Dissertaçao(mestrado)- Universidade Federal do Rio Grande, Programa de Pós-Graduação em Aqüicultura, Instituto de Oceanografia, 2008. / Submitted by Cristiane Silva (cristiane_gomides@hotmail.com) on 2012-07-10T00:50:00Z No. of bitstreams: 1 CarlosFrederico.pdf: 3216882 bytes, checksum: 2323f88ad7d58d3bbb5164aa5335dd23 (MD5) / Approved for entry into archive by Bruna Vieira(bruninha_vieira@ibest.com.br) on 2012-11-06T16:46:35Z (GMT) No. of bitstreams: 1 CarlosFrederico.pdf: 3216882 bytes, checksum: 2323f88ad7d58d3bbb5164aa5335dd23 (MD5) / Made available in DSpace on 2012-11-06T16:46:35Z (GMT). No. of bitstreams: 1 CarlosFrederico.pdf: 3216882 bytes, checksum: 2323f88ad7d58d3bbb5164aa5335dd23 (MD5) Previous issue date: 2008 / O linguado Paralichthys orbignyanus é um importante recurso pesqueiro do oceano Atlântico Sul e é considerado uma espécie com grande potencial para a aqüicultura. A qualidade do sêmen é uma importante variável no manejo reprodutivo de espécies cultivadas, influenciando diretamente na produção de ovos viáveis. Além disso, o conhecimento das características físicas e químicas do sêmen é um importante fator no desenvolvimento de protocolos de resfriamento e criopreservação do sêmen. O objetivo deste trabalho foi caracterizar o sêmen de P. orbignyanus ao longo da estação reprodutiva e utilizar essas informações para auxiliar no processo de criopreservação do sêmen e no desenvolvimento de um protocolo de transferência de genes mediada por espermatozóides (TGME). Na primeira etapa deste estudo, amostras de sêmen de linguados selvagens foram coletadas ao longo da estação reprodutiva. Através dos resultados obtidos foi verificado que a produção de espermatozóides e a motilidade progressiva aumentam significativamente à medida que a estação reprodutiva progride para o seu final (P<0.05). A motilidade progressiva dos espermatozóides durou em média 10 min, porém o tempo total de motilidade alcançou cerca de 100 min. Com relação ao pH, a osmolalidade e a concentração dos íons K+, Cl- e Mg+ dosados no plasma seminal, assim como, para o percentual de células móveis, nenhuma diferença foi verificada ao longo da estação reprodutiva. No meio da estação foi observada uma diminuição na concentração do íon Ca2+, a qual coincidiu com o menor tempo de motilidade dos espermatozóides. A concentração de Na+ foi aumentando ao longo dos períodos monitorados, atingindo a maior concentração no fim da estação reprodutiva (P<0,05). Na segunda parte deste estudo, a criopreservação do sêmen do linguado P.orbignyanus foi realizada. Para isso, foram testadas duas soluções crioprotetoras: uma contendo glicerol diluído numa solução a base de sais e outra contendo DMSO (dimetilsulfóxido) diluído numa solução à base de sacarose. Os dados de fertilização, eclosão e viabilidade larval demonstraram que as duas soluções utilizadas são eficientes na criopreservação do sêmen do linguado. Na última etapa deste estudo, alguns fatores limitantes na TGME em peixes foram avaliados e um protocolo de incorporação de DNA exógeno pelos espermatozóides foi desenvolvido. Os resultados obtidos nesta parte do trabalho demonstraram que o plasma seminal do P.orbignyanus apresenta uma forte atividade da enzima DNase. Entretanto, a atividade dessa enzima pode ser eliminada ou diminuída lavando o sêmen com soluções contendo EDTA. Além disso,foi verificado que uma quantidade de DNA exógeno similar ou inferior a 50 ng/106 espermatozóides deve ser usada na TGME em peixes. Por último, foi demonstrado que os espermatozóides do linguado P. orbignyanus são capazes de incorporar o DNA exógeno espontaneamente após a eliminação da atividade das DNases. Isto ficou evidente através da amplificação do DNA exógeno através de PCR. Desta forma, os resultados obtidos neste estudo podem auxiliar no manejo reprodutivo dessa espécie e,conseqüentemente, na implementação de programas de melhoramento genético tanto da forma clássica através da criopreservação do sêmen dos reprodutores que apresentam as melhores características fenotípicas, como através de técnicas modernas como a TGME. / The Brazilian flounder Paralichthys orbignyanus is an important fishing resource from southern Atlantic coast of America and it has being considered for aquaculture. The sperm quality is an important variable in reproductive management of cultured species, influencing directly on the production of viable eggs. Moreover, the adequate knowledge of physical and chemical characteristics of the sperm is an important factor for developing short-term storage and cryopreservation protocols of sperm. The aim of this study was to characterize the P. orbignyanus sperm throughout the reproductive season to facilitate the sperm cryopreservation and to help in development of a sperm mediated gene transfer (SMGT) protocol. In the first part of this study, sperm samples were collected from wild flounders throughout the reproductive season. It was verified that the sperm production and the progressive motility of spermatozoa increased significantly towards the end of reproductive season (P<0.05). The mean time of progressive motility of spermatozoa was 10 min, however the total time of motility reached about 100 min. No difference was observed during the reproductive season in pH, osmolality and concentrations of K+, Cl- e Mg+ measured in seminal plasma as well as in percentage of cells motility. In the middle of the breeding season was observed a reduction in Ca+2 concentration which has coincided with the lesser motility time of spermatozoa. The Na+ concentration increased throughout the season, reaching the highest concentration at the end of reproductive period (P<0.05). In the second part of this study, the cryopreservation of the flounder sperm was carried out. Two different cryosolutions were tested: glycerol saline and DMSO - sucrose. The results of fertilization, hatching rate and larval viability demonstrate that both solutions are efficient in the cryopreservation of the flounder sperm. In the last part of this study, some limitant factors for exogenous DNA uptake by spermatozoa were evaluated and a SMGT protocol was developed. It was observed a strong DNase activity in P.orbignyanus seminal plasma. However, it was verified that DNase activity can be eliminated or decreased washing the sperm with EDTA-containing solutions. Moreover, it was verified that an amount of exogenous DNA similar or inferior to 50 ng/106 cells should be used in fish SMGT. At last, it was demonstrated that fish spermatozoa are capable to uptake exogenous DNA spontaneously after DNase activity elimination. This was evidenced through exogenous DNA amplification by PCR. The results of the present study should help in reproductive management of this species and consequently in implementation of genetic improvement programs based not only in the sperm cryopreservation, but also using modern techniques such as SMGT.

Made available in DSpace on 2014-08-20T13:32:53Z (GMT). No. of bitstreams: 1 dissertacao_vinicius_campos.pdf: 483644 bytes, checksum: 9caf292597102dea88bfa2da68dc9158 (MD5) Previous issue date: 2009-03-03 / Food intake in vertebrates is a complex process involving several endocrine and neural pathways. Among the orexigenic factors, the most notably are the neuropetides as the neuropeptide Y (NPY) that is a 36 amino acid peptide which plays a key role in food intake. Studies evaluating fish NPY expression showed that this peptide is involved in appetite stimulation. However, despite the recent advances, our present knowledge of the regulation of feeding behavior in fish is limited and based in a few fish species, and there is increasing evidence of speciesspecific differences. The Brazilian flounder Paralichthys orbignyanus is being considered for aquaculture, and it is important to understand the mechanisms regulating feeding in order to improve its performance in captivity. The objectives of this study were to clone NPY cDNA, evaluate the mRNA levels in different tissues of flounder, and also evaluate brain NPY expression during 24 h by real-time RT-PCR. A 597 bp NPY cDNA was cloned from Brazilian flounder brain by 3´RACE method. NPY expression was detected in all peripheral tissues analyzed, but with predominant expression in the brain. No significant differences were observed in brain NPY gene expression over a 24 h evaluation period. No correlation was observed among plasma glucose, total protein, cholesterol, triglycerides and NPY expression levels during 24 hours. These results indicated that NPY may play roles in flounder peripheral tissues and may be not involved short-term regulation of food intake at low-temperatures in Brazilian flounder. / O apetite e a ingestão de alimentos em vertebrados é um processo complexo que envolve várias rotas neurais e endócrinas. Dentre os fatores orexigênicos, destacamse os neuropeptídeos, como o neuropeptídeo Y (NPY), o qual é constituído de 36 aminoácidos e desempenha papel chave na regulação do apetite. Estudos avaliando a expressão do NPY em peixes demonstraram que este peptídeo está envolvido no estímulo da ingestão. Entretanto, apesar dos avanços recentes, o atual conhecimento sobre a regulação fisiológica do apetite é limitado e baseado em poucas espécies de peixes com evidencias de diferenças interespecíficas. O linguado Paralichthys orbignyanus tem sido considerado para a aqüicultura e com isso, torna-se importante compreender os mecanismos de regulação do apetite para incrementar o seu desempenho em cativeiro. Os objetivos deste trabalho compreenderam clonar o gene do NPY, avaliar os níveis de RNA mensageiro nos diferentes tecidos do linguado e também avaliar a expressão do NPY no cérebro durante 24 h por RT-PCR em tempo real. Um fragmento de 597 pb do cDNA do NPY foi clonado a partir do RNAm do cérebro do linguado através do método RACE 3 . A expressão do NPY foi detectada em todos os tecidos analisados (cérebro, baço, coração, intestino, estômago, brânquia, fígado, rim, músculo e testículo), mas com predominante expressão no cérebro. A expressão do NPY não cérebro demonstrou variações durante 24 horas de avaliação. Nenhuma correlação foi observada entre glicose, proteínas totais, colesterol e triglicerídeos plasmáticos. Estes resultados indicam que o NPY pode desenvolver funções em outros tecidos além do cérebro e também pode não estar associado na regulação da alimentação em curto prazo em baixas temperaturas.