes, such as HDAC1/2 and LSD1. However, to date, no data had reported an effect of CoREST on neurogenesis during embryonic development. Here, the first functional in-vivo study of CoREST, it was detected that CoREST is widely expressed in the cerebral cortex during development and adulthood. It was used in utero electroporation of short hairpin RNA (shRNA) constructs into neuronal progenitors located in the cortical ventricular zone to knockdown CoREST. This approach revealed that radial migration of CoREST-deficient neurons is altered as well as their morphology. The neuronal identity of CoREST-knocked-down cells was unchanged (Tuj1+, Vglut+). By contrast, it was observed an increase of Sox2+ and Tbr2+ neural progenitor proportion without noticeable effect on cell proliferation and cell survival. To extend these findings, it was performed rescue experiments to examine the ability of distinct CoREST truncated versions to recover the normal neuronal position into the cortex. In these experiments, the plasmids encoding the CoREST truncated versions were co-electroporated with the shRNA vector targeting CoREST. CoREST loss of function was rescued by a construct lacking the characterized domain of interaction with REST/NRSF (N-terminal region). In addition, the loss of expression of REST/NRSF did not associate to significant perturbations of projection neuron development. On the other hand, CoREST truncated form which lacks the LSD1 interacting domain (C-terminal region) failed to rescue the migratory defects caused by CoREST knockdown. Under this experimental approach, the data presented here show that CoREST function in association with LSD1, but not with REST/NRSF is required for the expression of the physiological developmental program of projection neurons. / Fondap, Fondecyt

Memoria para optar al Título Profesional de Médico Veterinario / Diversos estudios experimentales demuestran que modificaciones medioambientales (por ejemplo: nutricionales y lumínicas), pueden producir alteraciones en el desarrollo normal de la corteza cerebral occipital (visual) y sus conexiones. Por otra parte, es posible que en condiciones naturales, las especies animales hayan desarrollado adaptaciones a las distintas condiciones de luminosidad en que realizan su actividad. Recientemente se ha observado en roedores silvestres, con diferentes periodos de actividad y distinta relación filogenética, Abrothrix olivaceus y Phyllotis darwini, variaciones, estadísticamente significativas, en la densidad neuronal cortical occipital. En esta memoria de título se compararon especies con una mayor relación filogenética, para disminuir al mínimo la variable taxonómica. Se estudió la corteza occipital (visual), de roedores silvestres nativos adultos, de las especies Octodon degus (n = 5) y Octodon bridgesi (n = 3), pertenecientes al Orden Rodentia, Suborden Hystricognatha, Familia Octodontidae, con el propósito de evidenciar cambios detectados a través de la medición de la densidad neuronal, mediante la técnica del disector óptico, en cortes de 40 m, incluidos en celoidina y teñidos con Nissl. O. degus, que presenta un período de actividad diurna en el país, evidenció una densidad neuronal menor (34.32  2.51 x 104 neuronas/mm3) que la observada en O. bridgesi (39.55  0.64 x 104 neuronas/mm3), especie de período de actividad nocturna; lo cual fue estadísticamente significativo (t = 3.44, p < 0.05). Las diferencias encontradas se relacionarían con el tipo de condiciones de luminosidad en que se desenvuelven dichas especies, así como también, de otros factores que se relacionarían con este parámetro, como son la relación predador – presa y la alimentación, entre otras. / Proyecto FIV 9102081

Les malalties del cervell representen avui en dia un dels problemes de salut més importants del món desenvolupat, tant pel que fa a malalties neurològiques d’ampli abast, com la malaltia d’Alzheimer, com pel que fa a malalties psiquiàtriques greus, com l’esquizofrènia i la depressió. Els costos socioeconòmics directes (tractaments) i indirectes (baixes laborals, incidència familiar, atenció al malalt, etc.) de les malalties del cervell a la UE dels 25 pugen fins als 286.000 milions de € anuals, dels quals gairebé 240.000 milions són deguts a malalties mentals (Andlin-Sobocki et al., 2005). Dins d’aquestes, depressió i esquizofrènia. La prevenció i correcte tractament d’aquestes dues malalties representen avui en dia un dels reptes més importants de la Neurociència.

En els últims anys, diversos treballs han demostrat que els astròcits participen activament en el desenvolupament i la plasticitat del sistema nerviós central, així com en la modulació de la neurotransmissió. Característicament, la majoria de les accions descrites dels astròcits sobre la fisiologia i la patologia neuronal són mitjançades per secreció vesicular. En el aquest treball s’han identificat les molècules implicades en l’exocitosi de cèl•lules astroglials. Malgrat que alguns components són comuns amb les neurones, altres com sintaxina 4, VAMP3 i SNAP23 s’expressen de forma específica en les cèl•lules astroglials. Tractaments activadors o de maduració diferencialment regulen l’expressió de diferents isoformes de proteïnes exocítiques en cèl•lules glials in vitro. Així, l’activació amb citocines proinflamatòries augmenta l’expressió d’algunes SNAREs i els seus reguladors en glia, com sintaxina4 i munc18b. La correlació entre els nivells d’expressió d’aquestes proteïnes exocítiques i l’augment de la secreció de mediadors d’activació i inflamació suggereix un important paper d’aquestes molècules en la secreció de cèl•lules activades. Amb l’objectiu d’estudiar la secreció regulada per calci en astròcits madurs s’ha obtingut un fenotip madur glial in vitro mitjançant l’activació de la via del AMPc. L’anàlisi global amb "gene set enrichment analysis" del transcriptoma astrocitari ha demostrat que l’increment en els nivells intracel•lulars d’AMPc reprimeix la immaduresa i activació dels astròcits i promou la seva maduració. Aquesta maduració dependent de la via del AMPc augmenta l’expressió de proteïnes exocítiques, com per exemple VAMP2, així com la via de secreció regulada per calci dels pèptids ANP i SgII. Finalment, mitjançant assajos de pèrdua de funció, es demostra un paper d’aquestes proteïnes en la secreció de pèptids glials. Aquests resultats suggereixen que diferents molècules d’exocitosi mitjancen diferents processos de secreció glials. Per altra banda, en aquesta tesi s’ha identificat un nou component de la via de secreció astroglial, tant in vitro com in vivo, la SgIII. En cèl•lules neuroendocrines SgIII actua com un receptor de direccionament a grànuls secretors. En cèl•lules astroglials SgIII presenta una forma molecular i una dinàmica de secreció diferencial a cèl•lules neuroendocrines. A més, hem demostrat una notable sobreexpressió d’aquesta proteïna en astròcits reactius en lesions traumàtiques, la qual cosa suggereix una participació de SgIII en els mecanismes de protecció o dany cerebral en lesions del sistema nerviós central. / In recent years, several studies have demonstrated that astrocytes influences neuronal development, function and plasticity through vesicular transmitter release. However, secretory pathways and the involved molecular mechanisms in astroglial cells are poorly known. In this study, we showed that a variety of SNARE and Munc18 isoforms were expressed by cultured astrocytes, with syntaxin-4, Munc18c, SNAP-23 and VAMP-3 being the most abundant variants. Exocytotic protein expression was differentially regulated by activating and differentiating agents. Specifically, proteins controlling Ca2+-dependent secretion in neuroendocrine cells were up-regulated after long-term 8Br-cAMP administration in astrocytes, but not by proinflammatory cytokines. We also analyzed the global transcriptome of cultured astroglial cells incubated with activators of cAMP pathways. cAMP analogs strongly upregulated genes involved in typical functions of mature astrocytes, whereas they downregulated a considerable number of proliferating and immaturity-related transcripts. Gene Set Enrichment Analysis and evaluation in situ of gene expression in astrocytes in different states showed that cAMP signaling conferred a mature and in vivo–like transcriptional profile to cultured astrocytes. Moreover, 8Br-cAMP treatment greatly increased the cellular content of exocytotic proteins such as VAMP-2 and stimulated Ca2+-dependent secretion of secretogranin-2 and ANP. Regulation of both exocytotic protein expression and Ca2+-dependent peptide secretion in astrocytes by differentiating and activating agents suggested that glial secretory pathways were adjusted in different physiological states. In this thesis, we showed the expression, transcriptional regulation, trafficking and release of the secretory pathway component SgIII in astroglial cells. In endocrine cells, SgIII is a key sorting receptor for peptide hormones while astrocytes produced and released a non-processed form. Moreover, SgIII expression was specifically upregulated in reactive astrocytes after perforating brain injury. These results showed that SgIII is a reliable component of the astrocyte secretory pathway and suggest important roles for glial SgIII in the glia–neuron communication.