La presente tesis doctoral presenta varios resultados fundamentales para la ampliación del conocimiento actual de procesos importantes en la generación de los circuitos neuronales, como son la migración y la ramificación de células neurales. En primer lugar, se ha determinado la expresión de la semaforina transmembranal 4F en cerebro de ratón en desarrollo y adulto. Así, se ha visto que se expresa en diversas áreas del cerebro, y se ha encontrado expresión de esta proteína en precursores neuronales y en neuronas maduras, principalmente en dendritas, y en células del linaje oligodendroglial. Para profundizar más en este aspecto se llevaron a cabo varios marcajes dobles de Sema4F con proteínas marcadoras de oligodendrocitos, observándose marca en el nervio óptico y otras regiones cerebrales, incluídas la materia blanca y vías de migración de oligodendrocitos. La localización de esta semaforina en el nervio óptico a edades embrionarias y su expresión en células precursoras de oligodendrocitos (OPCs), comprobada in vitro, nos llevó a sugerir que Sema4F funciona controlando la migración de OPCs. Una serie de experimentos con explantes de nervio óptico tratados con medio control o medio condicionado 4F nos permitió determinar que Sema4F actúa inhibiendo la migración de OPCs, sin afectar a su proliferación. Además, Sema4F induce la diferenciación de OPCs a oligodendrocitos maduros. Todos estos datos sugieren un posible papel de Sema4F en procesos de remielinización. Los efectos negativos de Sema4F sobre la migración de OPCs deben cursar con cambios en el citoesqueleto celular. La kinasa de adhesión focal (FAK) es un importante mediador de señales extracelulares (como factores tróficos, interacción de integrinas con proteínas de matriz extracelular, etc…) y el interior de las células. Actúa sobre el citoesqueleto de actina y de tubulina, influyendo en la generación de filopodios, lamelipodios y fibras de estrés. Tiene un papel crucial en migración, de modo que dedicimos estudiar si Sema4F ejerce sus efectos en OPCs a través FAK. Hemos visto que Sema4F es capaz de inducir la fosforilación en varios residuos tirosina de FAK en pocos minutos, y que ambas proteínas por separado ejercen efectos opuestos en la migración de oligodendrocitos. La vía de señalización de 4F, de la que se desconoce incluso el receptor, podría cursar mediante la modulación del estado de activación de FAK, aunque faltan experimentos definitivos. FAK presenta varias isoformas específicas del sistema nervioso central, originadas mediante procesos de splicing alternativo. En la presente tesis hemos determinado con gran especificidad la forma mayoritaria expresada en varias áreas cerebrales y en el desarrollo embrionario o el adulto, tanto en neuronas como en células de la glía. FAK responde a neurotrofinas y participa en procesos de ramificación neuronal, si bien su efecto final es controvertido. Otra proteína que responde a neurotrofinas, y actúa promoviendo la ramificación axonal, es la kinasa dependiente de cdc-42 activada 1 (Ack1). En esta tesis hemos determinado que ambas proteínas interaccionan en cerebro específicamente, de manera independiente de la isoforma de FAK presente. Mediante el uso de inhibidores hemos visto que la activación de FAK es necesaria para la fosforilación de Ack1 y viceversa. FAK es la responsable de la atracción ejercida por netrina-1, y hemos determinado que la ausencia de Ack1 elimina el efecto de esta molécula de señalización. Con técnicas de Espetrometría de Masas hemos identificado algunos posibles interactores de ambas proteínas. Además, hemos observado cambios en el estado de fosforilación de varios residuos de FAK y Ack1 en función del estado de desarrollo (ratones P5 Vs. Adultos) y del estado general de activación del cerebro (ratones inyectados con la droga epileptogénica PTZ Vs. Control). / This thesis presents several results related to important processes regarding neural circuit formation, i.e. migration and ramification of Central Nervous System (CNS) cells. First, we have determined the expression of transmembrane semaphorin 4F (Sema4F) in developing and adult mice brain. Expression of this protein is high in neuronal and oligodendrocyte precursor cells (OPCs), and in different areas including optic nerve (ON) and different migratory pathways. In vitro experiments confirmed Sema4F expression in OPCs. We investigated the role of this protein in functions important for OPC physiology, and found that Sema4F inhibits OPC migration from ON explants and induces their differentiation into mature progenitors. Negative effects of Sema4F in migration must involve cytoskeleton changes. Focal adhesion kinase (FAK) is an important integrator of different extracellular signals and modulates cytoskeleton dynamics to control generation of lamellipodia, fillopodia and stress fibers. In the present project we found that Sema4F is able to phosphorylate FAK, and that FAK enhances OPC migration. The exact implications of Sema4F-FAK relationship remain to be elucidated. FAK exists in different spliced isoforms, expressed preferentially in brain. In this project, we characterised the exact isoform expressed in different areas of the brain and by different cell types. Finally, FAK response to neurotrophins is well characterised. FAK also participates in ramification processes, with controversial final effects in neurons. Ack1 is a crucial transducer of neurotrophin-induced ramification. In this thesis we show that both proteins interact specifically in neurons. We have also found that the activation of FAK is necessary for Ack1 phosphorylation upon stimulation, and viceversa. FAK mediates netrin-1 attraction, and here we have determined that knocking-down Ack1 avoids netrin-1 effects in hippocampal explants. By Mass Spectrometry (MS) techniques, we have observed changes in the phosphorylation state of both proteins depending on the developmental stage of the brain (P5 mice) or its activation state (epileptic mice).

TrkA es va descobrir com a un oncogén producte de la fusió del seu domini tirosinakinasa (TK) amb la tropomiosina. Posteriorment, va augmentar el seu interès endescobrir-se que la proteïna nativa constituïa el receptor del factor de creixementnerviós (NGF).Es coneixen bé els esdeveniments que tenen lloc a partir de la unió del lligand alreceptor i que donen lloc a l'activació de les vies de senyalització de les MAPK yPI 3-K/Akt. Se sap que, in vivo, la internalització del receptor i el seu transportretrògrad també juguen un paper important per a l'efecte a llarg termini del NGF ique és un tret distintiu en relació a d'altres receptors de factors de creixement.L'activació del receptor també comporta un augment transitori de Ca2+intracel· lular. Per això ens vam plantejar l'estudi de la relació entre l'activació deTrkA i calmodulina (CaM), com a sensor dels nivells de Ca2+ intracel· lulars.En primer lloc vam observar una interacció directa i dependent de Ca2+ entre CaM ila meitat c-terminal del domini intracel· lular de TrkA. La primera part del treball secentra en caracteritzar aquesta interacció.Per veure l'efecte de la unió sobre Trk, vam utilitzar inhibidors de CaM. Aquestsno impedeixen la fosforilació de TrkA induïda per NGF, però sí comporten laproteòlisi del receptor donant lloc a un fragment amb activitat tirosina kinasaconstitutiva. Donada la ubiqüitat de CaM, i la seva importància en processos vitalsper a la cél· lula, el segon objectiu ha consistit en buscar el lloc d'unió a CaM deTrkA per així poder obtenir una construcció de Trk on es perdés la unió a CaM.Basant-nos en diverses evidències, ens vam centrar en la caracterització d'una regióque conté una Tyr fosforilable (Y701) i que forma part d'un motiud'internalització. L'última part del treball se centra en descriure les característiquesd'aquesta Tyr i la seva funció, que més enllà de la relació amb CaM, pot constituiruna fosforilació inhibitòria per l'activitat de Trk i un lloc de regulació negativa dela internalització. / TrkA se descubrió como un oncogén producto de la fusión de su dominio tirosinakinasa (TK) con la tropomiosina. Posteriormente, aumentó su interés trasdescubrirse que la proteína nativa constituía el receptor del factor de crecimientonervioso (NGF).Se conocen bien los acontecimientos que ocurren tras la unión del ligando alreceptor y que dan lugar a la activación de las vías de señalización de las MAPK yPI 3-K/Akt. Se sabe que, in vivo, la internalización del receptor y su transporteretrógrado también juegan un papel importante para el efecto a largo plazo delNGF y que es una característica distintiva de otros receptores de factores decrecimiento.La activación del receptor también conlleva un aumento transitorio de Ca2+intracelular. Por ello nos planteamos estudiar la relación entre la activación deTrkA y calmodulina (CaM), como sensor de los niveles de Ca2+ intracelulares.En primer lugar observamos una interacción directa y Ca2+ dependiente entre CaMy la mitad c-terminal del dominio intracelular de TrkA. La primera parte del trabajose centra en caracterizar esta interacción.Para ver el efecto de la unión sobre Trk, utilizamos inhibidores de CaM. Éstos noimpiden la fosforilación de TrkA inducida por NGF, pero sí conllevan la proteolisisdel receptor dando lugar a un fragmento con actividad tirosina kinasa constitutiva.Dada la ubicuidad de CaM y su importancia en procesos vitales para la célula, elsegundo objetivo consistió en buscar el sitio de unión a CaM de TrkA, para asípoder obtener una construcción de Trk en que se perdiera la unión a CaM.Basándonos en diversas evidencias, nos centramos en la caracterización de unaregión que contenía una Tyr fosforilable (Y701) y que además forma parte de unmotivo de internalización. La última parte del trabajo se centra en describir lascaracterísticas de dicha Tyr y su función,que más allá de la relación con CaM,puede constituir una fosforilación inhibitoria para la actividad de Trk y un lugar deregulación negativa de su internalización. / TrkA was discovered as an oncogen, product of the fusion of its Tyrosine kinasedomain with Tropomiosin. Later on, it was identified as the receptor for the Nervegrowth factor (NGF).The first steps in Trk signaling after ligand binding are well understood. And alsothe pathways leading to MAPKs and PI3K-Akt activation. But receptorinternalization and retrograde transport are also important for the long termsignaling of TrkA, giving raise to a differential regulation of Trk receptors amongother growth factor receptors.Receptor activation also induces an increase in intracellular calcium concentration.That's why we thought on studying the relationship between TrkA activation andcalmodulin (CaM), as a prototypical calcium sensor.First we described a direct and calcium-dependent interaction between CaM andthe c-terminal part of TrkA. The first part of this work consists on thecharacterization of this interaction.In order to check the effect of CaM binding on TrkA we used CaM inhibitors.NGF-induced TrkA fosforilation was not inhibited upon CaM inhibition, but Trkwas cleaved, leading to constitutively active fragments. CaM is ubiquous andnecessary for many cell processes, so the second objective has been to search forthe CaM binding domain on TrkA in order to generate a TrkA mutant defective inCaM binding.We mutated a region containing a phosphorylatable Tyrosine Y701 that constitutesa trafficking motif, as the putative binding site of CaM. The last part of this projectdeals with the characterization of the mutants, and their effect even regardless ofCaM binding. Its phosphorylation might inhibit Trk function, and the regionconstitutes a negative regulator of internalization.

Este trabajo describe la diversidad genética de las poblaciones actuales del Oeste del Mediterráneo según dos polimorfismos: nueve polimorfismos Alus y doce microsatelites (STR) presente en el cromosoma X. En este trabajo, se presentan resultados originales de poblaciones de Marruecos, España, sur de Italia y de poblaciones judías. Nuestro estudio multidisciplinario se basa sobre datos biológicos, arqueológicos, históricos, geográficos y lingüísticos para reconstruir los origines y la historia genética del oeste del Mediterráneo. Para la totalidad de los marcadores, nuestros resultados muestran una proximidad genética entre las poblaciones del norte de África y del sur de Europa con una diferencia entre los grupos norte africanos y sub-saharianos. También se puede concluir que en el noroeste de África, no hay una fuerte diferenciación genética entre los beréberes y los árabes. El análisis de cinco poblaciones judías muestra que se agrupan en un mismo cluster, indicando su ancestral común origen, que se ha conservado durante el tiempo a pesar de la diáspora, con una clara distinción entre ellos y sus vecinos no-judíos

La implicación del papiloma virus humano (HPV) en carcinomas de cérvix está totalmente demostrada, pero esta infección se puede producir en otras regiones anatómicas con similares consecuencias patológicas. El estudio presenta la detección de HPV en carcinomas de pene y vulva mediante PCR, analizando la sensibilidad de diferentes sistemas, primers GP5+/6* y MY09/11. También se lleva a cabo la detección inmunohistoquímica de proteínas celulares como posibles marcadores diagnóstico de infección por HPV, las proteínas P53 y P16 su expresión supuestamente se altera por la infección de HPV en carcinomas de pene (77,5%), mientras que en los carcinomas de vulva la tasa de detección está dentro de los rangos esperados según trabajos previos publicados (29, 7). El estudio de la relación entre la presencia de HPV y la expresión de los marcadores celulares muestra su no asociación en estas patologías. / The infection of human papilloma virus (HPV) is clearly related with cervical carcinomas, but this infection can be found in other regions whit PCR, analyzing the sensitivity of HPV in penile and vulvar carcinomas whit PCR, analyzing the sensitivity of two differents systems, MY09/11 and GP 5+/6+. Also the immunohistochemical detection of cell proteines as diagnostic markers for the HPV in penile carcinomas in the study populations (77,5%), whereas in vulgar carcinomas . The detection rates is similar to the previously published data ( 29, 7%). The study of the relatioship between HPV and the expression of the cell markers shows no asocciation with the pahologies.

La interacción entre gametos es crucial para la fecundación. La zona pelúcida (ZP) se considera responsable de bloquear la polispermia, pero in vitro estas funciones no son totalmente eficientes. La polispermia es frecuente en fecundación in vitro (FIV) en porcino y bovino, mientras que la interacción heteróloga espermatozoide-ovocito ha sido demostrada. Los objetivos fueron estudiar el bloqueo de la polispermia para mejorar los resultados de FIV e investigar las interacciones heterólogas entre espermatozoide humano y ovocito porcino. Los resultados demuestran que se produce endurecimiento de la ZP de ovocitos bovinos y porcinos de forma previa a la fecundación, utilizando DTSP o fluido oviductal bovino. Cuando se utilizan estos ovocitos en FIV aumenta la monospermia y el rendimiento final. En las interacciones heterólogas los espermatozoides humanos pueden unirse a ZP porcina y sufren la reacción acrosómica, pero no penetran los ovocitos sin ZP. En ICSI activan el ovocito y forman pronúcleos. / The interaction between gametes is crucial to fertilization. The zona pellucida (ZP) is responsible to block of polyspermy, but in vitro these functions are not efficient. The polyspermy is frequently in bovine and porcine in vitro fecundation. Besides the heterologous interaction between spermatozoa-oocyte had been described. The aims were study the block of polyspermy to improve the output of IVF and research the heterologous interactions between human spermatozoa and porcine oocyte.The results show that there is hardening of bovine and porcine ZP previously at fertilization, in vivo and using DTSP or bovine oviductal fluid. When these oocytes are used in IVF improve the monospermy and the output. In heterologus interactions the human spermatozoa could bind to porcine ZP and it triggers the acrosome reaction, but not penetration in ZP-free oocyte was observed. In ICSI the oocyte activation and

Este trabajo se ha centrado en el estudio de diferentes factores que afectan a la capacidad fecundante del semen congelado, como la velocidad de descongelación y el sistema antioxidante del semen porcino. También se ha estudiado la capacidad predictiva de la fertilidad in vivo que tienen las diferentes técnicas de análisis seminal tanto para el semen congelado como en condiciones de campo para el semen refrigerado. Se pudo determinar que la velocidad de descongelación más rápida tiene un efecto positivo sobre la funcionalidad espermática de las muestras evaluada mediante un sistema de FIV. Igualmente se concluyó también que el sistema de FIV parece ser la mejor herramienta disponible para evaluar la calidad del semen congelado-descongelado. Se evidenció que el proceso de crioconservación del semen supuso una pérdida siginificativa en el contenido de GSH intracelular. Finalmente, se demostró que el análisis seminal sólo puede identificar eyaculados con bajo potencial fértil. / Boar frozen-thawed semen is still a valuable tool as a complement to artificial insemination with fresh semen in some conditions. The objectives were firstly, the design of better freezing methods in order to obtain acceptable semen quality (freezing-thawing procedures) and secondly, to address the question of whether differences in farrowing rate and litter size after the use of different ejaculates could be predicted using the standard semen parameters under commercial conditions.We can determine that the IVF fertilization system seems to be a good tool to evaluate the quality of frozen-thawed boar semen previous to its commercial way. In other way, we found that there was a loss in GSH content after cryopreservation of boar semen and the addition of GSH to the thawing extender resulted in a significant increase in sperm fertilizing ability. Finally, semen analysis, under commercial conditions, allows to identify ejaculates with very low fertility potential. Therefore, it is unlikely to detect fertility differences associated with seminal parameters.

El objetivo de este trabajo ha sido evaluar la capacitación y reacción acrosómica de espermatozoides de verraco eyaculados lavados a través de un gradiente de percoll y no lavados e incubados en medio de fecundación M199 suplementado con progesterona o con complejos cumulus-ovocito así como la penetración espermática de estos con ovocitos homólogos madurados in vitro. La determinación de la capacitación se realizó mediante el uso de lectinas (PNA, SJA y ECA) y citometría de flujo. Los resultados mostraron que la progesterona posee efecto protector sobre la vitalidad espermática y los mayores porcentajes de reacción acrosómica ocurren ente los 45-90 minutos de incubación, En cuanto a la penetración espermática no hubo diferencias entre espermatozoides lavados y no lavados. / The purpose of the present study was to evaluate the sperm capacitation and acrosome reaction of spermatozoa washed in Percoll and unwashed undergo in an in vitro incubation system with progesterone or cumulus-oocyte and the penetration rate in homologous oocytes matured in vitro. The evaluation was done with lectin (PNA, SJA and ECA) and flow cytometry. The results shown that progesterone had a protective effect on sperm vitality and the highest percentages of acrosome reaction were obtained between 45-90 minutes of incubation. The penetration rate was similar between washed and unwashed spermatozoa.

Tesis por compendio / La exposición crónica a sustancias de abuso lleva a cambios adaptativos en el cerebro que implican alteraciones en la expresión génica. Se ha propuesto que los factores de transcripción CREB y deltaFosB serían dianas moleculares para la regulación de la plasticidad, la cual lleva a la adicción.En este trabajo hemos estudiado los cambios en la activación de CREB, en PVN y NTS, y las quinasas que mediarían su activación durante la dependencia y síndrome de abstinencia a morfina, así como la respuesta del eje HHA durante dicho síndrome. También se investigó la posibilidad de que la activación de CREB y su coactivador transcripcional TORC1 dependan de la activación de receptores adrenérgicos. Además se evaluaron las posibles modificaciones en la expresión de FosB/deltaFosB en diferentes áreas cerebrales implicadas en la adicción, así como los cambios neuroendocrinos/neuroquímicos responsables de las alteraciones metabólicas observadas durante el tratamiento crónico con morfina. / Chronic exposure to opioids and other abused drugs results in adaptive changes in the brain involving alterations in gene expression. It is proposed that the transcription factors CREB and deltaFosB be molecular targets for the regulation of plasticity, which leads to addiction.In this work we studied changes in activation of the cAMP-response element binding protein (CREB) in PVN and NTS and the kinases that may mediate this activation during dependence and morphine withdrawal and the HPA axis response after naloxone-induced morphine withdrawal. We also investigated the possibility that the activation of CREB and the transcriptional coactivator of CREB, TORC1, arises from the activation of adrenergic receptors. We also evaluated the possible modifications in FosB/deltaFosB expression in several brain areas involved in addiction and neuroendocrine/neurochemical changes that are responsible for the metabolic alterations seen during chronic morphine treatment.

La capacitación es un proceso fisiológico que el espermatozoide debe experimentar para que la fecundación del ovocito tenga lugar. Este proceso se encuentra regulado en el espermatozoide por diferentes vías moleculares, varias de las cuales, a día de hoy, se desconocen o no están totalmente dilucidadas. Estos eventos moleculares que acontecen en el espermatozoide durante el proceso de capacitación están condicionados por distintos factores que rodean su entorno, entre los cuales podemos destacar el ambiente epididimario, el plasma seminal o las secreciones del aparato reproductor femenino como el fluido oviductal. El objetivo principal de este trabajo fue analizar el comportamiento de espermatozoides epididimarios-EP (en contacto con el fluido epididimario y no con el plasma seminal) y eyaculados-EY (en contacto con el plasma seminal) sometidos a 3 tratamientos diferentes: 1) Espermatozoides no tratados (grupo control-C); 2) Lavados a través de gradientes de Percoll e incubados en medio de capacitación TALP (grupo lavados-L); 3) Espermatozoides lavados e incubados en Fluido Oviductal Porcino (grupo FOP).

Las patologías más importantes del páncreas exocrino, como la pancreatitis crónica (PC) o el cáncer de páncreas, representan un gran problema de salud pública en Europa. En la PC, el tejido acinar es substituido por complejos ductales. Además, es difícil mantener el fenotipo diferenciado de las células acinares en cultivo ya que sufren una transdiferenciación acinar-ductal.Las células madre embrionarias (ES) de ratón han sido utilizadas en la última década para generar in vitro células completamente diferenciadas de varios linajes celulares. No obstante, la capacidad de las células ES a diferenciarse a tipos celulares de origen endodérmico es muy limitada. El objetivo principal de este proyecto ha consistido en desarrollar estrategias para diferenciar células ES de ratón a células pancreáticas acinares con una elevada eficiencia mediante 1) la optimización de las condiciones de cultivo con tal de activar vías de señalización implicadas en el desarrollo/diferenciación pancreáticas; 2) la sobreexpresión de factores transcripcionales maestros utilizando vectores virales con el fin de recapitular específicamente un programa de diferenciación acinar; 3) la selección genética de las células comprometidas al linaje acinar con el objetivo de purificar las células acinares diferenciadas.Mediante la integración de estos abordajes, hemos conseguido aislar células que comparten características fenotípicas con células acinares inmaduras según la expresión de marcadores de diferenciación y la respuesta funcional a secretagogos. / Exocrine pancreatic diseases such as chronic pancreatitis (PC) or pancreatic cancer are major health issues in Europe. In CP, the acinar tissue is substituted by ductal complexes. In addition, it is difficult to maintain the differentiated phenotype of the acinar cells in culture as within few days an acinar-ductal transdifferentiation takes place.In the last decade, mouse embryonic stem cells (mES) have been used to generate differentiated cells of a variety of cellular lineages in vitro. However, the ability of ES cells to differentiate into endodermal lineages is limited. The main objective of this project has focused on the development of strategies to differentiate mES to pancreatic acinar cells with high efficiency by means of: 1) Optimization of cell culture conditions to activate signalling pathways involved in pancreatic differentiation/development; 2) the overexpression of master transcription factors involved in pancreas development using viral vectors in order to recapitulate specific acinar differentiation program; 3) the genetic selection of cells committed to the acinar linage in order to purify the differentiated cells.The integration of these different strategies allowed us to isolate cells that share phenotypic features with immature acinar cells according to the expression of differentiation markers and the functional response to acinar secretegogues.