Los puntos cuánticos son nanopartículas semiconductoras que exhiben unas propiedades ópticas y electrónicas dependientes del tamaño. Debido a sus dimensiones en el rango de 1-100 nm, la relación superficie-volumen de estos materiales llega a ser enorme y sus estados electrónicos se vuelven discretos. Además, por el hecho de que el tamaño del nanocristal es más pequeño que el de un excitón, las cargas están espacialmente confinadas y esto eleva sus energías en lo que se conoce como confinamiento cuántico. Así, las propiedades optoelectrónicas están atribuidas a este efecto de confinamiento y esto permite calibrar la emisión. Los puntos cuánticos tienen una fluorescencia muy estable en comparación con los fluoróforos orgánicos que la pierden en cuestión de minutos. Además, y contrariamente a los fluoróforosogánicos, estos nanocristales tienen una amplia excitación y una emisión estrecha lo que los hace extremadamente aplicables para visualización multicolor. Calibrar la longitud de onda de emisión de los puntos cuánticos es simplemente una cuestión de calibrar su tamaño. Por todo estas razones, explicadas en el capítulo 1, los puntos cuánticos han desplazado a los fluoróforos convencionales como método para visualización en los últimos 5 años. Estos puntos cuánticos son tóxicos y necesitan ser encapsulados para prevenir envenenamiento por metales pesados cuando son usados en bioaplicaciones. Un trabajo previo en nuestro laboratorio, detallado en el capítulo 2, encontró un método de síntesis capa-a-capa para obtener nanocebollas, que consisten en varias capas de sílica rellenas con diferentes puntos cuánticos. Esta disposición es muy útil para tener diferentes colores, como si fuesen viales diferentes, confinados en unos pocos nanómetros. La matriz de sílica juega un papel importante para hacer a los puntos cuánticos solubles en agua y proteger su fotoluminiscencia del efecto de apagado, al menos en el rago de pH útil para las aplicaciones viológicas. Cuanto mayor es el grosor de la capa de sílica o mayor el número de capas, mayor es la protección ofrecida a los puntos cuánticos del interior. Basándonos en este principio, mostramos que estas nanocebollas, que nosotros llamamos nanocebollasmulticódigo (Quantum-onion-multicode, QOM), pueden ser usadas como sensor de pH, como se detalla en el capítulo 3. Se ha demostrado que la relación entre la intensidad de fotoluminiscencia entre dos poblaciones de puntos cuánticos se corresponde con el valor de pH del medio, haciendo que nuestro sistema confiera un carácter potencialmente aplicable como sensor ratiométrico de pH. Además, el desarrollo de puntos cuánticos dentro de espferas de sílica como sondas biomoleculares puede dar nuevas percepciones para paliar algunas limitaciones que tienen los puntos cuánticos por sí mismos de forma individual como marcadores biológicos, por ejemplo: mejor fotostabilidad si están dentro de la matriz, mayor superficie disponible para reacciones químicas, mejor capacidad de unión de las esferas, menor toxicidad, y mejor manipulación. Sin embargo, la mayoría de las nanopartículas orgánicas requieren de una funcionalización química con silano, tiol, amino, carboxilo u otros grupos con el fin de otorgarles propiedades aplicables para ser suministradas a células, como son: buena compatibilidad, gran afinidad entre el transportador y la carga, marcaje celular, estabilidad y mayor tiempo de circulación. En el pasado, los hidróxidos de doble capa, también conocidos como materiales tipo hidrotalcita o arcillas aniónicas, han sido la excepción a esta regla. Estos materiales consisten en capas de nanoláminas cargadas positivamente en estructura tipo brucita neutralizada por aniones en el espacio interlaminar. Desde un punto de vista médico, se han publicado muchos cambios interesantes con estos materiales para albergar fármacos y biomoléculas ya sea por intercambio aniónico o por proceso de delaminación-relapilamiento. Este tipo de material has sido usado para transportar puntos cuánticos solubles en agua hechos de teulro de cadmio (capítulo 4) o nanopalos (capítulo 5). Por una parte, las hidrotalcitas intercalan a los puntos cuánticos de teluro de cadmio muy rápido y no se necesitan delaminarse previamente. El material híbrido muestra una alta estabilidad en medio fisiológico a diferentes pH, convirtiéndolo en una herramienta de visualización aplicable para el diagnóstico en nanomedicina. Notoriamente, las propiedades ópticas de los puntos cuánticos sufrieron un salto hacia el azul, atribuido a diferentes factores, como se detalla en el capítulo 4. Sin embargo, este efecto es reversible tras la disolución de la transportador sólido, la hidrotalcita. Con lo que podemos decir que los puntos cuánticos de teluro de cadmio muestran un efecto de memoria óptica. Estas transiciones ópticas se detienen cuando rodeamos los puntos cuánticos de una capa de sílica, preparando puntos cuánticos@silica/hidrotalcita, siendo la capa de sílica una barrera entre las nanopartículas y las arcillas. Esta combinación conduce a una barrera eficiente para los procesos de liberación de puntos cuánticos al medio biológico, tratándose por tanto de un andamiaje inorgánico nanoestructurado que evita toxicidad a la vez que permite una visualización múltiple y un diagnóstico simultáneo en sistemas terapéuticos avanzados. Por otro lado, se prepararon hidrotalcitas cargadas con partículas elongadas luminiscentes de CdSe@CdS, siendo la delaminación el mejor proceso para la carga debido al mayor tamaño de las nanopartículas, como se detalla en el capítulo 5. Este material híbrido resultó tener más luminiscencia y mayor tiempo de vida que cuando estaba cargado con puntos cuánticos, lo que supone una ventaja y un requisito para observaciones in vitro de tiempos prolongados. En consecuencia, se requieren una menor cantidad de nanopartículas y una menor excitación, lo que implica una menor toxicidad o daño a las células. Con estos resultados remarcamos que la combinación de dos campos como son el óptico y el de los nanomateriales, puede crear herramientos potentes para bioaplicaciones. En el capítulo 6, se usan cultivos celulares incubados con los materiales híbridos detallados en los capítulos 4 y 5 para demostrar la utilidad de esta clase de materiales como agentes de visualización. Observamos una dependencia respecto al diámetro de las nanopartículas y la calidad de los resultados, pero se necesitan más pruebas para esclarecer si esta correlación es verdadera o otros factores como la estructura del material transportador están implicados. Finalmente, en el capítulo 7, detallo como, combinando la especificidad de interacciones biomoleculares y la capacidad de calibrado de las propiedades ópticas de puntos cuánticos y fluoróforos, hemos desarrollado por primera vez un sistema in vitro para detectar fibrosis quística tanto de forma cualitativa (1nanoSi) como cuantitativa (2nanoSi). La novedad de nuestro sistema es el uso de procesos de transferencia de energía (FRET), cuyo mecanismo describe como se produce transferencia de energía de un dador (inicialmente en su estado electrónico excitado) y un aceptor a través de un emparejamiento dipolo-dipolo no radiativo. Para que se dé este proceso debe de haber un buen solapamiento entre la emisión del dador y la absorción del aceptor. Además, es un proceso muy dependiente y limitado por la distancia. Hemos anclado un péptido corto previamente marcado con un derivado de rodamina llamado TAMRA a la superficie de las nanoesferas rellenas de un tipo (1nanoSi, rellenas con CdSe540) o dos tipos (2nanoSi, rellanas con CdSe540 y CdSe660, siendo los números las longitudes de emisión) puntos cuánticos. Estas esferas se funcionalizaron con grupos amino para unir los péptidos marcados con TAMRA. Las secuencias de los péptidos diferían en un solo aminoácido: uno tiene prolina y el otro arginina en su lugar. La gente con fibrosis quística tiene mala digestión de péptidos porque los enzimas proteolíticos tienen problemas para llegar al duodeno, que es donde estos enzimas son activos. Elegimos la tripsina como enzima proteolítico por su especificidad de corte, ya que solo corta tras lisina y arginina pero no si estos van seguidos por prolina. Por tanto, en condiciones sanas, la secuencia peptídica sufrirá corte y no se observará FRET en el péptido que no tiene prolina. Al observar los espectros de emisión de los sistemas 1nanoSi vimso que había FRET debido a un buen solapamiento entre la emisión de los puntos cuánticos verdes (CdSe540) y la absorción del fluoróforo TAMRA. Cuando se produce el corte del péptido por la acción de la tripsina, se rompe este proceso de transferencia de energía y la relación entre la fluorescencia entre el dador y el aceptor cambia: el pico del TAMRA decrece mientras que el de los puntos cuánticos verdes aumenta durante la digestión. Pero estos es solo cualitativo, el sistema necesita un tercer componente que no se vea afectado por el FRET para ser cuantitativo. Decidimos usar puntos cuánticos rojos (CdSe660). Ahora nuestro sistema tenia dos capas (2nanoSi), la más interna rellena con puntos cuánticos rojos y la más externa con puntos cuánticos verdes. Tras observar los espectros de emisión vimos que solo cambiaban los picos de los puntos cuánticos verdes y fluoróforo, en cambio el pico de los puntos cuánticos rojos no variaba, lo que significa que solo se producía FRET entre los CdSe540 y el TAMRA. A pesar del pequeño solapamiento entre la emisión del TAMRA y la absorción de los puntos cuánticos rojos, la distancia entre ellos es demasiado grande y no se produce el FRET. Observamos diferentes comportamientos dependiendo de la concentración de tripsina. Usamos la relación entre la intensidad de fluorescencia entre las dos poblaciones de puntos cuánticos como sensor ratiométrico. Dibujando los valores de esta relación de intensidades a través del tiempo obtuvimos las cinéticas de la digestión para diferentes concentraciones de tripsina. A mayor concentración, más rápida era la digestión. La recta patrón resultante de dibujar los valores experimentales de la relación de intensidades I540/I660 para un tiempo de digestión de 10 minutos demostró una buena linearidad que permite determinar la concetración de enzima a niveles clínicamente relevantes para poder diagnosticar la fibrosis quística. En global, estos resultados nos permiten proponer el sistema 2nanoSi como un sensor ratiométrico de fluorescencia y herramienta para calcular la concentración de tripsina, siendo además un método para detectar la fibrosis quítica y otras enfermedades relacionadas con el páncreas fácil de usar, rápido y no invasivo.

El càncer de pròstata és un tipus de càncer de creixement lent, estructura heterogènia, etiologia desconeguda diagnosticat generalment en homes d'edat avançada (>50 anys). Excloent el càncer de pell no melanocític, és el tumor més freqüent (19,6%) en els homes a Catalunya. De manera natural evoluciona cap a la independència hormonal, tot i que es creu que aquesta transició és accelerada pel tractament amb antiandrògens. La interacció entre estroma i epiteli és d'una gran importància per a l'evolució del tumor.El concepte de cèl·lula mare cancerosa fa referència a una suposada població cel·lular tumoral, amb característiques anàlogues a les de les cèl·lules mare normals, responsable de la generació i manteniment tumorals. La side population (SP), és un conjunt de cèl·lules discriminat per citometria de flux amb capacitat per bombejar certes drogues, xenobiòtics, hormones i altres compostos, que s'ha vist que està enriquida en cèl·lules mare en alguns sistemes.En aquest treball es va proposar de trobar cèl·lules mare canceroses bàsicament en dos models de càncer de pròstata diferents: les línies cel·lulars LNCaP i PC-3 i el model animal PAC-120 (xenotrasplantament d'adenocarcinoma hormonodependent que recapitula de manera fiable el càncer de pròstata). Per tal d'assolir el primer objectiu d'identificar-les, es va proposar l'assaig de side population, per tal i com s'ha demostrat la seva validesa per aïllar poblacions enriquides en cèl·lules mare i és un assaig que dóna informació funcional sobre les cèl·lules i en manté la seva viabilitat. A més, aquesta tècnica permetia també assolir el segon objectiu i parcialment el tercer, és a dir aïllarles i caracteritzar-les.Partint de la hipòtesi nul·la que hi ha cèl·lules amb característiques de cèl·lules mare al càncer de pròstata, els objectius d'aquesta tesi per punts han estat:1. Identificar i aïllar cèl·lules de la side population tant als tumors del PAC-120 com a les línies cel·lulars LNCaP i PC-3.2. Caracteritzar els perfils gènics de les cèl·lules de la side population aïllades.3. Comprovar la seva naturalesa progenitora mitjançant assaigs de diferenciació in Vitro o de tumorigènesi in vivo.4. Analitzar l'existència de cèl·lules tumorals disseminades al moll d'os del model PAC-120 i estudiar la seva possible naturalesa progenitora.Els resultats d'aquest treball demostren que el tumor del model PAC-120, format per una barreja d'epiteli humà i estroma murí, conté cèl·lules de la side population i que els cultius del tumor PAC-120 també contenen cèl·lules de la side population. La separació i anàlisi clonal de les cèl·lules de la side population dels cultius revelen que aquestes tenen una capacitat variable de donar lloc a cèl·lules de la side population. A més, l'estudi dels perfils gènics d'aquestes cèl·lules, la seva expressió proteica (immunofenotip Cd45- Sca-1+ Cd81+), la seva adherència al plàstic, la seva morfologia fibroblastoide, la seva gran capacitat proliferativa i la seva capacitat de diferenciació revelen que són cèl·lules multipotents estromals. Per tant, el tumor PAC-120 conté cèl·lules multipotents estromals que poden ser aïllades mitjançant l'assaig de la side population. Així mateix, el fenotip SP d'aquestes cèl·lules està associat amb el seu estat de diferenciació, ja que la seva diferenciació en comporta la pèrdua.D'altra banda, s'ha demostrat que les cèl·lules multipotents estromals aïllades secreten TGF-beta de manera autocrina i tenen la via del TGF-beta activa. El TGF-beta manté la proliferació i inhibeix la diferenciació de les cèl·lules multipotents estromals obtingudes del tumor.Quant a les línies, en aquest treball s'ha demostrat que tant LNCaP i PC-3 contenen cèl·lules de la side population, i presenten RNA i proteïna del transportador ABCG2. El promotor d'ABCG2 està parcialment desmetilat a la línia cel·lular LNCaP i molt metilat a PC-3. L'addició del composta bloquejador de la metilació de novo 5-aza afavoreix la desmetilació del promotor d'ABCG2, la transcripció del gen, la traducció de la proteïna i l'augment de la side population. A més, el sèrum i l'estradiol regulen a l'alça la transcripció d'ABCG2 i, en el cas del sèrum, també de la side population a la línia cel·lular LNCaP. / Cancer Stem Cells are a distinct cellular population that is believed to be responsible for tumor initiation and maintenance. Recent data suggest that solid tumors also contain another type of stem cells, the mesenchymal stem cells or multipotent mesenchymal stromal cells (MSC), which contribute to the formation of tumor-associated stroma.The Hoechst 33342 efflux assay has proved useful to identify a rare cellular fraction, named Side Population (SP), enriched in cells with stem-like properties. Using this assay, we identified SP in a prostate cancer xenograft containing human prostate cancer cells and mouse stromal cells. The SP isolation, subculture and sequential sorting allowed the generation of single-cell-derived clones of murine origin that were recognized as MSC by their morphology, plastic adherence, proliferative potential, adipogenic and osteogenic differentiation ability and immunophenotype (CD45-, CD81+ and Sca-1+). We also demonstrated that SP clonal cells secrete transforming growth factor β1 (TGF-β1) and that their inhibition reduces proliferation and accelerates differentiation.These results reveal the existence of SP in the stroma of a cancer xenograft, and provide evidence supporting their MSC nature and the role of TGF-β1 in maintaining their proliferation and undifferentiated status. Our data also reveal the usefulness of the SP assay to identify and isolate MSC cells from carcinomas.Concerning to cell lines, previous studies reported the presence of SP in prostate cancer tissues but not in the most widely used prostate cancer cell lines LNCaP and PC3. Using the SP flow cytometric assay, we demonstrate that SP cells are present in LNCaP and PC3 cells and that their abundance change with the serum concentration and steroid ablation. In addition, RT-PCR analysis evidences that ABCG2 is expressed in both cell lines and that its expression significantly increases when LNCaP cells are treated with estradiol (E2) and the demethylation agent 5-aza-2'-deoxycytidine (5-aza-dC). Finally, our results also show that the ABCG2 gene expression relates negatively with the number of methylated CpG islands in its promoter and positively with the abundance of SP in LNCaP cells. In conclusion, these results demonstrate that prostate cancer cell lines LNCaP and PC3 do contain SP cells and express the ABCG2 transporter, and suggest that the changes in the SP abundance in these cell lines most likely reflect the modulation of the transporter activity by the environment than an enrichment in cancer stem cells.

This is a compound work comprising two independent studies.1. Characterization of gamma-delta-T cell subsets in organ transplantationgamma-delta-T cells are innate-type lymphocytes that preferentially act as regulators of local effector immune responses. Recent reports found an altered distribution of the two main subpopulations of blood gamma-delta-T cells (V-delta-1 and V-delta-2) in operationally tolerant liver transplant recipients. Based on this, gamma-delta-T cells subset quantification was proposed as a biomarker of immunologic risk in liver transplantation. The specific characteristics of gamma-delta-T cell subsets in transplantation remain however unknown. We have investigated here the phenotype, repertoire and functional properties of gamma-delta-T cell subsets in a large population of allograft recipients. Our results indicate that alterations in the gamma-delta-T cell compartment are not restricted to tolerant liver recipients. In fact, most immunosuppressed liver and kidney recipients also display an enlarged peripheral blood gamma-delta-T cell pool mainly resulting from an expansion of V-delta-1 T cells exhibiting an oligoclonal repertoire and different phenotypic and cytokine production traits than V-delta-2 T cells. We propose that persistent viral infections are likely to contribute to these alterations. Our data provide novel insight in the biology of gamma-delta-T cells and a rationale for exploring these lymphocytes in more depth into the pathogenesis of viral infections in transplantation.2. Comparative Transcriptional and Phenotypic Peripheral Blood Analysis of Kidney Recipients under Cyclosporin A or Sirolimus Monotherapy Due to its low level of nephrotoxicity and capacity to harness tolerogenic pathways, sirolimus (SRL) has been proposed as an alternative to calcineurin inhibitors in organ transplantation. However, the exact mechanisms underlying its unique immunosuppressive profile in humans are still not well understood. In the current study, we aimed to depict the in vivo effects of SRL in comparison with cyclosporine A (CSA) by employing gene expression profiling and multiparameter flow cytometry on blood cells collected from stable kidney recipients under monotherapy with either SRL or CSA. In addition, the overall effect of these drugs on immunoregulatory pathways was assessed by measuring a transcriptional signature characteristic of operationally tolerant kidney recipients. Samples from SRL recipients displayed an increased frequency of effector memory T cells and were enriched in NFkB-related pro-inflammatory expression pathways and in monocyte and NK cell lineage-specific transcripts. Furthermore neither SRL nor CSA induced a gene expression profile comparable with that of tolerant kidney recipients. In conclusion, we show here that the overall pattern of SRL effect in vivo is dominated by innate immune cells and NFkB-related pro-inflammatory events. These data provide novel insights on the complex effects of SLR on the immune system in clinical transplantation. / "Biomarcadors fenotípics i transcripcionalsen el transplantament d'òrgans"TEXT: 1. Estudi de les cèl·lules T gamma-delta A l'al·lotransplantament d'òrgans1.1 Objectius- Investigació detallada de la freqüència, fenotip, repertori del TCR i característiques funcionals de les poblacions Vdelta1 i Vdelta2 en sang perifèrica en trasplantats. - Determinar si l'òrgan trasplantat, la teràpia immunosupressora i la presència d'infeccions víriques influeixen en la distribució i propietats de les subpoblacions gamma-delta.- Avaluar el valor clínic de la quantificació de les cèl·lules T gamma-delta com a biomarcador diagnòstic de trasplantats tolerants operacionals de fetge. 1.2 ResultatsEs van quantificar les poblacions de gamma-delta totals, Vdelta1, Vdelta2 i ràtio Vdelta1/Vdelta2 en 201 trasplantats de fetge estables (STA-Liver), 29 tolerants operacionals trasplantats de fetge (TOL), 50 trasplantats estables de ronyó (STA-Kidney), 50 malalts amb insuficiència hepàtica terminal (ESLD) i 34 controls sans (CONT). Vem observar un increment de la població gamma-delta total en tots els grups de pacients trasplantats respecte CONT, que venia determinat per un increment de la població Vdelta1, més significatiu en el cas dels TOL, i una disminució de Vdelta2. Vem demostrar que les freqüències del fenotip són estables en el temps determinant el percentatge d'expressió de Vdelta1 i Vdelta2 dues vegades amb 14 mesos de diferència.El fenotipatge realitzat a les poblacions Vdelta1 i Vdelta2 en 19 pacients STA-Liver, va mostrar que aquestes subpoblacions expressen marcadors cel·lulars de superfície, intracel·lulars i funcionals diferents entre si. Aquests marcadors, però no serviren per diferenciar una cohort de 9 TOL i 10 STA-Liver. Vàrem assajar la utilitat diagnòstica dels percentatges de Vdelta1 i Vdelta2 per diferenciar TOL i STA-Liver utilitzant una corba ROC. Els resultats no varen ser positius.Vam correlacionar la freqüència d'infeccions víriques persistents amb la distribució de les subpoblacions T gamma-delta. CMV i HCV, provocaven una alteració independent entre si i significativa en el ràtio Vdelta1/Vdelta2. Vam estudiar, finalment la diversitat clonal del TCR de la població Vdelta1. Es va clonar i seqüenciar la CDR3 del TCR Vdelta1. Els TOL mostren una tendència, estadísticament significativa, cap a un repertori restringit del TCR Vdelta1. Vam determinar si aquestes seqüències de nucleòtids es traduïen en grups d'aminoàcids compartits en la CDR3 de V&#61540;1 però el resultat fou negatiu.1.3. Conclusions- La majoria dels receptors d'un transplantament mostren un increment en sang perifèrica de la població de cèl·lules T gamma-delta.- La distribució alterada en sang perifèrica de les subpoblacions T gamma-delta és estable en un període de temps establert.- Les infeccions per CMV i HCV afecten la freqüència relativa de les subpoblacions gamma-delta i el ràtio Vdelta1/Vdelta2 en sang perifèrica en pacients trasplantats de fetge.- Les cèl·lules T Vdelta1 mostren ser fenotípica i funcionalment diferents de les Vdelta2.- El repertori de CDR3 del receptor de les cèl·lules T Vdelta1 està restringit en receptors de fetge tolerants operacionals.- Ni la quantificació de subpoblacions T gamma-delta ni la seva caracterització fenotípica permeten discriminar de forma acurada entre TOL i els STA-Liver.2. Anàlisi fenotípic i transcripcional de receptors d'un transplantament de ronyó en monoteràpia amb CsA o sirolimus2.1 Objectius- Establir els efectes in vivo de sirolimus i CsA en sang perifèrica utilitzant tècniques de cribatge d'alt rendiment, per generar un perfil fenotípic i transcripcional de les dues cohorts de pacients.- Determinar l'expressió d'una sèrie de biomarcadors associats a tolerància en aquests pacients, a partir d'un perfil generat anteriorment en tolerants operacionals renals.2.2 ResultatsEs varen determinar les diferències fenotípiques de les dues cohorts i vàrem determinar que els pacients tractats amb sirolimus (SRL) mostraven un increment en la població CD4 de memòria efectora (CD45RA-CCR7-) respecte els pacients CSA. El grup SRL també presentava un increment en l'expressió de cèl·lules Tregs (CD4+CD25highFoxp3+) comparat amb CSA.Vam fer estudis de microarray d'Affymetrix a partir de sang perifèrica. Vam fer un anàlisi comparatiu de dades utilitzant SAM (FDR<5%). El resultat d'aquest anàlisi ens va permetre identificar un total de 486 gens upregulated i 586 gens downregulated en el grup SRL respecte CSA.Per interpretar el conjunt de gens diferentment expressats vam utilitzar el mètode GSEA, que ens va permetre identificar un enriquiment en el grup SRL de vies de senyalització relacionades amb mTOR i vies pro-inflamatòries comparat tant amb CSA com amb el grup d'individus sans.Utilitzant Haematolgy Expression Atlas vam identificar una representació significativa de trànscrits específics per monòcits i cèl·lules NK en SRL, i per cèl·lules T CD4+ i limfòcits B en el grup CSA. El software IPA-Tox va identificar NF&#954;B com la via de senyalització més representativa respecte els gens estudiats.Per últim vàrem determinar la prevalença de biomarcadors relacionats amb tolerància operacional en pacients trasplantats de ronyót. Dels 37 pacients estudiats només 1 SRL i 3 CSA varen ser predits com a potencialment tolerants.2.3 Conclusions- Els receptors estables d'un transplantament de fetge en monoteràpia amb sirolimus presenten un increment significatiu de la població TregFoxp3+ respecte tractament amb CsA.¬- El perfil d'expressió en sang perifèrica del pacients tractats amb sirolimus mostra un enriquiment en vies metabòliques pro-inflamatòries i gens involucrats ambla senyalització mTOR.-IPA-Tox identifica, entre les respostes farmacològiques prèviament definides, a NF&#954;B com la via de senyalització més toxicològica a partir dels gens diferentment expressats. - L'aplicació d'una signature de tolerància operacional prèviament definida no és capaç d'identificar diferències entre els pacients tractats amb CsA i els que reben sirolimus.

Existeixen moltes evidències que indiquen que les diferents funcions descrites de p21(Cip1) es deuen, en certa part, a la seva localització intracel·lular. Mentre que la p21(Cip1) nuclear inhibeix la proliferació cel·lular, la p21(Cip1) citoplasmàtica és capaç de regular la supervivència i la mobilitat cel·lular. El fet que les funcions de p21(Cip1) en cada un dels compartiments cel·lulars tinguin papers oposats fa que sigui d'un gran interès l'estudi dels canvis de localització de p21(Cip1) i els mecanismes que regulen aquesta translocació, així com les possibles vies que p21(Cip1) pugui fer servir per a localitzar-se en els diferents compartiments cel·lulars.En aquesta tesi s'han realitzat dos estudis diferenciats, però amb un objectiu comú ja que tots dos es centren en l'anàlisi dels mecanismes reguladors de la localització cel·lular de p21(Cip1). En la primera part d'aquesta tesi, observem la importància de la fosforilació de p21(Cip1) per part de la proteïna cinasa C (PKC). Aquesta fosforilació té lloc en el residu Ser153, molt proper a la senyal de localització nuclear (NLS) de la p21(Cip1) i es capaç de regular la localització cel·lular de p21(Cip1). Aquests resultats, juntament amb altres treballs, demostren que la fosforilació de p21(Cip1) afavoreix la seva localització en el citoplasma. Diferents aproximacions experimentals ens van permetre observar com aquesta fosforilació inhibeix la unió entre p21(Cip1) i CaM. D'aquest primer treball se'n deriva un model de regulació de la localització cel·lular de p21(Cip1) en el qual la unió a CaM i la fosforilació per PKC tenen papers oposats. D'una banda, la unió de p21(Cip1) a CaM inhibeix la seva fosforilació per part de PKC i afavoreix la localització de p21(Cip1) en el nucli. D'altra banda, la fosforilació de p21(Cip1) en el residu Ser153 indueix una localització citoplasmàtica de p21(Cip1). Treballs posteriors ens van permetre observar com la sortida de p21(Cip1) del nucli cap al citoplasma també està regulada. Després del dany al DNA, els nivells cel·lulars de p21(Cip1) incrementen, especialment en el nucli, per tal d'assegurar una aturada del cicle cel·lular. Observem com en resposta al dany al DNA, p21(Cip1) s'acumula no només en el nucleoplasma de les cèl·lules sinó que també s'acumula en el nuclèol. En les cèl·lules danyades els components nucleolars es troben desorganitzats i el nuclèol perd els contactes amb l'embolcall nuclear i presenta unes estructures esfèriques en el seu interior. La p21(Cip1) present en les estructures esfèriques del nuclèol està en un equilibri dinàmic amb la p21(Cip1) del nucleoplasma i la presència de p21(Cip1) en aquestes estructures correlaciona amb una inhibició de l'export p21(Cip1) cap al citoplasma. Aquests resultats donen suport a l'existència d'una via d'export de proteïnes nuclears a través del nuclèol, semblant a la que intervé en l'export de ribosomes, la qual es veuria afectada amb la desestructuració dels nuclèols en resposta al dany cel·lular. A més, amb els resultats obtinguts no descartem la possibilitat que p21(Cip1) pugui ser modificada en el nuclèol ja que en resposta al dany al DNA també s'hi localitzen altres proteïnes implicades en diferents vies de modificació post-traduccional. Així doncs, l'acumulació nuclear de p21(Cip1) en resposta al dany al DNA no es deu únicament a un increment de la seva transcripció sinó que aquesta acumulació també es deguda a la inhibició de la sortida de p21(Cip1) cap al citoplasma a través del nuclèol.En conclusió, tant l'entrada com la sortida de la p21(Cip1) del nucli és un mecanisme altament regulat que farà que la localització de p21(Cip1) pugui variar en diferents situacions fisiològiques de la cèl·lula. Aquest fet és de gran importància per al correcte funcionament cel·lular ja que com hem descrit anteriorment, p21(Cip1) és una proteïna amb funcions oposades depenent de la seva localització intracel·lular: oncogènica al citoplasma i supressora de tumors al nucli. / It is well known that p21(Cip1) is a protein with a dual function in oncogenesis depending mainly on its intracellular localization: tumor suppressor in the nucleus and oncogenic in the cytoplasm. The importance of p21(Cip1) cellular localization indicates that it has to be precisely regulated.On one side we observed the importance of p21(Cip1) phosphorylation by PKC inducing its cytoplasmic localization. PKC phosphorylates p21(Cip1) at Ser 153 and when phosphorylated, p21(Cip1) can not bind to CaM. From this study we conclude that CaM and PKC have an opposite role in the regulation of p21(Cip1) localization: CaM binding to p21(Cip1) prevents its phosphorylation by PKC at Ser153 and consequently allows its nuclear localization; while when phosphorylated at Ser153, p21(Cip1) is located at the cytoplasm.On the other side the export of p21(Cip1) from the nucleus to the cytoplasm is also regulated. After DNA damage, p21(Cip1) increases and accumulates in the nucleus to ensure cell cycle arrest. We observed that after DNA damage p21(Cip1) accumulates not only in the nucleoplasm but also in the disrupted nucleoli. In damaged cells the nucleolar components are disorganized and nucleoli have lost their contacts with the nuclear envelope and appear with spherical structures inside. The nucleolar p21(Cip1) forms a dynamic equilibrium between the nucleolus and the nucleoplasm and correlates with the inhibition of p21(Cip1) nuclear export. This result proves the existence of a nucleolar export route to the cytoplasm for p21(Cip1) similar to the one described for the ribosome export. Moreover, the results obtained suggested that p21(Cip1) could be modified in the nucleolus in response to DNA damage as different proteins involved in post-translation modifications also localize in the nucleoli after the damage. Thus, after DNA damage, p21(Cip1) accumulates in the nucleus due to an increase in its transcription and due to an inhibition of its export to the cytoplasm.All this results together indicate the importance of p21(Cip1) localization depending on the cellular context and that its localization is precisely regulated by different pathways.

Saccharomyces cerevisiae posseeix dues glutatió transferases (GST) anomenades Gtt1i Gtt2, amb capacitat de conjugar una molècula de glutatió amb el substrat estàndarCDNB. Aquests dos enzims no són clasificables dins de les classes convencionalsdescrites en base a l'estructura de les GST d'eucariotes superiors, encara que guardencerta similitud estructural amb els membres de la classe Zeta. En aquesta memòria esdescriu la caracterització de tres GST de classe Omega en S. cerevisiae anomenadesGto1, Gto2 i Gto3, codificades respectivament per les ORFs YGR154c, YKR076w iYMR251w. Els enzims d'aquesta classe no tenen activitat sobre CDNB, però són activescom tiol oxidoreductases i posseïxen activitat dehidroascorbat reductasa i dimetilarsenatreductasa. La primera d'elles, Gto1, és peroxisomal i posseïx un senyal de localitzacióde tipus PTS1 en la regió C-terminal. Aquest senyal és reconeguda pel transportadorperoxisomal Pex5, que facilita la seva internalizació en aquest organul. D´altre banda,Gto2 i Gto3 tenen localització citoplàsmica. Els gens GTO de S. cerevisiae s'induïxenper estrès oxidativu però amb patrons distints per als tres gens. La dependènciad'aquesta expressió dels factors de trascripció Yap1, Msn2 i Msn4 es relaciona amb lapresència de seqüències YRE i STRE en els promotors dels gens GTO. El mutant Dgto1és sensible a l'agent oxidant diamida i té una concentració intracel· lular de glutatiómenor que la soca silvestre. Aquest fenotip es relaciona amb que el triple mutant Dgtt2Dgtt1 Dgto1 sigui sensible al cadmi, indicant que les tres GST Gtt1, Gtt2 i Gto1intervenen en la detoxificació d'aquest metall. Altre fenotip rellevant és la dificultat delmutant Dgto1 per a créixer en medis de cultiu amb àcid oleic com única font de carboni,indicant que les funcions peroxisomals en el mutant estan afectades. L'absència deGTO1 en S. cerevisiae causa així mateix el descens en l'expressió de gens involucratsen la via de síntesi de cisteïna i metionina. Com a conseqüència, el mutant Dgto1 creixamb dificultat en absència de treonina, serina o lisina. La manca de GTO1 en S.cerevisiae impedeix que utilitzi eficientment la cisteïna o la cistationina com úniquesfonts de sofre, manifestant defectes en la transulfuració, procés que permet la síntesi demetionina a partir de cisteïna. Això suggereix que Gto1 podria estar regulant l'activitatcistationina b-liasa de Str3 mitjançant la seva activitat tiol oxidoreductasa, atès que Str3també és peroxisomal. Atès que la cisteína 387 de Str3 és important per a la sevaactivitat biològica i està conservada en les cistationina b-liasas d'altres espècies defongs, aquest residu podria ser diana de Gto1 per a la regulació de l'estat redox de laproteïna Str3RESÚMENSaccharomyces cerevisiae posee dos glutatión transferasas (GST) denominadas Gtt1 yGtt2 con capacidad de conjugar una molécula de glutatión con el sustrato estándarCDNB. Estas dos enzimas no son clasificables dentro de las clases convencionalesdescritas con base en la estructura de las GST de eucariotas superiores, aunqueguardan cierta similitud estructural con las de clase Zeta. En esta memoria se describela caracterización de tres GST de clase Omega en S. cerevisiae denominadas Gto1,Gto2 y Gto3, codificadas por las ORF YGR154c, YKR076w y YMR251w. Las enzimasde esta clase no tienen actividad sobre CDNB, pero son activas como tioloxidoreductasa y poseen actividad dehidroascorbato reductasa y dimetilarsenatoreductasa. La primera de ellas, Gto1, es peroxisomal y posee una señal de localizaciónde tipo PTS1 en la región C-terminal. Dicha señal es reconocida por el transportadorperoxisomal Pex5, que facilita su internalización en este organelo. Por otra parte, Gto2y Gto3 tienen localización citoplásmica. Los genes GTO de S. cerevisiae se inducen porestrés oxidativo pero con patrones distintos para los tres genes. La dependencia de estaexpresión de los factores de trascripción Yap1, Msn2 y Msn4 se relaciona con lapresencia de secuencias YRE y STRE en los promotores de dichos genes. El mutanteDgto1 es sensible al agente oxidante diamida y tiene una concentración intracelular deglutatión menor que la cepa silvestre. Este fenotipo se relaciona con que el triplemutante Dgtt1 Dgtt2 Dgto1 sea sensible al cadmio, indicando que las tres GST Gtt1,Gtt2 y Gto1 intervienen en la detoxificación de este metal. Otro fenotipo relevante es ladificultad del mutante Dgto1 para crecer en medios con ácido oleico como única fuentede carbono, indicando que las funciones peroxisomales en dicho mutante estánafectadas. La ausencia de GTO1 en S. cerevisiae causa así mismo el descenso en laexpresión de varios genes involucrados en la vía de síntesis de cisteína y metionina.Como consecuencia, el mutante Dgto1 crece con dificultad en ausencia de treonina,serina o lisina. La ausencia de Gto1 en S. cerevisiae impide que utilice eficientementela cisteína o la cistationina como únicas fuentes de azufre, manifestando defectos en latransulfuración, proceso que permite la síntesis de metionina a partir de cisteína. Ellosugiere que Gto1 podría estar regulando la actividad cistationina b-liasa de Str3mediante su actividad tiol oxidoreductasa, dado que Str3 también es peroxisomal.Dado que la cisteína 387 de Str3 es importante para su actividad biológica y estáconservada en las cistationina b-liasas de otras especies de hongos, este residuopodría ser diana de Gto1 para la regulación del estado redox de la proteína Str3.SUMARYSUMMARYSaccharomyces cerevisiae contains two glutathion transferases (GST) named Gtt1 andGtt2, which are enzymes with glutathione conjugating activity with the standard substrateCDNB. These two enzymes are not classified into the conventional classes that havebeen established based on the structure of mammalian GST, although they keep certainstructural similarity with Zeta class members. In this report, we describe thecharacterization of three S. cerevisiae Omega class GST named Gto1, Gto2 and Gto3,coded by ORFs YGR154c, YKR076w and YMR251w, respectively. The enzymes ofthis class do not exhibit activity with CDNB but they are active as tiol oxidoreductases,dehydroascorbate reductases and dimetilarsonate reductases. The first of them, Gto1,is located at the peroxisome and is targeted to this organelle throught a C-terminalPTS1-type sequence. This sequence is recognized by the peroxisomal transporterPex5 that facilitates peroxisomal import. On the other hand, Gto2 and Gto3 are at thecytosol. The GTO genes of S. cerevisiae are induced by oxidative stress, although theexpression patterns are different for the three genes. The expression of GTO genesdepends on Yap1, Msn2 and Msn4 transcription factors and correlates with thepresence of YRE and STRE sequences in the promoters of these genes. The absenceof GTO1 causes a hipersensitivity to the oxidant diamide in S. cerevisiae and reducesthe intracelular concentration of glutathione, compared with the wild type stain. Thisphenotype is related to cadmium sensitivity of the Dgtt1 Dgtt2 Dgto1 triple mutant,indicating that Gtt1, Gtt2 and Gto1 participate in the response to cadmium toxicity.Another rellevant phenotype of S. cerevisiae cells lacking GTO1 is the growth defectwith oleic acid as the sole carbon source, indicating that the peroxisome funtions areaffected in the mutant. This mutant also grows defficiently in the absence of threonine,serine or lysine in the growth medium. Lack of GTO1 function also affects negativelythe expression of several genes involved in methionine and cisteine sinthesis. As aconsecuence, the Dgto1 mutant shows defective growth in a medium with cisteine orcistationine as the sole sulfur source as a consequence of defective trasulfuration, aprocess that allows methionine synthesis from cisteine. This suggests that Gto1 couldregulate the cystathionine b-lyase activity of Str3 through its thiol oxidoreductaseactivity, since Str3 is also peroxisomal. As the cysteine 387 residue of Str3 is importantfor the biological activity of this protein and is conserved in fungal species, this residuecould be a target of Gto1 for the regulation of the redox state of Str3.

Cell cycle control by trophic factors has a key role in regulation of cell proliferation in all organisms. Nutrients are one of these important factors needed by cells to reproduce, so very well regulated mechanisms must exist that connect nutrient availability to cell cycle. Hence the importance on studying how exactly nutrient-dependent signaling pathways work. Cln3, the most upstream G1 cyclin in Saccharomyces cerevisiae, is one well demonstrated common effector of multiple nutrient-dependent signaling pathways. Moreover, its role in cell cycle is crucial. So it is a good candidate to regulate cell cycle progression in response to nutrient availability. One important question is to find the protein that could directly modulate Cln3 levels in response to nutrient availability. This protein could play as a nutrient sensor and as a cell cycle regulator at the same time. In the present thesis, Pho85 is founded to be the protein that could run these two highly different tasks, because of its well-characterized properties on sensing phosphate availability and the well-known functions on modulating cell cycle as CDK. The results of the present work clearly demonstrate that when phosphate is present, Pho85 regulates Cln3 levels by increasing the stability of the cyclin through specific phosphorylations, promoting cell cycle progression. Contrary, under phosphate depletion conditions, Pho85 become inactive and Cln3 is rapidly degraded, leading to a cell cycle arrest in order to maintain cell chronological lifespan. / El control del cicle cel•lular per factors tròfics té un paper important en la proliferació cel•lular de tots els organismes. Els nutrients són uns d’aquests factors importants requerits per les cèl•lules per reproduir-se, per tant deuen existir mecanismes molt ben regulats que connecten la disponibilitat de nutrients amb el cicle cel•lular. Per això, l’estudi de com funciona la senyalització cel•lular de nutrients i com afecta a la progressió del cicle és altament rellevant. Cln3, la ciclina de G1 més primerenca a Saccharomyces cerevisiae, és un efector comú de múltiples vies de senyalització de nutrients. A més, el seu paper en el cicle cel•lular és crucial. Per tant aquesta proteïna és una bona candidata per regular la progressió del cicle cel•lular en resposta a la disponibilitat de nutrients. Una qüestió important a resoldre és trobar la proteïna que podria modular directament els nivells de Cln3 depenent de la presència de nutrients. Aquesta proteïna actuaria com a sensor de nutrients i com a reguladora del cicle cel•lular alhora. A la present tesi, es mostra a Pho85 com la proteïna que pot fer aquestes dues tasques, tant per les seves propietats ben conegudes en la detecció de fosfat, com per les seves funcions de CDK modulant el cicle cel•lular. Els resultats d’aquesta tesi demostren clarament que quan el fosfat és present, Pho85 modula els nivells de Cln3 incrementant l’estabilitat de la ciclina mitjançant fosforilacions específiques, promovent la progressió del cicle cel•lular. Per altra banda, sota condicions de manca de fosfat, Pho85 esdevé inactiva i Cln3 és degradada ràpidament, conduint a un arrest del cicle cel•lular per mantenir la longevitat de la cèl•lula. / El control del ciclo celular por factores tróficos tiene un papel importante en la proliferación celular de todos los organismos. Los nutrientes son uno de estos factores importantes requeridos por las células para reproducirse, por lo tanto deben existir mecanismos muy bien regulados que conecten la disponibilidad de nutrientes con el ciclo celular. Por ello, el estudio de cómo funciona la señalización celular de nutrientes y cómo afecta a la progresión del cicle es altamente relevante. Cln3, la ciclina de G1 más temprana en Saccharomyces cerevisia, es un efector común de múltiples vías de señalización de nutrientes. Además, su papel en el ciclo celular es crucial. Por lo tanto esta proteína es una buena candidata para regular la progresión del ciclo celular en respuesta a la disponibilidad de nutrientes. Un tema importante a resolver es encontrar la proteína que podría modular directamente los niveles de Cln3 dependiendo de la presencia de nutrientes. Esta proteína actuaría como sensor de nutrientes y como reguladora del ciclo celular. En la presente tesis, se muestra a Pho85 como la proteína que puede hacer estas dos tareas, tanto por sus propiedades bien conocidas en la detección de fosfato, como por sus funciones de CDK modulando el ciclo celular. Los resultados de esta tesis demuestran claramente que cuando el fosfato está presente, Pho85 modula los niveles de Cln3 incrementando la estabilidad de la ciclina mediante fosforilaciones específicas, promoviendo la progresión del ciclo celular. Por otro lado, bajo condiciones de ausencia de fosfato, Pho85 es inactivada y Cln3 se degrada rápidamente, conduciendo a una parada del ciclo celular para mantener la longevidad de la célula.

Se realizó el estudio histológico del timo de lubina, con el fin de conocer la arquitectura del microambiente tímico y las relaciones estructurales de sus diferentes componentes. Las células linfoides sufren procesos de muerte celular programada por apoptosis, no descrita previamente en timo de peces; indicando la existencia de procesos de selección negativa durante su diferenciación intratímica. Existen células interdigitadas, no descritas previamente en peces. Hay áreas mielopoyéticas, con actividad eritropoyética y granulopoyética heterófila. La fragilidad de la barrera epitelial, que separa la cavidad branquial del parénquima tímico, puede verse incrementada por la presencia de macrófagos intraepiteliales y macrófagos con inmunoglobulinas de superficie. El transito de células sanguíneas a través de la capa de células epitelio-reticulares limitantes y de capilares sanguíneos indican la carencia de barrera hematotímica. Estos datos sugieren la existencia de procesos antígen o dependiente y la persistencia de funciones propias de órgano linfoide secundario en timo de lubina. / The histological study of the sea bass thymus was performed to know the architecture of the thymic microenvironment and the structural relationships of its different components. The lymphoid cells suffer processes of programmed cell death by apoptosis, not described previously in fish thymus, indicating the existence of negative selection processes during its intrathymic differentiation. There are interdigitating cells, which has not described before in fish. Exist myelopoiesis areas, with erythropoietic and heterophilic granulopoietic activity. The fragility of the epithelial barrier, that separates the branchial cavity from the thymic parenchyma, is increased by the presence of intraepithelial macrophages and macrophages with surface immunoglobulins. The traffic of blood cells across the layer of limiting reticular epithelial cells and blood capillaries indicate the lack of hemato-thymic barrier. This information suggests the existence of antigen dependent process and the p ersistence of own functions of secondary lymphoid organ in thymus of sea bass.

El objetivo del presente estudio ha sido evaluar la relación entre los parámetros de la calidad seminal y la capacidad de penetración in vitro de ovocitos homólogos (PIVh) con los resultados in vivo de fertilidad y prolificidad.Se han analizado 60 eyaculados realizando sobre cada uno las medicionesclásicas del espermiograma (motilidad, calidad de movimiento, volumen, concentración espermática, estado del acrosoma, morfoanomalías y tinción vital), pruebas bioquímicas (contenido de ATP, calcio, sodio, potasio, magnesio y zinc), ensayos de la funcionalidad del espermatozoide ( test de endósmosis, test del diacetato de carboxifluoresceína, test ORT) y la valoración mediante un test de penetración in vitro homóloga. Los resultados de la valoración in vitro del semen fueron contrastados con los resultados obtenidos en un ensayo in vivo con inseminaciones homospérmicas.En nuestras condiciones experimentales el estudio de los parámetros demotilidad, morfología, acrosomas y de los test de funcionalidad de la membrana puedeser una herramienta útil, en un primer término, para desechar eyaculados de baja calidad, aunque estas técnicas no alcanzan la sensibilidad suficiente para dar un resultado satisfactorio en la predicción de la fertilidad. Sin embargo, los resultados obtenidos muestran que el test de penetración in vitro es la única técnica de las estudiadas capaz de discriminar adecuadamente los eyaculados que darán lugar a los distintos grupos de fertilidad. / The purpose of the present study was to evaluate the relationship between theparameters of seminal quality and homologous oocytes in vitro penetration capacityversus the reproductive parameters, fertility and litter size which were bothdetermined in a field trial.Sixty boar ejaculates have been analysed, performing on each of them:conventional semen analysis (motility, volume, sperm concentration, normal acrosome, morphology and structural integrity), biochemical parameters (ATP, calcium, sodium, potassium, magnesium and zinc), functional sperm assays (Hypoosmotic swelling test (HOST), Carboxiflorescin Diacetate Test (DCF), Osmotic Resistance Test (ORT)) and the homologous in vitro penetration test. The results observed upon a in vitro semen valoration were checked with those obtained upon a in vivo trial with homospermic insemination.In our experimental conditions the study of motility, morphology, normalacrosomes and functional test may be a good tool, in a first analysis, to get rid of poor seminal quality ejaculates. Still, this analysis is not accurate enough to bring outsatisfactory results to predict the in vivo fertilization capacity. In the light of theseresults only the homologous in vitro penetration test has been found able todiscriminate the different groups of fertility and litter size. None the less an extensive study is required.

El mal pronòstic en una neoplàsia epitelial està associada a l'adquisició de característiques mòbils o invasives per part de les cèl·lules canceroses. Aquesta transformació morfològica es denomina transició epiteli-mesènquima (TEM). Snail és un factor de transcripció implicat en aquest procés, responsable de reprimir l'expressió de l'E-cadherina. Aquest treball demostra que Snail té la capacitat de reprimir l'expressió de MUC1 i VDR a través de la seva unió directa a caixes de reconeixement situades en els diferents promotors proximals. A més, la sobreexpressió d'Snail en diverses línies cel·lulars provoca un augment dels nivells d'ARNm de ZEB1 i un increment de l'activitat del seu promotor. L'activitat del promotor mínim d'Snail i els seus nivells d'ARNm depenen de la senyalització d'ERK. Finalment, hem demostrat que Snail i WT1, un regulador positiu de l'expressió de l'E-cadherina, competeixen per unir-se al promotor de l'E-cadherina i regular la seva transcripció. / The poor prognosis in epithelial neoplasia is associated with the acquisition of motile or invasive properties by the cancerous cells. This morphological transformation is often referred to as epithelial to mesenchymal transition (EMT). The Snail transcription factor is involved in this process by repressing the expression of E-cadherin. In this study we demonstrate the capacity of Snail to repress both MUC1 and VDR transcription by direct binding to specific sequences within their proximal promoter. Moreover, Snail overexpression in several cell lines induces ZEB1 mRNA and increases its promoter activity. The activity of the Snail minimal promoter is dependent on the ERK signaling pathway. Finally, we have demonstrated that Snail and WT1, a positive regulator of E-cadherin expression, compete for the binding to the E-cadherin promoter in order to regulate its transcription.

Esta tesis doctoral consiste en la caracterización de la ciclina meiótica Rem1, de Schizosaccharomyces pombe. En este trabajo se analizó, inicialmente, el patrón de transcripción y expresión de rem1 durante la meiosis observando que el pico de expresión se produce durante la meiosis I, la actividad quinasa del complejo ciclina-Cdk también coincide con la meiosis I. Seguidamente, se determinó que la transcripción del mRNA maduro de rem1 depende de Mei4 a través de las cajas FLEX del promotor de rem1. También se observó la presencia de un RNA "antisense" que se transcribe durante las primeras horas de la meiosis. A continuación, se estudió la función de Rem1 durante la meiosis determinando una función de esta ciclina en la meiosis I. Se observó la toxicidad de Rem1 expresado durante el ciclo mitótico. Posteriormente, se analizaron posibles interacciones genéticas con otras ciclinas meióticas detectando que Rem1 tiene una función redundante con Cig2 durante la fase S meiótica. También se determinó la necesaria presencia de rem1 para conseguir unos niveles de recombinación meiótica intragénica normales, mientras que se requiere para la recombinación intergénica. / The main goal of this doctoral thesis is the characterization of the meiotic cyclin Rem1, in Schizosaccharomyces pombe. First of all we analized the transcription and expresion profiles of rem1 during meiosis. We observed the maximum of expresion during meiosi I and the kinase activity of the complex cyclin-Cdk had exactly the same profile. Then, we analized the transcription profile of the mature mRNA of rem1, showing that this transcription depends on Mei4 through the FLEX boxes which are loclized in the rem1 promoter. An antisense RNA was also detected at the begining of the meiosis. We next diceded to study the function of this cyclin. Firstly we observed that overexpression of Rem1 is toxic for the cell during mitotic cell growth. Moreover, a function for Rem1 was observed during meiosis I. Rem1 is also required in order to obtain normal levels of meiotic intragenic recombination, but it is not necesary for the intergenic recombination. Finally, we could detect a genetic interaction betwen Rem1 and the meiotic S phase cyclin, Cig2.