La polispermia (entrada de más de un espermatozoide al ovocito) es una condición patológica en mamíferos ya que impide el desarrollo embrionario. En la especie porcina, la polispermia es un problema común y aún sin resolver en los sistemas de fecundación in vitro (FIV). Los gránulos corticales (GCs) de los ovocitos de mamíferos estan implicados en el bloqueo de la polispermia, sin embargo, poco se sabe acerca de la composición y función de estas organelas. Esta ampliamente descrito que las moléculas liberadas de los GCs durante la fecundación o activación ovocitaria mediante estimulación química o eléctrica producen importantes modificaciones, particularmente en la zona pelúcida (ZP), el espacio perivitelino y, probablemente, el oolema del ovocito. Estas modificaciones repercuten directamente en el bloqueo de la polispermia. El conocimiento del contenido de los GCs y proteínas del oolema así como su papel durante la fecundación en la especie porcina es escaso. La mayoría de la información que se tiene en la actualidad se ha obtenido del modelo murino. En la presente tesis doctoral, investigamos la presencia de posibles proteínas de los GCs en ovocitos porcinos así como la presencia de metaloproteasas ADAM-10 y ADAM-17 en ovocitos porcinos y bovinos. Para ello, este estudio se dividió en tres apartados: / Polyspermy (entering of more than a spermatozoon into the oocyte) is a pathological condition in mammals since it avoids the normal embryonic development. In the pig species, Polyspermy is a common problem still unsolved in the current systems of in vitro fertilization (IVF). The cortical granules (CGs) from mammal's oocytes are involved in the block to polyspermy. However, little is known about the composition and function of these organelles. It is widely described that the molecules released of the CGs during the fertilization or oocyte activation, by means of chemical or electrical stimulation, produce important modifications, particularly in the zona pelucida (ZP), the periviteline space and, probably, oolema of the oocyte. These modifications have a direct role in the block to polyspermy. The knowledge about the content of the CGs and the oolema proteins of as well as their role during fertilization in pigs is still scarce. The majority of the information that we currently have it has been obtained from the murine model. In the present Doctoral Thesis, we investigated the presence of possible proteins of the CGs in pig oocytes as well as the presence of metaloproteases ADAM-10 and ADAM-17 in pig and bovine oocytes. For that, this study was divided into three sections

El objetivo del presente trabajo consistió en valorar el efecto de las células epiteliales del oviducto porcino y del cumulus oophorus sobre distintos parámetros relacionados con la fecundación in vitro en la especie porcina. Las variables estudiadas fueron el porcentaje de penetración, el número medio de espermatozoides por ovocito, el porcentaje de formación de pronúcleo masculino, el porcentaje de monospermia, el porcentaje de cigotos divididos a las 48 horas postfecundación, el porcentaje de blastocistos, el número medio de núcleos por blastocisto, la resistencia de la zona pelúcida a la digestión con pronasa y la densidad y distribución de los gránulos corticales en los diferentes grupos experimentales. / The objective of this experimental work was to study the effect of porcine epithelial oviductal cells and cumulus cells on several parameters related to in vitro fertilization in pigs. Studied variables were rate of penetration, mean number of sperm cells per penetrated oocyte, rate of male pronuclear formation, cleavage rate at 48h postinsemination, blastocyst formation rate, mean number of cells per blastocyst, resistance of zona pellucida to pronase digestion and density and distribution of cortical granules in the different experimental groups.

La capacitación espermática puede ser mimetizada in vitro eliminando el plasma seminal por distintos sistemas de lavado. Entre los tratamientos espermáticos empleados habitualmente en los laboratorios para capacitar a los espermatozoides se encuentran los lavados que se realizan con medios enriquecidos con albúmina o a través de gradientes de Percoll. El objetivo de este trabajo ha sido determinar los cambios que acontecen en los espermatozoides (procedentes de epidídimo y eyaculados) sometidos a tres sistemas de capacitación in vitro evaluados mediante una batería de técnicas que determinan distintos estadios de la capacitación espermática.De los resultados obtenidos se desprende que tanto la procedencia de los espermatozoides (epidídimo o eyaculado) como el tratamiento de capacitación al que se les somete afecta en gran medida a los resultados de la penetración in vitro y por lo tanto, la capacitación se produce de manera diferente entre estos grupos. / Sperm capacitation may be defined as a set of molecular modifications that occurs in the spermatozoa, after maturation in the epididymis, which enables them to fertilize the oocyte. In vitro, this process can be imitated in vitro by separation of the seminal plasma by different systems of washing. Between the sperm treatments routinely used in the laboratories, semen samples are washed of albumin or centrifugations through a Percoll. The aim of this work was examine and characterize the changes that happen in the sperms (from epididymis and ejaculated) submitted to three systems of in vitro capacitation, evaluated by means of a battery of tests to determine different levels of the sperm capacitation. Sperm capacitation was dependent on sperm treatment, whetherepididymal or ejaculated and to whichever parameter measured.Nevertheless, all these parameters, in spite of the fact that they have beendescribed as tools to evaluate the sperm capacitation, really are not capable of discriminating or indicating the level of capacitation.

La ICSI porcina es una herramienta con gran potencial aplicativo en diversos campos, entre los que destacan la producción de animales transgénicos, y la recuperación de razas en peligro de extinción. Aunque en la actualidad existen referencias de obtención de descendencia viva, el rendimiento es inferior al de otras especies, posiblemente debido al desconocimiento de las condiciones idóneas, y la dificultad de los cigotos para alcanzar el estadío de blastocisto in vitro. El presente trabajo se llevó a cabo para determinar diferentes factores que podrían afectar al rendimiento de la técnica, estudiando el efecto de 1) la secuencia de cultivo de los zigotos recién inyectados; 2) modificaciones en el sistema de MIV tradicional, y por último 3) la activación exógena del ovocito mediante la inyección de inositol trifosfato con el espermatozoide. El objetivo global de este estudio fue el de incrementar el rendimiento final de la ICSI en la especie porcina. / ICSI in pigs is a tool with an important applicable potential in diverse fields. One of this is the production of transgenic animals, and the conservation of endangered species. Even though there are some cases of living offspring, its output is still quite low comparing to other species, possibly due to unknown factors referring to ideal conditions for the development, and to the difficulty of the zygotes to reach the blastocyst stage in vitro. The goal of this study was to evaluate different factors affecting the ICSI performance. This was done by studying 1) the sequence of culture of the injected oocytes; 2) In vitro maturation (IVM) modifications, through meiotic inhibitors, such as roscovitine, and changes in IVM duration time, and finally 3) the exogenous oocyte activation through inositol triphosphate (InsP3) injection together with the sperm. The main objective of this study was to increase the final performance of ICSI in pigs.

La interacción entre gametos es crucial para la fecundación. La zona pelúcida (ZP) se considera responsable de bloquear la polispermia, pero in vitro estas funciones no son totalmente eficientes. La polispermia es frecuente en fecundación in vitro (FIV) en porcino y bovino, mientras que la interacción heteróloga espermatozoide-ovocito ha sido demostrada. Los objetivos fueron estudiar el bloqueo de la polispermia para mejorar los resultados de FIV e investigar las interacciones heterólogas entre espermatozoide humano y ovocito porcino. Los resultados demuestran que se produce endurecimiento de la ZP de ovocitos bovinos y porcinos de forma previa a la fecundación, utilizando DTSP o fluido oviductal bovino. Cuando se utilizan estos ovocitos en FIV aumenta la monospermia y el rendimiento final. En las interacciones heterólogas los espermatozoides humanos pueden unirse a ZP porcina y sufren la reacción acrosómica, pero no penetran los ovocitos sin ZP. En ICSI activan el ovocito y forman pronúcleos. / The interaction between gametes is crucial to fertilization. The zona pellucida (ZP) is responsible to block of polyspermy, but in vitro these functions are not efficient. The polyspermy is frequently in bovine and porcine in vitro fecundation. Besides the heterologous interaction between spermatozoa-oocyte had been described. The aims were study the block of polyspermy to improve the output of IVF and research the heterologous interactions between human spermatozoa and porcine oocyte.The results show that there is hardening of bovine and porcine ZP previously at fertilization, in vivo and using DTSP or bovine oviductal fluid. When these oocytes are used in IVF improve the monospermy and the output. In heterologus interactions the human spermatozoa could bind to porcine ZP and it triggers the acrosome reaction, but not penetration in ZP-free oocyte was observed. In ICSI the oocyte activation and

La transgénesis es una potente herramienta biotecnológica para la generación de animales modificados genéticamente con aplicaciones en diversas áreas como veterinaria, biomedicina y agricultura. La técnica de transgénesis mediada por espermatozoides (SMGT) se basa en la habilidad intrínseca de las células espermáticas para unir e interiorizar ADN exógeno y permitir su transferencia al interior de los ovocitos tras la fecundación, e integrarse en el genoma del nuevo embrión. El objetivo global de este estudio fue desarrollar un método eficiente de producción in vitro de embriones porcinos y lechones transgénicos aprovechando la capacidad de transferencia de ADN exógeno que presenta el espermatozoide.La combinación de la técnica de ICSI y SMGT es un método eficiente para la producción de lechones y embriones transgénicos, viéndose incrementada su eficiencia mediante el uso de la recombinasa RecA, obteniendo los primeros lechones nacidos en España mediante ICSI, de los cuales 2 fueron transgénicos. / The transgenesis is a powerful biotechnological tool for the generation of genetically modified animal with applications in different areas such as veterinary medicine, biomedicine and agriculture. The technique of sperm mediated gene transfer (SMGT) is based on the intrinsic ability of the spermatozoa to bind exogenous DNA and to allow its transference to the oocytes after fertilization, and to integrate in the genome of the new embryo. The global objective of this study was to develop an efficient method of in vitro production of transgenic embryos and piglets using the spermatozoa capacity to bind to exogenous DNA.The combination of the ICSI technique and SMGT is an efficient method for the production of transgenic embryos and pigs. The efficiency was increased by the use of recombinase RecA, obtaining the first piglets born in Spain by means of ICSI and two of them were transgenic.

En el presente trabajo investigamos las variaciones a lo largo del ciclo estral de la actividad enzimática de 7 exoglicosidasas (alfa-L-fucosidasa, beta-N-acetil-glucosaminidasa, beta-D-galactosidasa, alfa-D-galactosidasa, alfa-D-manosidasa, beta-N-acetil-galactosaminidasa y N-acetil-neuraminidasa), de la cantidad de proteínas y del volumen de fluido oviductal bovino y porcino. El fluido oviductal se obtuvo de hembras prepúbres y adultas sacrificadas en matadero y se clasificó de acuerdo a la morfología ovárica en fluido oviductal en fase folicular (temprana y tardía) y fase luteal (temprana y tardía). Se observaron diferencias significativas a lo largo del ciclo estral en la actividad enzimática de algunas glicosidasas, la cantidad de proteínas y el volumen de fluido obtenido. / In the present work we studied the variations along the estral cycle of 7 different glycosidases (alfa-L-fucosidase, beta-N-acetil-glucosaminidase, beta-D-galactosidase, alfa-D-galactosidase, alfa-D-manosidase, beta-N-acetyl-galactosaminidase and N-acetyl-neuraminidase), of total amount of proteins and volume of bovine and porcine oviductal fluid. Oviductal fluid was obtained from females slaughtered at the abattoir and fluid classified according the ovary morphology into follicular phase (early and late) and luteal phase (early and late). Differences among enzymatic activity, total amount of proteins and volume of oviductal fluid were observed in both species along the estral cycle.