Memoria para optar al Título Profesional de Médico Veterinario / En caninos, el desarrollo de las biotecnologías reproductivas ha sido inferior en comparación al realizado en otras especies, básicamente debido a la baja eficiencia en la maduración in vitro de los ovocitos. La adecuada maduración comprende tanto al núcleo como al citoplasma, a nivel citoplasmático involucra la redistribución y desarrollo de organelos, entre estos, la organización y la actividad metabólica de las mitocondrias. Sin embargo, no hay mayores antecedentes respecto al desarrollo citoplasmático in vitro en los caninos, por lo que en la presente memoria se estudió la actividad y distribución mitocondrial en ovocitos de perras en estado inmaduro, madurados in vitro por 72 y 96h y madurados in vivo. Se analizó un total de 766 ovocitos obtenidos de perras sanas sometidas a ovariohisterectomía. Del total de estos ovocitos estudiados, 215 fueron utilizados como inmaduros, 254 fueron madurados durante 72 horas y los otros 297 durante 96 horas. Adicionalmente se analizó una cantidad total de 15 ovocitos madurados in vivo, obtenidos por lavados del oviducto a perras en estro, ovariohisterectomizadas 72 h después de la ovulación, la que se determinó mediante análisis de progesterona sérica. Tanto los ovocitos inmaduros, madurados in vitro y madurados in vivo fueron procesados de forma separada para evaluar la distribución y actividad mitocondrial, usando la sonda de fluorescencia MitoTracker Red CMXRos®. Las observaciones se realizaron en un microscopio invertido con epifluorescencia. La actividad mitocondrial se evaluó de acuerdo a la fluorescencia emitida en alta, media y baja para cada uno de los estados de maduración de los ovocitos y se analizó mediante chi-cuadrado. Se estableció dependencia entre las frecuencias de ovocitos con distintas intensidades de fluorescencia (alta, media, baja) al comparar las muestras provenientes de ovocitos inmaduros, madurados in vitro por 72 y 96 h, y madurados in vivo (chi cuadrado = 30,59; p< 0,01), indicando que la actividad mitocondrial se encuentra directamente asociada al estado de maduración del ovocito de perra. En la actividad mitocondrial todos los ovocitos madurados in vivo presentaron fluorescencia de tipo media, la que predominó en ovocitos de perra inmaduros y madurados in vitro; sin embargo, se observó un aumento en el porcentaje de ovocitos con 3 esta emisión de fluorescencia durante la maduración in vitro que indicaría una actividad mitocondrial progresiva durante el cultivo, asociada al tiempo de maduración. La distribución mitocondrial se evaluó mediante análisis descriptivo, determinándose cuatro patrones: Homogéneo liso completo (A), Homogéneo granuloso completo (B), Heterogéneo granuloso periférico y central (C), y Heterogéneo granuloso central (D). En ovocitos inmaduros se encontraron dos patrones de distribución mitocondrial A (72,1%) y B (27,9%); en aquellos madurados in vitro por 72 h se presentaron los cuatro patrones, predominando el B (63,8%), seguido por C (20,5%), el A (9,8%) y finalmente el D (5,9%). en los ovocitos madurados por 96 h se observaron los patrones, B (63,6%), seguido por C (35,7%) y finalmente D (0,7%). En el caso de los ovocitos madurados in vivo se describió sólo un patrón de distribución mitocondrial que correspondió a B. Con estos antecedentes se indica que en ovocitos inmaduros de perra predomina una distribución uniforme de las mitocondrias en su citoplasma. Además la presentación de tres patrones diferentes en los ovocitos madurados in vitro a aquel descrito en ovocitos madurados in vivo podría indicar que durante la maduración in vitro se producen movimientos de las mitocondrias en el citoplasma ovular. También, las distribuciones de las mitocondrias, variaron a través de la maduración in vitro, asemejándose a aquellos madurados in vivo, sin embargo, hubo diferencias entre ambos tipos de maduración lo que podría estar asociado a las condiciones de cultivo. / Proyecto FONDECYT 1080618

El objetivo de la presente investigación fue explorar y describir la sensitividad materna observada y reportada de un grupo de 6 madres con historia de infertilidad que concibieron por FIV. Estas madres tenían entre 33 y 41 años y sus bebés eran hijos únicos y tenían menos de 3 años. Se las evaluó utilizando el Maternal Behavior Q-sort (MBQS) en sus modalidades de observación y autoreporte. Se halló que las madres que concibieron por FIV podían tener puntajes similares a lo idealmente esperado en algunos dominios de la sensitividad y en otros incluso obtener puntajes mayores al ideal. También cabe señalar que estas madres podían ser tan sensitivas como un grupo de madres colombianas que concibieron naturalmente. Además, se encontró que los reportes de las madres tenían cierta coherencia con el comportamiento observado en todos los dominios de la sensitividad. / The objective of this research was to explore and describe the observed and reported sensitivity of a group of 6 mothers with infertility history who conceived using IVF. They were 33 to 41 years old and their babies were only child and under 3 years old. They were assessed using the Maternal Behavior Q-sort (MBQS) using both observation and self-report modes. It was found that, in some domains of sensitivity, mothers who conceived through IVF could have similar scores to what is ideally expected and, even, in other domains, they could have higher scores than the ideal criterion. Also, it should be mentioned that these mothers could be as sensitive as a group of colombian mothers who conceived without any treatment. Furthermore, it was found that reports of mothers had some consistency with the observed behavior in all domains of sensitivity. / Tesis

Memoria para optar al título Profesional de Médico Veterinario / En este trabajo se investigó mediante fecundación in vitro, la capacidad de espermatozoides caninos refrigerados a 4 °C y frescos (controles), de atravesar la ZP, y penetrar el citoplasma ovular, de ovocitos de perra en estado inmaduro y madurados in vitro, a través de diferentes tiempos de coincubación gamética. Se trabajó con eyaculados de 5 perros adultos, el semen se obtuvo por estimulación digital, utilizando la segunda fracción espermática. Luego de la evaluación del semen, se retiró el plasma seminal por centrifugación, los espermatozoides utilizados como controles (frescos) fueron resuspendidos en medio Fert TALP y los espermatozoides que se sometieron a refrigeración se resuspendieron en extensor o diluyente en base a TRIS-yema de huevo-ácido cítrico y fueron posteriormente refrigerados a 4 °C, por 24 horas. Posterior a ese tiempo, se retiró el diluyente por centrifugación y el pellet espermático fue resuspendido en medio Fert TALP. Ambos tipos de espermatozoides -frescos y refrigerados- fueron coincubados con ovocitos de perra tanto inmaduros como madurados in vitro, en forma separada. Los ovocitos utilizados provinieron de ovarios macerados, obtenidos previamente por ovariectomía. Los ovocitos fueron seleccionados bajo la lupa estereoscópica y lavados en PBS. Posteriormente, los utilizados en estado inmaduro se ambientaron en medio de coincubación Fert TALP y luego se coincubaron con espermatozoides frescos o refrigerados. Los ovocitos que se sometieron a maduración in vitro fueron incubados en medio TCM 199 suplementado con 10% de suero fetal bovino, 10 UI/mL de hCG, 2.5 μl/mL de solución piruvato y 5 μl/mL de solución antibiótica por 72 y 96 horas. Posteriormente fueron coincubados separadamente con ambos tipos de espermatozoides. La coincubación gamética se realizó por períodos de 1 a 10 horas en medio Fert TALP. Cada hora de incubación se retiraron ovocitos, se fijaron en una solución en base a ácido acético, metanol y cloroformo (3:6:2) por tres minutos, y posteriormente en ácido acético y metanol (1:3) por 72 horas a 4 °C y teñidas con 0,1% de Yoduro de Propidio para la 4 posterior evaluación de la penetración espermática y fecundación en microscopia de epifluorecencia. Un ovocito penetrado se determinó cuando se encontró espermatozoides en zona pelúcida (ZP), en espacio perivitelino (PV) o en el citoplasma ovular (C). Se utilizó análisis de varianza y de regresión para determinar diferencias en los diferentes parámetros estudiados. Se evaluaron un total de 3391 ovocitos inmaduros (n= 1765) y madurados in vitro (n= 1626). La penetración espermática fue directamente proporcional al tiempo de coincubación. El aumento del porcentaje de penetración total con espermatozoides frescos fue significativo a partir de las 3 horas en ovocitos inmaduros y 2 horas en ovocitos madurados in vitro (p< 0,05). Con espermatozoides refrigerados, los ovocitos inmaduros muestran diferencias en la penetración total a partir de las 5 horas de coincubación, en ovocitos madurados in vitro es posible observar diferencias a partir de las 2 horas. Los mayores porcentajes de penetración total se obtuvieron a partir de las 6 y 7 horas de coincubación y hacia finales del cultivo. Los espermatozoides refrigerados tuvieron un menor porcentaje de penetración que los frescos, durante todo el periodo de cultivo, excepto a la primera hora de coincubación con ovocitos madurados in vitro y espermatozoides refrigerados (p<0,05). Los ovocitos madurados in vitro fueron penetrados en mayor proporción que los inmaduros (p< 0,05), considerando todo el periodo de cultivo. Se concluye que al aumentar el tiempo de cultivo, un mayor número espermatozoides logró atravesar las cubiertas ovocitarias. Los ovocitos inmaduros y madurados in vitro son penetrados en mayor porcentaje por espermatozoides frescos respecto a aquellos refrigerados, sin embargo, los espermatozoides sometidos a refrigeración serían capaces de penetrar antes los ovocitos madurados in vitro. No obstante los ovocitos de perra inmaduros y madurados in vitro pueden ser penetrados por espermatozoides caninos frescos y refrigerados, la utilización de ovocitos madurados sería más apropiado para evaluar la capacidad fecundante de los espermatozoides frescos y criopreservados. / Proyecto FONDECYT 1030380

Memoria para optar al Título Profesional de Médico Veterinario / El avance de las biotecnologías reproductivas en caninos ha sido más lento que en otras especies animales. El estudio del proceso de capacitación espermática es un factor determinante para el desarrollo exitoso de estas técnicas, siendo aún poco estudiado en caninos. El objetivo del presente trabajo fue evaluar en caninos, el efecto del tiempo de capacitación espermática in vitro a través de la fecundación in vitro, evaluando la penetración espermática obtenida en ovocitos de perra previamente madurados en el laboratorio. De ovarios de perras sanas sometidas a ovariohisterectomía se obtuvieron los ovocitos por corte fino a través de réplicas experimentales, los que se seleccionaron de acuerdo: mayor tamaño, citoplasma oscuro y homogéneo y con más de 3 capas compactas de células del cúmulo. Los ovocitos seleccionados se incubaron para maduración en medio TCM 199 suplementado, a 38,5°C, 5 % CO2 y 98% de humedad, durante 72 y 96 horas. Se obtuvieron 6 eyaculados de 3 perros adultos utilizando la segunda fracción espermática de cada eyaculado, los que fueron centrifugados y el pellet resuspendido en medio de capacitación canino (CCM), dejándolos en incubación a temperatura ambiente (20° - 22°C) durante 1, 2 y 3 horas en forma separada para capacitarlos. Al término de cada período de capacitación se extrajo el CCM mediante centrifugación y los espermatozoides se resuspendieron en medio Fert-Talp, con el cual se prepararon gotas de 100 μL (10 x 106 espermatozoides/mL) para ser coincubados con los ovocitos (10 – 15 ovocitos por gota) previamente madurados in vitro por los diferentes tiempos en forma separada. La coincubación gamética se realizó en la estufa de cultivo por 3 horas a 38,5°C y 5% de CO2 en 98% de humedad. 7 Luego de la coincubación los ovocitos inseminados se lavaron y se fijaron en ácido acético, metanol y cloroformo 3:6:2, respectivamente, por tres minutos y luego en ácido acético y metanol 1:3 por 72 horas a 4 °C. Finalmente, los ovocitos se tiñeron con ioduro de propidio (1μg/mL) y fueron evaluados mediante microscopia de epifluorecencia. Se evaluó un total de 425 ovocitos, determinando el porcentaje de ovocitos penetrados por espermatozoides a nivel de la zona pelúcida (ZP), espacio perivitelino (EP) o en el citoplasma ovular (C). Los resultados se evaluaron por ANDEVA y la prueba de Tukey para determinar la significancia de las diferencias P ≤ 0,05. Se logró penetración con espermatozoides incubados en los tres tiempos de capacitación empleados, sin encontrar diferencias significativas (P>0,05) respecto a los tiempos de capacitación espermática empleados. Hubo mayores porcentajes de penetración (P<0,05) en los ovocitos madurados durante 72 horas (promedio 60,6%) que en aquéllos madurados durante 96 horas (promedio 45,1%). Se obtuvieron porcentajes de penetración similares al comparar los diferentes niveles evaluados (ZP, EP y C) entre ambos tiempos de maduración ovocitaria, con los 3 tiempos de capacitación empleados. Tanto en ovocitos de 72 horas, como de 96 horas de maduración, se encontró mayor porcentaje de penetración a nivel de C (P > 0,05), promedio 55,0% y 50,0% respectivamente, en comparación con los otros niveles de penetración evaluados. Estos porcentajes son superiores a los obtenidos en otros estudios en los cuales se ha medido la penetración al citoplasma ovular. Se puede concluir que los espermatozoides caninos pueden ser capacitados por períodos de 1 a 3 horas, logrando porcentajes de penetración importantes en ovocitos de perras, en orden de obtener fecundación in vitro exitosa en esta especie. / Proyecto FONDECYT No.1060602

Memoria para optar al Titulo Profesional de Médico Veterinario / Durante la maduración ovocitaria el ovocito experimenta cambios a nivel nuclear, citoplasmático y de sus cubiertas, encontrándose en esta última la zona pelúcida (ZP), cubierta extracelular que cumple importantes funciones en el reconocimiento gamético durante la fecundación. El objetivo de este trabajo fue evaluar mediante microscopía electrónica de barrido (MEB) los cambios a nivel ultraestructural en la ZP durante la maduración ovocitaria in vitro, comparando la ZP de ovocitos inmaduros y aquellos madurados en cultivo. También se evaluó el estado morfológico de la ZP de ovocitos de perra durante el proceso de maduración in vitro, a través de dos tiempos de cultivo (72 y 96 horas). Paralelamente, se evaluó el diámetro de los ovocitos con su ZP, en estado inmaduro y sometidos a maduración en cultivo. De ovarios de perras sanas sometidas a ovariohisterectomía se obtuvo un total de 500 ovocitos a través de cortes finos, en un total de 15 réplicas experimentales. Se seleccionaron los ovocitos, de mayor tamaño (diámetro), con su citoplasma homogéneo y completamente rodeados por al menos tres capas de células del cúmulo. Los ovocitos seleccionados en cada réplica fueron divididos en dos grupos: un grupo se incubó para maduración in vitro en medio TCM 199 suplementado y el otro grupo se procesó inmediatamente en estado de ovocitos inmaduros. La fijación de los ovocitos inmaduros y madurados in vitro se realizó posterior a la extracción de las células del cúmulo. Para ello, fueron lavados en buffer Cacodilato 50 mM por 15 minutos y luego fijados en glutaraldehído 2,5% por un mínimo de 24 h. Posteriormente se realizó una postfijación con Tetroxido de Osmio al 2%, luego los ovocitos fueron colocados en cámaras de cobre cerradas para ser deshidratados mediante concentraciones crecientes de acetona (30%, 50%, 70%, 90% y 100%). La deshidratación de los ovocitos se completó mediante secado de punto crítico del CO2. Luego fueron 5 montados en porta-especímen para ser sombreados con oro-paladio. Las muestras se analizaron bajo el MEB marca “LEO” modelo 1420 VP. La medición del trabeculado de la zona pelúcida y del tamaño ovocitario se llevó a cabo mediante el programa “AutoCad 2006” a un total de 93 ovocitos a partir de las fotografías tomadas en el MEB. Del total de ovocitos analizados 30 pertenecían a estado inmaduro, 31 a 72 horas de maduración y 32 a 96 horas de maduración. Los resultados se evaluaron por el análisis de varianza de un factor o clasificación simple y la prueba de Tukey para determinar la significancia de las diferencias P≤ 0,05. Se encontraron diferencias significativas (P≤ 0,05) entre ovocitos inmaduros y madurados in vitro, tanto a 72 como a 96 h. En ovocitos antes de la maduración en cultivo se observó que los agujeros de la ZP eran compactos y de poco tamaño, en cambio en los ovocitos ya madurados in vitro, los agujeros de la ZP presentaron un tamaño mayor. Comparando los dos tiempos de maduración in vitro empleados en este trabajo, se observó mayor tamaño de agujeros en el trabeculado de la ZP de ovocitos madurados por 72 h en comparación a aquellos madurados por 96 h. En el tamaño ovocitario no se encontró un aumento significativo entre los ovocitos madurados in vitro respecto a los inmaduros. Tanto en los ovocitos inmaduros como en los madurados en sistema de cultivo se observó en un alto porcentaje, aproximadamente un 81% de un total de 500 ovocitos, cierto grado de daño morfológico en la ZP, encontrando una mayor proporción de daño en los ovocitos que se sometieron a un sistema de maduración in vitro. De los resultados se puede concluir que durante la maduración ovocitaria in vitro hay cambios estructurales a nivel de la ZP en ovocitos caninos, los que podrían influir en la capacidad de unión y penetración del espermatozoide a través de la ZP durante la interacción de los gametos / Proyectos ENL 05/8 DID y FONDECYT 1060602

Publicación a texto completo no autorizada por el autor / Evalúa los tres tiempos de co-incubación entre gametos bovinos durante la fecundación In vitro, para luego determinar las tazas de división y desarrollo embrionario al día 7 post fecundación. Ovocitos bovinos fueron obtenidos mediante aspiración folicular, fueron madurados In vitro y luego se inseminaron con una concentración de 1,5x106 esp/ml en medio TL-STOCK a 38,5º C, 5% de CO2 y atmósfera saturada de humedad. Luego de 6 horas (T1=245), 12 horas (T2=278) y 18 horas (T3=287) de co-incubación, los Complejos Cumulus-Ovocito (CCOs) con los espermatozoides adheridos al cumulus, se retiraron de las gotas de fecundación y fueron lavados y transferidos a gotas con medio de incubación. Los presuntos cigotos se cultivaron In vitro, en un primer cultivo en medio KSOM y posteriormente en medio de cultivo SOF hasta el término de la evaluación del desarrollo embrionario. La evaluación del efecto tiempos de cocultivo sobre las tasa de división y de blastocistos se realizó mediante la prueba paramétrica de análisis de varianza A las 72 horas de fecundación se obtuvieron tasas de división, ≥ 2 células de: 38.3%, 63.3% y 73.4% para los grupos T1, T2 y T3 respectivamente. Al comparar las tasas de división, sólo se encontró diferencia estadística significativa entre los grupos T1 y T2 y T1 y T3, (p<0.05). Al día 7 de cultivo, la tasa de desarrollo de blastocistos fue de 24.4%; 21.6% y 24.6% para los grupos T1, T2 y T3 respectivamente, no encontrándose diferencia estadística significativa entre los grupos. Los resultados obtenidos en el presente estudio muestran que no existe diferencia estadística entre los tres grupos evaluados respecto al desarrollo embrionario al estadio de blastocisto, lo cual sugiere que al co-incubar gametos bovinos por 6,12 ó 18 horas se pueden obtener embriones de las mismas características que los obtenidos con los protocolos tradicionales. / Tesis

Con el fin de mejorar la producción in vitro de embriones (PIVE) desde ovocitos de cabra perpúber, fueron diseñados tres estudios en esta investigación. El objetivo del primer estudio fue determinar en ovocitos seleccionados mediante el test azul de cresol brillante (BCB), el efecto de la adición de gutatión (GSH) solo o en combinación con glucosa al medio de cultivo in vitro (CIV), sobre el desarrollo embrionario de ovocitos de cabra perpúber. Los ovocitos fueron expuestos al test de BCB y fueron clasificados como: ovocitos con citoplasma azul (BCB+) y ovocitos sin el citoplasma azul (BCB-). Los ovocitos BCB+ mostraron mayor porcentaje de maduración nuclear que los ovocitos BCB- y grupo control (82.6%, 55.7% y 74.7% respectivamente). El porcentaje de ovocitos poliespérmicos fue mayor en ovocitos BCB- que en los BCB+. La suplementación del medio de cultivo (CIV) con 1 mM de GSH, no afectó el desarrollo embrionario, pero el porcentaje de embriones totales desarrollados después del cultivo fue mayor en ovocitos BCB+ que en los BCB-, independientemente de la suplementación con GSH. La adición de glucosa, sola o con GSH no afectó el desarrollo embrionario. La finalidad del segundo estudio era evaluar el efecto de agregar diferentes concentraciones de cisteamina (100&#956;M, 200&#956;M o 400&#956;M) al medio de MIV y al medio de CIV (50 &#956;M o 100 &#956;M) sobre el desarrollo embrionario de ovocitos de cabra perpúber seleccionados por el test BCB. La adición de 400 &#956;M de cisteamina al medio MIV mejoró la fecundación normal y desarrollo embrionario de ovocitos BCB- a los mismos niveles de los ovocitos BCB+. Las proporciones de mórulas mas blastocistos desarrollados no fueron afectados por los tratamientos. Finalmente, fue estudiado el efecto de la adición de cisteamina (400 &#956;M) para el medio de MIV, glutatión (1mM) al medio FIV e ionomicina al medio de capacitación espermática. Este tratamiento mejoró la fecundación normal, cigotos con pronúcleos masculinos y el desarrollo embrionario de ovocitos de cabra prepuber, sin embargo no mejoró el desarrollo de blastocistos. / With the aim of trying to improve in vitro embryo production (IVEP) from prepubertal goat oocytes, three studies were designed in this investigation. The objetive of first study was to assess, in oocytes selected by the brillant cresyl blue (BCB) test, the effect of the addition to in vitro culture (IVC) medium of either glutathione (GSH) alone or GSH in combination with glucose on the embryo development. Oocytes were exposed to BCB and were classified as: oocytes with a blue cytoplasm (BCB+) and oocytes without blue cytoplasm (BCB-). BCB+ oocytes showed higher percentage of nuclear maturation than the BCB- and control group (82.6%, 55.7% and 74.7%, respectively). The percentage of polyspermic oocytes was higher in BCB- than BCB+ oocytes. Supplementation of in vitro culture (IVC) medium with 1mM de GSH did not affect embryo development, but the porcentage of total embryos developed after culture was higher in BCB+ oocytes than in BCB- oocytes independently of the GSH supplementation. The addition of glucose, alone or with GSH, did not affect embryo development. The aim of the second study was to evaluate the effect of adding different concentrations (100&#956;M, 200&#956;M and 400 &#956;M) of cyteamine to the IVM medium and to the in vitro embryo culture (IVC) medium (50 &#956;M or 100 &#956;M) on the embryo development of prepubertal goat oocytes BCB-selected. The addition of 400 &#956;M cysteamine to the IVM improved normal fertilisation and embryo development of BCB- oocytes at the same rates as those obtained from BCB+ oocytes. The proportions of morulae plus blastocyst development were not affects by the treatments. Finally, was studied the effect of adding cysteamine (400 &#956;M) to IVM medium, glutathione (1mM) to IVF medium and ionomycin to the sperm capacitation medium. This treatment improved normal fertilisation, zygotes with male pronucleus and embryo development of prepubertal goat oocytes, however did not improve blastocyst development.

Tesis

El propósito de esta investigación es argumentar sobre la necesidad de valorar la vida humana desde su etapa inicial; utilizando una metodología estrictamente teórico-reflexiva. Se busca clarificar el valor sagrado de la vida humana desde sus inicios, lo cual nos permitirá asumir una postura más objetiva en la defensa de la vida especialmente los más indefensos como son los no nacidos, en una sociedad altamente deshumanizada y utilitarista; enfocando con sentido crítico el subjetivismo o relativismo contemporáneo que plantea una concepción reduccionista y relativista de la persona humana y sus derechos fundamentales y entre ellos la vida. Por eso, esta reflexión se inicia con un breve estudio reflexivo sobre la vida humana como bien fundamental de la naturaleza humana y como don que viene del mismo Dios. Para una mejor compresión del valor incomparable de la vida humana fue necesario ir hacia sus raíces ontológicas, por lo que se ha tratado de los fundamentos antropológicos filosóficos y teológicos de la dignidad de la persona humana y la vida como un bien fundamental; para explicar las razones por las que son moralmente malas todas las acciones que contradicen la vida humana en su etapa inicial como: el aborto, las esterilizaciones, la anticoncepción, la fecundación artificial y la clonación. / Tesis

Evalúa el efecto del fluido folicular como suplemento en el medio de maduración sobre las tasas de maduración in vitro de ovocitos de alpaca. Las muestras biológicas fueron colectadas en el camal municipal de Huancavelica y trasladadas en una solución de NaCl al 0.9% a 4 ºC. En el laboratorio, los complejos cumulus-oophorus (CCO) fueron aislados de los folículos mediante dos métodos (aspiración y cortes) y los CCOs seleccionados fueron colocados en un medio de maduración suplementado con suero fetal bovino (SFB), fluido folicular (FF) o ambos (SFB+FF) y cultivados a 38.5 ºC, 5% de CO2 y 100% de humedad relativa durante 32 a 36 horas. La madurez de los ovocitos fue evaluada post-cultivo mediante la presencia del primer cuerpo polar. Para determinar la capacidad de los ovocitos maduros para completar los procesos de fertilización y desarrollo embrionario se realizaron 4 ensayos de FIV. Se trabajó con espermatozoides aislados de la zona caudal del epidídimo los que fueron seleccionados por el método de swim-up. La fertilización se realizó con una concentración de 2x106 esp/mL en medio HAM suplementado con heparina y PHE como agentes capacitantes. Los espermatozoides y ovocitos se cultivaron juntos bajo condiciones similares a las usadas para la maduración durante 18 horas, luego del cual, los ovocitos fueran lavados y cultivados en medio KSOM suplementado con SFB, piruvato sódico y gentamicina durante 7 días. En primer lugar, se comparó el promedio de CCO aislados mediante los métodos utilizados. Se obtuvo un promedio de 2.1 CCO aislados por ovario mediante el método de aspiración, mientras que con el método de cortes se obtuvo un promedio de 1.2 CCO por ovario, encontrándose diferencia significativa entre estos resultados (p˃0.05). En conclusión, los resultados sugieren que el método de aspiración muestra una mayor proporción de aislamiento de CCO en comparación con el método de cortes, asimismo se demuestra que el FF puede ser usado como un suplemento natural equivalente al SFB en los medios de maduración in vitro para ovocitos de alpaca. / Tesis