Dissertaçao(mestrado)- Universidade Federal do Rio Grande, Programa de Pós-Graduação em Aqüicultura, Instituto de Oceanografia, 2008. / Submitted by Cristiane Silva (cristiane_gomides@hotmail.com) on 2012-07-10T00:50:00Z No. of bitstreams: 1 CarlosFrederico.pdf: 3216882 bytes, checksum: 2323f88ad7d58d3bbb5164aa5335dd23 (MD5) / Approved for entry into archive by Bruna Vieira(bruninha_vieira@ibest.com.br) on 2012-11-06T16:46:35Z (GMT) No. of bitstreams: 1 CarlosFrederico.pdf: 3216882 bytes, checksum: 2323f88ad7d58d3bbb5164aa5335dd23 (MD5) / Made available in DSpace on 2012-11-06T16:46:35Z (GMT). No. of bitstreams: 1 CarlosFrederico.pdf: 3216882 bytes, checksum: 2323f88ad7d58d3bbb5164aa5335dd23 (MD5) Previous issue date: 2008 / O linguado Paralichthys orbignyanus é um importante recurso pesqueiro do oceano Atlântico Sul e é considerado uma espécie com grande potencial para a aqüicultura. A qualidade do sêmen é uma importante variável no manejo reprodutivo de espécies cultivadas, influenciando diretamente na produção de ovos viáveis. Além disso, o conhecimento das características físicas e químicas do sêmen é um importante fator no desenvolvimento de protocolos de resfriamento e criopreservação do sêmen. O objetivo deste trabalho foi caracterizar o sêmen de P. orbignyanus ao longo da estação reprodutiva e utilizar essas informações para auxiliar no processo de criopreservação do sêmen e no desenvolvimento de um protocolo de transferência de genes mediada por espermatozóides (TGME). Na primeira etapa deste estudo, amostras de sêmen de linguados selvagens foram coletadas ao longo da estação reprodutiva. Através dos resultados obtidos foi verificado que a produção de espermatozóides e a motilidade progressiva aumentam significativamente à medida que a estação reprodutiva progride para o seu final (P<0.05). A motilidade progressiva dos espermatozóides durou em média 10 min, porém o tempo total de motilidade alcançou cerca de 100 min. Com relação ao pH, a osmolalidade e a concentração dos íons K+, Cl- e Mg+ dosados no plasma seminal, assim como, para o percentual de células móveis, nenhuma diferença foi verificada ao longo da estação reprodutiva. No meio da estação foi observada uma diminuição na concentração do íon Ca2+, a qual coincidiu com o menor tempo de motilidade dos espermatozóides. A concentração de Na+ foi aumentando ao longo dos períodos monitorados, atingindo a maior concentração no fim da estação reprodutiva (P<0,05). Na segunda parte deste estudo, a criopreservação do sêmen do linguado P.orbignyanus foi realizada. Para isso, foram testadas duas soluções crioprotetoras: uma contendo glicerol diluído numa solução a base de sais e outra contendo DMSO (dimetilsulfóxido) diluído numa solução à base de sacarose. Os dados de fertilização, eclosão e viabilidade larval demonstraram que as duas soluções utilizadas são eficientes na criopreservação do sêmen do linguado. Na última etapa deste estudo, alguns fatores limitantes na TGME em peixes foram avaliados e um protocolo de incorporação de DNA exógeno pelos espermatozóides foi desenvolvido. Os resultados obtidos nesta parte do trabalho demonstraram que o plasma seminal do P.orbignyanus apresenta uma forte atividade da enzima DNase. Entretanto, a atividade dessa enzima pode ser eliminada ou diminuída lavando o sêmen com soluções contendo EDTA. Além disso,foi verificado que uma quantidade de DNA exógeno similar ou inferior a 50 ng/106 espermatozóides deve ser usada na TGME em peixes. Por último, foi demonstrado que os espermatozóides do linguado P. orbignyanus são capazes de incorporar o DNA exógeno espontaneamente após a eliminação da atividade das DNases. Isto ficou evidente através da amplificação do DNA exógeno através de PCR. Desta forma, os resultados obtidos neste estudo podem auxiliar no manejo reprodutivo dessa espécie e,conseqüentemente, na implementação de programas de melhoramento genético tanto da forma clássica através da criopreservação do sêmen dos reprodutores que apresentam as melhores características fenotípicas, como através de técnicas modernas como a TGME. / The Brazilian flounder Paralichthys orbignyanus is an important fishing resource from southern Atlantic coast of America and it has being considered for aquaculture. The sperm quality is an important variable in reproductive management of cultured species, influencing directly on the production of viable eggs. Moreover, the adequate knowledge of physical and chemical characteristics of the sperm is an important factor for developing short-term storage and cryopreservation protocols of sperm. The aim of this study was to characterize the P. orbignyanus sperm throughout the reproductive season to facilitate the sperm cryopreservation and to help in development of a sperm mediated gene transfer (SMGT) protocol. In the first part of this study, sperm samples were collected from wild flounders throughout the reproductive season. It was verified that the sperm production and the progressive motility of spermatozoa increased significantly towards the end of reproductive season (P<0.05). The mean time of progressive motility of spermatozoa was 10 min, however the total time of motility reached about 100 min. No difference was observed during the reproductive season in pH, osmolality and concentrations of K+, Cl- e Mg+ measured in seminal plasma as well as in percentage of cells motility. In the middle of the breeding season was observed a reduction in Ca+2 concentration which has coincided with the lesser motility time of spermatozoa. The Na+ concentration increased throughout the season, reaching the highest concentration at the end of reproductive period (P<0.05). In the second part of this study, the cryopreservation of the flounder sperm was carried out. Two different cryosolutions were tested: glycerol saline and DMSO - sucrose. The results of fertilization, hatching rate and larval viability demonstrate that both solutions are efficient in the cryopreservation of the flounder sperm. In the last part of this study, some limitant factors for exogenous DNA uptake by spermatozoa were evaluated and a SMGT protocol was developed. It was observed a strong DNase activity in P.orbignyanus seminal plasma. However, it was verified that DNase activity can be eliminated or decreased washing the sperm with EDTA-containing solutions. Moreover, it was verified that an amount of exogenous DNA similar or inferior to 50 ng/106 cells should be used in fish SMGT. At last, it was demonstrated that fish spermatozoa are capable to uptake exogenous DNA spontaneously after DNase activity elimination. This was evidenced through exogenous DNA amplification by PCR. The results of the present study should help in reproductive management of this species and consequently in implementation of genetic improvement programs based not only in the sperm cryopreservation, but also using modern techniques such as SMGT.

Made available in DSpace on 2014-08-20T13:32:59Z (GMT). No. of bitstreams: 1 tese_vinicius_farias_campos.pdf: 556217 bytes, checksum: 4c9dc7811c567f171aaebfafce2d2254 (MD5) Previous issue date: 2011-07-29 / Nanobiotechnology has provided new scientific and technological knowledge in distinct areas making it a priority area of research in developed and developing countries. The sperm-mediated gene transfer (SMGT) technique may become more simple, efficient and cost-effective technique for the generation of transgenic animals. The development of nanocomposites able to carry foreign DNA into the nucleus of cells with greater efficiency allows techniques such as SMGT be improved. The NanoSMGT is a technique used to generate transgenic animals in which nanotechnology is used to enhance the ability of sperm to capture exogenous DNA. The objective of this study was to determine whether cationic nanopolymer or halloysite clay nanotubes are able to transfect the exogenous DNA to unsorted and sex-sorted bovine sperm then evaluate whether these sperm are able to transmit transgene to in vitro fertilized bovine embryos. Using real-time PCR, we found that the cationic nanopolymer is capable of introducing exogenous DNA into unsorted and sex-sorted bovine sperm without negative effects to sperm motility and viability. Was also demonstrated for the first time that cationic nanopolymer or halloysite clay nanotubes are able to increase both the sperm DNA transfection of as the transmission of the transgene to bovine embryos produced in vitro. These results demonstrate that NanoSMGT can be a viable technique for producing transgenic bovine embryos. / A nanobiotecnologia tem proporcionado novos avanços científicos e tecnológicos em diversas áreas do conhecimento tornando-se assim área de pesquisa prioritária em países desenvolvidos e em desenvolvimento. A transferência gênica mediada por espermatozóides (SMGT) poderá se tornar a técnica mais simples, eficiente e com melhor custo-benefício para a geração de animais transgênicos. O desenvolvimento de nanocompósitos capazes de carrear o DNA exógeno para o interior de células com maior eficiência permite que técnicas como a SMGT sejam aperfeiçoadas. A NanoSMGT é uma técnica utilizada para a geração de animais transgênicos onde a nanotecnologia é utilizada para incrementar a habilidade dos espermatozóides em capurar o DNA exógeno. O objetivo do presente trabalho foi de verificar se nanopolímero catiônico ou nanotubos de haloisita são capazes de transfectar o DNA exógeno para o interior de espermatozóides bovinos sexados e não sexados e em seguida verificar se estes espermatozóides transfectados são capazes de gerar embriões bovinos transgênicos. Utilizando PCR em tempo real, verificou-se que o nanopolímero catiônico é capaz de introduzir o DNA exógeno em espermatozóides bovinos sexados e não sexados sem danos para a motilidade e viabilidade espermática. Também foi demonstrado pela primeira vez que o nanopolímero catiônico ou os nanotubos de haloisita são capazes de incrementar tanto a transfecção de DNA em espermatozóides como a transmissão do transgene para embriões bovinos produzidos in vitro. Estes resultados demonstram que a NanoSMGT pode ser uma técnica viável para a produção de embriões bovinos transgênicos.

Muitas das técnicas utilizadas para gerar animais transgênicos são caras e laboriosas. Neste contexto, a transferência gênica mediada por espermatozóides (TGME) pode ser uma alternativa para a produção em larga escala de animais transgênicos. Estudos de SMGT têm seu foco no número de cópias de DNA incorporada pelo espermatozóide. Por isso, há pouca informação disponível sobre como as moléculas de DNA se comportam durante o processo de fecundação e quais os efeitos dos protocolos de TGME sobre a célula espermática. Neste sentido, com o objetivo de avaliar a existência de sitio de integração preferencial das moléculas exógenas de DNA no genoma hospedeiro, utilizamos a hibridização in situ para acompanhar a veiculação do transgene durante o processo de fecundação. Foram avaliadas as membranas acrossomais, plasmática e potencial de membrana mitocondrial de espermatozóides submetidos a TGME. Para isso, o sêmen de três diferentes touros foram submetidos ao gradiente de Percoll 45-90%. As células viáveis foram incubadas com o vetor recombinante pCX-EGFP (0, 250, 500 ou 1000ng/106 células) seguidas ou não de eletroporação (300v, 35µF e 0,25ms). Os espermatozóides tratados foram utilizados para a produção in vitro de embriões. Os embriões foram cultivados por sete dias até o estágio de blastocisto. Espermatozóides e embriões produzidos in vitro foram submetidos ao ensaio de hibridização in situ, com metodologia descrita Whyte et al. (2000). O potencial de membrana mitocondrial (PMM), integridade de membrana acrossomal (MA) e plasmática (MP) foram avaliados por citometria de fluxo (Guava Technologies, Hayward, CA, USA) utilizando as sondas fluorescentes JC1, FITC-PSA e PI (Molecular Probes), respectivamente. Os dados foram analisados pelo teste paramétrico ANOVA (teste LSD) usando o programa estatístico SAS for Windows, com nível de significância de 5%. A hibridização in situ não foi possível em espermatozóides bovinos, pois não houve hibridação da sonda controle. Blastocistos oriundos de espermatozóides incubados com DNA exógeno apresentaram integração de forma difusa, embriões oriundos de espermatozóides eletroporados apresentaram integração pontual. As diferentes concentrações de DNA não exerceram efeitos deletérios nas MP ou PMM, a adição de 500ng de DNA causou aumento de lesão na MA (p<0,05). A eletroporação não afeta a MP e MA, mais apresenta grande efeito no PMM causando redução da função mitocondrial. Este estudo conclui que maiores esforços são necessários para elucidar o comportamento das moléculas exógenas de DNA durante o processo de fecundação e quais são os efeitos da TGME sobre a célula espermática. / Most techniques used to produce transgenic animals are laborious and expensive. In this manner, sperm mediated gene transfer (SMGT) may be a viable alternative for long-scale production of transgenic animals. Many SMGT studies have focused the DNA internalization and number of DNA copies incorporated by spermatozoa. However, limited data is available about how foreign DNA molecules behave during fertilization and the direct effects of the SMGT technique on sperm cells. Hence, in order to monitor the existence of preferential integration sites by the exogenous DNA at the host genome, in situ hybridization was used to track the transgene conveyance during in vitro fertilization. In addition, acrosome and plasmatic membrane integrity and mitochondrial membrane potential of sperm cells subjected to SMGT were assessed. Briefly, thawed semen from three different bulls was submitted to a 45- 90% Percoll gradient. Viable cells were incubated with recombinant PCX-EGFP vector (0, 250, 500 or 1000ng/106 sperm cells) or incubated and electroporated (300V, 35µF and 0.25ms). Treated sperm cells were then used for in vitro production of embryos. Embryos were in vitro cultured for 7 days until blastocyst stage. Treated spermatozoa and in vitro produced blastocysts were submitted to in situ hybridization assay, as described by Whyte et al. (2000). The mitochondrial membrane potential (MMP), acrosomal membrane (AM) and plasmatic membrane (PM) integrity were assessed by flow cytometry (Guava Technologies, Hayward, CA, USA) using JC1, FITC-PSA and PI probes (Molecular Probes), respectively. Data were analyzed by parametric ANOVA (LSD test) using SAS for Windows software, at a 5% level. The transgene was not observed at the bovine spermatozoa because the control probe could not be hybridized. In situ hybridization revealed that blastocysts produced from incubated sperm cells had a diffuse foreign DNA integration while blastocysts produced from electroporated sperm cells had a punctual DNA integration. No deleterious effects of exogenous DNA concentrations on PM or MMP were observed. However, the addition of 500ng of exogenous DNA caused sperm AM injury (P<0.05). Electroporation did not affect PM or AM integrity, but it had a great effect on MMP, which may cause a reduction of mitochondrial function. This study suggest that more efforts are needed to elucidate the behavior of exogenous DNA during fertilization and the effects of SMGT in bovine sperm cells.

La transgénesis es una potente herramienta biotecnológica para la generación de animales modificados genéticamente con aplicaciones en diversas áreas como veterinaria, biomedicina y agricultura. La técnica de transgénesis mediada por espermatozoides (SMGT) se basa en la habilidad intrínseca de las células espermáticas para unir e interiorizar ADN exógeno y permitir su transferencia al interior de los ovocitos tras la fecundación, e integrarse en el genoma del nuevo embrión. El objetivo global de este estudio fue desarrollar un método eficiente de producción in vitro de embriones porcinos y lechones transgénicos aprovechando la capacidad de transferencia de ADN exógeno que presenta el espermatozoide.La combinación de la técnica de ICSI y SMGT es un método eficiente para la producción de lechones y embriones transgénicos, viéndose incrementada su eficiencia mediante el uso de la recombinasa RecA, obteniendo los primeros lechones nacidos en España mediante ICSI, de los cuales 2 fueron transgénicos. / The transgenesis is a powerful biotechnological tool for the generation of genetically modified animal with applications in different areas such as veterinary medicine, biomedicine and agriculture. The technique of sperm mediated gene transfer (SMGT) is based on the intrinsic ability of the spermatozoa to bind exogenous DNA and to allow its transference to the oocytes after fertilization, and to integrate in the genome of the new embryo. The global objective of this study was to develop an efficient method of in vitro production of transgenic embryos and piglets using the spermatozoa capacity to bind to exogenous DNA.The combination of the ICSI technique and SMGT is an efficient method for the production of transgenic embryos and pigs. The efficiency was increased by the use of recombinase RecA, obtaining the first piglets born in Spain by means of ICSI and two of them were transgenic.

Muitas das técnicas utilizadas para gerar animais transgênicos são caras e laboriosas. Neste contexto, a transferência gênica mediada por espermatozóides (TGME) pode ser uma alternativa para a produção em larga escala de animais transgênicos. Estudos de SMGT têm seu foco no número de cópias de DNA incorporada pelo espermatozóide. Por isso, há pouca informação disponível sobre como as moléculas de DNA se comportam durante o processo de fecundação e quais os efeitos dos protocolos de TGME sobre a célula espermática. Neste sentido, com o objetivo de avaliar a existência de sitio de integração preferencial das moléculas exógenas de DNA no genoma hospedeiro, utilizamos a hibridização in situ para acompanhar a veiculação do transgene durante o processo de fecundação. Foram avaliadas as membranas acrossomais, plasmática e potencial de membrana mitocondrial de espermatozóides submetidos a TGME. Para isso, o sêmen de três diferentes touros foram submetidos ao gradiente de Percoll 45-90%. As células viáveis foram incubadas com o vetor recombinante pCX-EGFP (0, 250, 500 ou 1000ng/106 células) seguidas ou não de eletroporação (300v, 35µF e 0,25ms). Os espermatozóides tratados foram utilizados para a produção in vitro de embriões. Os embriões foram cultivados por sete dias até o estágio de blastocisto. Espermatozóides e embriões produzidos in vitro foram submetidos ao ensaio de hibridização in situ, com metodologia descrita Whyte et al. (2000). O potencial de membrana mitocondrial (PMM), integridade de membrana acrossomal (MA) e plasmática (MP) foram avaliados por citometria de fluxo (Guava Technologies, Hayward, CA, USA) utilizando as sondas fluorescentes JC1, FITC-PSA e PI (Molecular Probes), respectivamente. Os dados foram analisados pelo teste paramétrico ANOVA (teste LSD) usando o programa estatístico SAS for Windows, com nível de significância de 5%. A hibridização in situ não foi possível em espermatozóides bovinos, pois não houve hibridação da sonda controle. Blastocistos oriundos de espermatozóides incubados com DNA exógeno apresentaram integração de forma difusa, embriões oriundos de espermatozóides eletroporados apresentaram integração pontual. As diferentes concentrações de DNA não exerceram efeitos deletérios nas MP ou PMM, a adição de 500ng de DNA causou aumento de lesão na MA (p<0,05). A eletroporação não afeta a MP e MA, mais apresenta grande efeito no PMM causando redução da função mitocondrial. Este estudo conclui que maiores esforços são necessários para elucidar o comportamento das moléculas exógenas de DNA durante o processo de fecundação e quais são os efeitos da TGME sobre a célula espermática. / Most techniques used to produce transgenic animals are laborious and expensive. In this manner, sperm mediated gene transfer (SMGT) may be a viable alternative for long-scale production of transgenic animals. Many SMGT studies have focused the DNA internalization and number of DNA copies incorporated by spermatozoa. However, limited data is available about how foreign DNA molecules behave during fertilization and the direct effects of the SMGT technique on sperm cells. Hence, in order to monitor the existence of preferential integration sites by the exogenous DNA at the host genome, in situ hybridization was used to track the transgene conveyance during in vitro fertilization. In addition, acrosome and plasmatic membrane integrity and mitochondrial membrane potential of sperm cells subjected to SMGT were assessed. Briefly, thawed semen from three different bulls was submitted to a 45- 90% Percoll gradient. Viable cells were incubated with recombinant PCX-EGFP vector (0, 250, 500 or 1000ng/106 sperm cells) or incubated and electroporated (300V, 35µF and 0.25ms). Treated sperm cells were then used for in vitro production of embryos. Embryos were in vitro cultured for 7 days until blastocyst stage. Treated spermatozoa and in vitro produced blastocysts were submitted to in situ hybridization assay, as described by Whyte et al. (2000). The mitochondrial membrane potential (MMP), acrosomal membrane (AM) and plasmatic membrane (PM) integrity were assessed by flow cytometry (Guava Technologies, Hayward, CA, USA) using JC1, FITC-PSA and PI probes (Molecular Probes), respectively. Data were analyzed by parametric ANOVA (LSD test) using SAS for Windows software, at a 5% level. The transgene was not observed at the bovine spermatozoa because the control probe could not be hybridized. In situ hybridization revealed that blastocysts produced from incubated sperm cells had a diffuse foreign DNA integration while blastocysts produced from electroporated sperm cells had a punctual DNA integration. No deleterious effects of exogenous DNA concentrations on PM or MMP were observed. However, the addition of 500ng of exogenous DNA caused sperm AM injury (P<0.05). Electroporation did not affect PM or AM integrity, but it had a great effect on MMP, which may cause a reduction of mitochondrial function. This study suggest that more efforts are needed to elucidate the behavior of exogenous DNA during fertilization and the effects of SMGT in bovine sperm cells.