Dissertaçao(mestrado)- Universidade Federal do Rio Grande, Programa de Pós-Graduação em Aqüicultura, Instituto de Oceanografia, 2008. / Submitted by Cristiane Silva (cristiane_gomides@hotmail.com) on 2012-07-10T00:50:00Z No. of bitstreams: 1 CarlosFrederico.pdf: 3216882 bytes, checksum: 2323f88ad7d58d3bbb5164aa5335dd23 (MD5) / Approved for entry into archive by Bruna Vieira(bruninha_vieira@ibest.com.br) on 2012-11-06T16:46:35Z (GMT) No. of bitstreams: 1 CarlosFrederico.pdf: 3216882 bytes, checksum: 2323f88ad7d58d3bbb5164aa5335dd23 (MD5) / Made available in DSpace on 2012-11-06T16:46:35Z (GMT). No. of bitstreams: 1 CarlosFrederico.pdf: 3216882 bytes, checksum: 2323f88ad7d58d3bbb5164aa5335dd23 (MD5) Previous issue date: 2008 / O linguado Paralichthys orbignyanus é um importante recurso pesqueiro do oceano Atlântico Sul e é considerado uma espécie com grande potencial para a aqüicultura. A qualidade do sêmen é uma importante variável no manejo reprodutivo de espécies cultivadas, influenciando diretamente na produção de ovos viáveis. Além disso, o conhecimento das características físicas e químicas do sêmen é um importante fator no desenvolvimento de protocolos de resfriamento e criopreservação do sêmen. O objetivo deste trabalho foi caracterizar o sêmen de P. orbignyanus ao longo da estação reprodutiva e utilizar essas informações para auxiliar no processo de criopreservação do sêmen e no desenvolvimento de um protocolo de transferência de genes mediada por espermatozóides (TGME). Na primeira etapa deste estudo, amostras de sêmen de linguados selvagens foram coletadas ao longo da estação reprodutiva. Através dos resultados obtidos foi verificado que a produção de espermatozóides e a motilidade progressiva aumentam significativamente à medida que a estação reprodutiva progride para o seu final (P<0.05). A motilidade progressiva dos espermatozóides durou em média 10 min, porém o tempo total de motilidade alcançou cerca de 100 min. Com relação ao pH, a osmolalidade e a concentração dos íons K+, Cl- e Mg+ dosados no plasma seminal, assim como, para o percentual de células móveis, nenhuma diferença foi verificada ao longo da estação reprodutiva. No meio da estação foi observada uma diminuição na concentração do íon Ca2+, a qual coincidiu com o menor tempo de motilidade dos espermatozóides. A concentração de Na+ foi aumentando ao longo dos períodos monitorados, atingindo a maior concentração no fim da estação reprodutiva (P<0,05). Na segunda parte deste estudo, a criopreservação do sêmen do linguado P.orbignyanus foi realizada. Para isso, foram testadas duas soluções crioprotetoras: uma contendo glicerol diluído numa solução a base de sais e outra contendo DMSO (dimetilsulfóxido) diluído numa solução à base de sacarose. Os dados de fertilização, eclosão e viabilidade larval demonstraram que as duas soluções utilizadas são eficientes na criopreservação do sêmen do linguado. Na última etapa deste estudo, alguns fatores limitantes na TGME em peixes foram avaliados e um protocolo de incorporação de DNA exógeno pelos espermatozóides foi desenvolvido. Os resultados obtidos nesta parte do trabalho demonstraram que o plasma seminal do P.orbignyanus apresenta uma forte atividade da enzima DNase. Entretanto, a atividade dessa enzima pode ser eliminada ou diminuída lavando o sêmen com soluções contendo EDTA. Além disso,foi verificado que uma quantidade de DNA exógeno similar ou inferior a 50 ng/106 espermatozóides deve ser usada na TGME em peixes. Por último, foi demonstrado que os espermatozóides do linguado P. orbignyanus são capazes de incorporar o DNA exógeno espontaneamente após a eliminação da atividade das DNases. Isto ficou evidente através da amplificação do DNA exógeno através de PCR. Desta forma, os resultados obtidos neste estudo podem auxiliar no manejo reprodutivo dessa espécie e,conseqüentemente, na implementação de programas de melhoramento genético tanto da forma clássica através da criopreservação do sêmen dos reprodutores que apresentam as melhores características fenotípicas, como através de técnicas modernas como a TGME. / The Brazilian flounder Paralichthys orbignyanus is an important fishing resource from southern Atlantic coast of America and it has being considered for aquaculture. The sperm quality is an important variable in reproductive management of cultured species, influencing directly on the production of viable eggs. Moreover, the adequate knowledge of physical and chemical characteristics of the sperm is an important factor for developing short-term storage and cryopreservation protocols of sperm. The aim of this study was to characterize the P. orbignyanus sperm throughout the reproductive season to facilitate the sperm cryopreservation and to help in development of a sperm mediated gene transfer (SMGT) protocol. In the first part of this study, sperm samples were collected from wild flounders throughout the reproductive season. It was verified that the sperm production and the progressive motility of spermatozoa increased significantly towards the end of reproductive season (P<0.05). The mean time of progressive motility of spermatozoa was 10 min, however the total time of motility reached about 100 min. No difference was observed during the reproductive season in pH, osmolality and concentrations of K+, Cl- e Mg+ measured in seminal plasma as well as in percentage of cells motility. In the middle of the breeding season was observed a reduction in Ca+2 concentration which has coincided with the lesser motility time of spermatozoa. The Na+ concentration increased throughout the season, reaching the highest concentration at the end of reproductive period (P<0.05). In the second part of this study, the cryopreservation of the flounder sperm was carried out. Two different cryosolutions were tested: glycerol saline and DMSO - sucrose. The results of fertilization, hatching rate and larval viability demonstrate that both solutions are efficient in the cryopreservation of the flounder sperm. In the last part of this study, some limitant factors for exogenous DNA uptake by spermatozoa were evaluated and a SMGT protocol was developed. It was observed a strong DNase activity in P.orbignyanus seminal plasma. However, it was verified that DNase activity can be eliminated or decreased washing the sperm with EDTA-containing solutions. Moreover, it was verified that an amount of exogenous DNA similar or inferior to 50 ng/106 cells should be used in fish SMGT. At last, it was demonstrated that fish spermatozoa are capable to uptake exogenous DNA spontaneously after DNase activity elimination. This was evidenced through exogenous DNA amplification by PCR. The results of the present study should help in reproductive management of this species and consequently in implementation of genetic improvement programs based not only in the sperm cryopreservation, but also using modern techniques such as SMGT.

CoordenaÃÃo de AperfeiÃoamento de Pessoal de NÃvel Superior / O estudo trata da induÃÃo anestÃsica, caracterizaÃÃo do lÃquido seminal, refrigeraÃÃo e congelaÃÃo do sÃmen de tilÃpia-do-Nilo, Oreochromis niloticus. No primeiro capÃtulo foram testados os anestÃsicos naturais mentol e eugenol em espÃcimes adultos objetivando determinar a concentraÃÃo ideal para manejo de tilÃpia-do-Nilo. No segundo capÃtulo, o lÃquido seminal da tilÃpia-do-Nilo foi caracterizado de acordo com os seguintes parÃmetros: volume coletado, que revelou a viabilidade de coleta em volumes suficientes, sem a necessidade de sacrificar o peixe; concentraÃÃo espermÃtica, que mostrou relevante variaÃÃo entre espÃcimes; pH e osmolaridade, que ratificam as informaÃÃes presentes na literatura; tempo de motilidade, que comprovou ser o espermatozoide de tilÃpia diferenciado quanto à energia acumulada quando comparado a outras espÃcies de Ãgua doce; e morfometria da cabeÃa do espermatozoide por meio das seguintes medidas: comprimento, largura, perÃmetro e Ãrea. TambÃm foram registrados quatro parÃmetros derivados do formato da cabeÃa: elipticidade, rugosidade, elongaÃÃo e regularidade. No terceiro capÃtulo foi avaliada a viabilidade do sÃmen de tilÃpia-do-Nilo submetido a diferentes diluentes e refrigerado a 4ÂC. A avaliaÃÃo foi realizada por meio da taxa de motilidade espermÃtica determinada pelo sistema CASA (Computer Assisted Sperm Analysis). Neste, o ACP-104, diluente à base de Ãgua de coco em pÃ, ofereceu melhor taxa de motilidade dos espermatozoides por atà 72 horas de estocagem. Esta resposta mostrou que o ACP-104 à um diluente promissor para o sÃmen da referida espÃcie. No quarto capÃtulo foi avaliado o efeito de diferentes criodiluentes sobre do sÃmen de tilÃpia-do-Nilo pÃs-descongelaÃÃo, utilizando o software (Sperm Class Analyser, SCA). Os resultados de motilidade espermÃtica e de parÃmetros de velocidade do espermatozoide revelaram que o ACP-104 combinado ao dimetilsulfÃxido apresenta-se como um criodiluente promissor para a criopreservaÃÃo do sÃmen de tilÃpia-do-Nilo em longo prazo. / The present study deals with anesthetic induction, characterization of sperm fluid, cooling and freezing of sperm of the Nile tilapia Oreochromis niloticus. In the first chapter the natural anesthetics menthol and eugenol were tested in adult specimens aiming to determine the ideal concentration for handling the Nile tilapia. In the second chapter the sperm fluid of the Nile tilapia was characterized according to the following parameters: collected volume, which showed the feasibility of collect in sufficient volume without the need of sacrificing the fish; sperm concentration, which showed significant variation between specimens; pH and osmolarity, which confirm the information of the literature; sperm motility time, which proved that the spermatozoa of tilapia are differentiated concerning accumulated energy when compared to other freshwater species; and sperm head morphometry, characterized by size (length, width, perimeter and area) and head shape (ellipticity, rugosity, elongation and regularity). In the third chapter we evaluated the feasibility of preservation of tilapia sperm using different extenders and cooled at 4ÂC. The sperm motility rate was evaluated with the aid of the Computer-assisted Sperm Analyzer (CASA) System. In this, the ACP-104, media based on powdered coconut water, showed best sperm motility rate for up to 72 hours after storage. In the fourth chapter was evaluated the effects of different cryoprotectants on the post-thaw Nile tilapia sperm, using the software Sperm Class Analyzer (SCA). The results of the sperm motility rate and sperm velocity parameters revealed that ACP-104 in combination with dimethylsulfoxide is a promising cryodiluent for Nile tilapia sperm in long-term conservation.

TEIXEIRA, Erivânia Gomes. Caracterização, resfriamento e criopreservação de sêmen de tilápia-do-nilo cultivada no estado do Ceará. 2013. 92 f. : Tese (doutorado) - Universidade Federal do Ceará, Centro de Ciências Agrárias, Departamento de Engenharia de Pesca, Fortaleza-CE, 20113 / Submitted by Nádja Goes (nmoraissoares@gmail.com) on 2016-07-26T12:26:41Z No. of bitstreams: 1 2013_tese_egteixeira.pdf: 1255411 bytes, checksum: 260b5caf7b5bf38819e087108c82096e (MD5) / Approved for entry into archive by Nádja Goes (nmoraissoares@gmail.com) on 2016-07-26T12:26:56Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2013_tese_egteixeira.pdf: 1255411 bytes, checksum: 260b5caf7b5bf38819e087108c82096e (MD5) / Made available in DSpace on 2016-07-26T12:26:56Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2013_tese_egteixeira.pdf: 1255411 bytes, checksum: 260b5caf7b5bf38819e087108c82096e (MD5) Previous issue date: 2013 / The present study deals with anesthetic induction, characterization of sperm fluid, cooling and freezing of sperm of the Nile tilapia Oreochromis niloticus. In the first chapter the natural anesthetics menthol and eugenol were tested in adult specimens aiming to determine the ideal concentration for handling the Nile tilapia. In the second chapter the sperm fluid of the Nile tilapia was characterized according to the following parameters: collected volume, which showed the feasibility of collect in sufficient volume without the need of sacrificing the fish; sperm concentration, which showed significant variation between specimens; pH and osmolarity, which confirm the information of the literature; sperm motility time, which proved that the spermatozoa of tilapia are differentiated concerning accumulated energy when compared to other freshwater species; and sperm head morphometry, characterized by size (length, width, perimeter and area) and head shape (ellipticity, rugosity, elongation and regularity). In the third chapter we evaluated the feasibility of preservation of tilapia sperm using different extenders and cooled at 4°C. The sperm motility rate was evaluated with the aid of the Computer-assisted Sperm Analyzer (CASA) System. In this, the ACP-104, media based on powdered coconut water, showed best sperm motility rate for up to 72 hours after storage. In the fourth chapter was evaluated the effects of different cryoprotectants on the post-thaw Nile tilapia sperm, using the software Sperm Class Analyzer (SCA). The results of the sperm motility rate and sperm velocity parameters revealed that ACP-104 in combination with dimethylsulfoxide is a promising cryodiluent for Nile tilapia sperm in long-term conservation. / O estudo trata da indução anestésica, caracterização do líquido seminal, refrigeração e congelação do sêmen de tilápia-do-Nilo, Oreochromis niloticus. No primeiro capítulo foram testados os anestésicos naturais mentol e eugenol em espécimes adultos objetivando determinar a concentração ideal para manejo de tilápia-do-Nilo. No segundo capítulo, o líquido seminal da tilápia-do-Nilo foi caracterizado de acordo com os seguintes parâmetros: volume coletado, que revelou a viabilidade de coleta em volumes suficientes, sem a necessidade de sacrificar o peixe; concentração espermática, que mostrou relevante variação entre espécimes; pH e osmolaridade, que ratificam as informações presentes na literatura; tempo de motilidade, que comprovou ser o espermatozoide de tilápia diferenciado quanto à energia acumulada quando comparado a outras espécies de água doce; e morfometria da cabeça do espermatozoide por meio das seguintes medidas: comprimento, largura, perímetro e área. Também foram registrados quatro parâmetros derivados do formato da cabeça: elipticidade, rugosidade, elongação e regularidade. No terceiro capítulo foi avaliada a viabilidade do sêmen de tilápia-do-Nilo submetido a diferentes diluentes e refrigerado a 4°C. A avaliação foi realizada por meio da taxa de motilidade espermática determinada pelo sistema CASA (Computer Assisted Sperm Analysis). Neste, o ACP-104, diluente à base de água de coco em pó, ofereceu melhor taxa de motilidade dos espermatozoides por até 72 horas de estocagem. Esta resposta mostrou que o ACP-104 é um diluente promissor para o sêmen da referida espécie. No quarto capítulo foi avaliado o efeito de diferentes criodiluentes sobre do sêmen de tilápia-do-Nilo pós-descongelação, utilizando o software (Sperm Class Analyser, SCA). Os resultados de motilidade espermática e de parâmetros de velocidade do espermatozoide revelaram que o ACP-104 combinado ao dimetilsulfóxido apresenta-se como um criodiluente promissor para a criopreservação do sêmen de tilápia-do-Nilo em longo prazo.