Green bacteria possess one of the most complexes antenna systems within the group of the photosynthetic microorganisms. One reason for this complexity is the high diversity of pigments antenna, the bacteriochlorophylls (BChls c, d or e), consisting of a mixture of various forms regularly arranged within the antenna units (the chlorosomes). This pigment diversity makes difficult the accurate analysis and identification of the different bacteriochlorophylls forms by the conventional spectrophotometrical techniques / Els bacteris verds posseeixen un dels sistemes antena més complexes dins el grup dels microorganismes fotosintètics. Una de les raons d’aquesta complexitat és l’elevada diversitat de pigments antena, especialment pel que fa a les bacterioclorofil•les (BCIs c, d o e). Cadascuna d’aquestes BCIs, que tenen diferents estructures i propietats òptiques, es composa d’una mescla de diverses formes homòlogues disposades ordenadament a l’interior de les unitats antena (clorosomes). Aquesta diversitat pigmentària dificulta enormement l’anàlisi i identificació d’aquests pigments mitjançant les tècniques espectrofotomètriques tradicionals

Different aspects and disciplines have been enclosed in this thesis in order to unravel the effects of low temperature to wine yeast. Results enclosed in chapters 1st and 2nd of this thesis reveal original empirical data with the purpose of understand how temperature has impact on Saccharomyces evolution and ecology in wine fermentation environments. Chapters 3rd and 4th enclose a proteomic analysis of yeast during wine fermentation at low temperatures and a functional genomics approach, issue from the proteomic study, developed in order to identify single gene influence at low temperature fermentations. In general, studies presented in this thesis provide oenological biotechnology with a broad range of new and original data that will allow going further in both, developing new biotechnological solutions and performing knowledge-based process management of low temperature fermentations. / Diferents aspectes i disciplines s’han inclòs en aquesta tesis per tal de desentranyar els efectes de la baixa temperatura sobre els llevats vínics. Els resultats inclosos en els capítols 1r i 2n d’aquesta tesis aporten dades empíriques originals amb la finalitat de comprendre com la temperatura ha influït en la evolució del gènere Saccharomyces i en la seva ecologia en ambients vínics. Els capítols 3r i 4rt inclouen un anàlisis proteòmic del llevat durant la vinificació a baixes temperatures i un anàlisis de genòmica funcional, que ha permès detectar i analitzar el rol de gens potencialment importants en les fermentacions a baixes temperatures. En general, els estudis realitzats durant aquesta tesis han proporcionat a la biotecnologia enològica d’un ampli ventall de dades noves i originals que permetran desenvolupar tant noves solucions biotecnològiques com millora de la gestió basada en el coneixement de les fermentacions a baixes temperatures. / Diferentes aspectos y disciplinas se han incluido en esta tesis para desentrañar los efectos de la baja temperatura sobre las levaduras vínicas. Los resultados incluidos en el 1º y 2º capítulos de esta tesis aportan datos empíricos originalescon el fin de comprender cómo la temperatura influye en la evolución del género Saccharomyces y en su ecología en ambientes vínicos. Los capítulos 3º y 4º incluyen un análisis proteómico de la levadura durante lavinificación a bajas temperaturas y un análisis de genómica funcional, que han permitido detectar y analizar el rol de genes potencialmente importantes en las fermentaciones vínicas a bajas temperaturas. En general los estudios realizados durante esta tesis han provisto a la biotecnología enológica de un amplio abanico de datos nuevos y originales que van a permitir desarrollar tanto nuevas soluciones biotecnológicas como mejorar la gestión basada en el conocimiento de las fermentaciones a bajas temperaturas.

Los astrovirus son unos virus icosaédricos de pequeño tamaño con un genoma ARN monocatenario de polaridad positiva y 3 pautas abiertas de lectura (ORF1a y ORF1b para las proteínas no estructurales, y ORF2 para las proteínas estructurales). Se consideran la tercera causa de gastroenteritis no bacteriana tanto en niños como en adultos.En esta tesis, se caracteriza una de las proteínas no estructurales del virus codificadas por el ORF1a, la proteína nsP1a/4. La utilización de un anticuerpo policlonal de ratón, producido en el laboratorio contra un péptido sintético correspondiente a la región más hidrofílica de la proteína, permitió determinar que la proteína nsP1a/4 tiene un peso molecular que oscila entre los 24 y 26 kDa, que se acumula en la región perinuclear colocalizando con el ARN vírico y con las membranas del retículo endoplasmático, y que puede sufrir múltiples modificaciones post-traduccionales por glicosilación y/o fosforilación. Además, se caracterizó también la variabilidad genética de una región hipervariable contenida en la proteína nsP1a/4 y se asoció dicha variabilidad a diferentes capacidades replicativas del virus, así como también a diferentes títulos de partículas víricas en heces de niños infectados. Por todo ello, se estableció una relación indirecta entre la variabilidad de nsP1a/4 y propiedades víricas potencialmente patogénicas. Las principales características de esta variabilidad genética fueron la presencia de numerosas inserciones y delecciones que conservan la pauta de lectura y una gran tolerancia a las substituciones de aminoácidos.Dada la importancia de esta relación entre la variabilidad de la proteína nsP1a/4 y las propiedades potencialmente virulentas del virus, se desarrolló un sistema de diagnóstico y tipado por RT-PCR y análisis de polimorfismo de longitud de fragmentos de restricción (RFLP) para astrovirus y se aplicó dicho método en un estudio epidemiológico a gran escala durante 3 años sobre la población pediátrica de la región de Barcelona. La incidencia de astrovirus observada fue del 4.9% y del 3.6% para los genogrupos A y B respectivamente y la tasa de detección máxima se encontró en niños de entre los 2 y los 4 años. Se observó una distribución bianual y una mayor incidencia de las infecciones durante los meses de invierno. También se observó como las incidencias relativas de cada serotipo y de cada subgenotipo varían cada año, sugiriendo que no existe inmunidad cruzada entre diferentes serotipos.Finalmente, se estudiaron algunas de las relaciones que se producen entre el virus y la célula hospedadora utilizando la línea celular intestinal humana CaCo-2 y se observó como las células desarrollan una respuesta apoptótica tras la infección por astrovirus. La caracterización de esta respuesta apoptótica permitió afirmar que el porcentaje de células apoptóticas es directamente proporcional a la multiplicidad de infección utilizada y que existe una relación directa entre la expresión de las proteínas no estructurales del virus codificadas por el ORF1a y la apoptosis. Además, se identifica un potencial dominio death domain (DD) en la proteína nsP1a/4 del virus. Por último, se identifica la activación de la caspasa 8 en la inducción de la apoptosis y se presenta un modelo para explicar el significado biológico de esta inducción de apoptosis por el virus, sugiriendo que la apoptosis sería necesaria para una correcta maduración de las proteínas de la cápside.

Los rotavirus del grupo A tienen una gran importancia sanitaria. Se calcula que son causantes de 1200 muertes infantiles diarias en todo el mundo. Se han probado diferentes estrategias inmunoprofílácticas, pero todavía no se dispone de una vacuna efectiva contra rotavirus. Los rotavirus humanos del grupo A presentan gran número de serotipos diferentes dependiendo de su proteína VP7 (G-tipos) y de su proteína VP4 (P-tipos). El conocimiento de las cepas circulantes en la población que se desea proteger es de gran utilidad para el diseño de una vacuna eficaz.Dado que rotavirus tiene una transmisión fecal-oral y se excretan en gran número en las heces de los individuos infectados, decidimos emplear el agua residual cómo muestra representativa de lo que ocurre en una población como Barcelona. Esta tesis describe una metodología novedosa y eficaz para la concentración, detección y cuantifícación de rotavirus a partir de muestras de agua residual. El método de concentración empleado era la liofilización, técnica que permitía no sólo recuperar los virus inoculados artificialmente, sino también eliminar inhibidores de las posteriores técnicas moleculares. La detección cualitativa se realizó mediante RT-PCR e hibridación "Southem-blot", la cual nos permitía detectar 20 moléculas de dsRNA/ml. Para la cuantifícación molecular se empleó la RT-PCR a tiempo real utilizando SYBR Green. No obstante, para la cuantifícación absoluta fue necesario construir un dsRNA patrón. Dicha metodología se aplicó en muestras de agua residual recogidas mensualmente del área urbana de Barcelona desde junio de 1998 hasta enero de 2003. Los resultados mostraron que rotavirus es el virus entérico RNA más abundante, y que existe mayor concentración durante el período comprendido entre noviembre y abril. Estos datos correlacionan con la estacionalidad existente en el número de casos clínicos declarados durante el mismo período de estudio.Dado que el análisis del agua residual nos ofrecía una buena correlación con la incidencia clínica de rotavirus, utilizamos dicha muestra para el estudio epidemiológico de las cepas circulantes. Para ello caracterizamos el G-tipo y P-tipo de la mayoría de muestras de agua residual en las que previamente se había diagnosticado rotavirus. Las principales cepas circulantes durante el período de estudio fueron G1P[8], G1P[4] y G3P[8]. Asimismo, se observó una parecida frecuencia de cepas consideradas comunes como de cepas consideradas raras.Así pues, el agua residual urbana puede ser una herramienta útil para conocer qué cepas de rotavirus se encuentran circulando por la población humana, ofreciendo información muy valiosa para el diseño de vacunas.

La tesis doctoral trata aspectos básicos de la biología de los astrovirus. Los astrovirus son virus sin envuelta lipídica, con un genoma de ARNmc de polaridad positiva y de entre 28 y 43 nm de diámetro. Son agentes causales de gastroenteritis sobretodo en la población infantil. Los trabajos realizados se centran en la replicación y morfogénesis de estos virus. En primer lugar, nos propusimos determinar las cargas víricas excretadas en las heces de niños con gastroenteritis causados por astrovirus con el fin de darnos una idea de cual era la capacidad replicativa de estos virus en su huésped natural. Para ello, se puso a punto una técnica molecular para la cuantificación de virus y se aplicó en un estudio epidemiológico realizado con anterioridad en el área metropolitana de Barcelona entre los años 1997 y 2002. El resultado obtenido fue que los niveles de carga vírica detectados eran diferentes en función del genotipo del virus, siendo los genotipos IV-C y V-D los que presentan mayores niveles de virus excretados en heces.En segundo lugar, decidimos profundizar en el papel de la proteína nsP1a/4 de astrovirus en la replicación del genoma vírico y en la producción de progenie vírica. Estudios previos ya apuntaban hacia esta relación, aunque en ningún caso se había demostrado. De este modo, la estrategia a seguir fue construir diferentes clones de astrovirus que sólo se diferenciasen en la zona codificante para la proteína nsP1a/4 y cuantificar la síntesis de los diferentes ARN víricos y producción de progenie vírica en cultivo celular. Los resultados obtenidos confirmaron nuestras hipótesis ya que las diferencias en la secuencia de la proteína nsP1a/4 se traducen en una capacidad de replicación del genoma vírico y de producción de progenie vírica diferencial en función del genotipos del virus. Además los resultados indican que el patrón de fosforilación de la proteína está relacionado con la estrategia de replicación del virus. Los datos obtenidos en estos dos estudios pueden ser importantes a la hora de decidir una estrategia en el tratamiento de las gastroenteritis causadas por astrovirus en función del genotipo del virus, así como si la puesta a punto de una vacuna frente astrovirus estuviese justificada.Finalmente, los pocos trabajos, y al mismo tiempo contradictorios, realizados sobre la morfogénesis de astrovirus, nos animó a profundizar un poco más en su estudio. En nuestro caso, la estrategia seguida fue obtener partículas "virus-like" (VLPs) y trabajar con ellas como modelo del virus. Nuestro trabajo se centró en estudiar la importancia del extremo amino-terminal de la poliproteína estructural en el ensamblaje de la cápside así como el papel de los iones divalentes en la estabilidad de las cápsides. Los resultados mostraron que a pesar que el extremo amino-terminal no es imprescindible, éste no es eliminado en el ensamblaje de las cápsides y se obtienen unas VLPs de 38 nm de diámetro. Además se observó que la adición de agentes quelantes de iones divalentes en la purificación de VLPs en gradientes de CsCl hace que éstas se desestabilicen dando lugar a la aparición de un estado morfogénico intermedio (anillos de 16 nm) en el ensamblaje de las cápsides. Este fenómeno de desestabilización es reversible si se elimina el agente quelante y se añaden iones divalentes. Todos estos resultados, junto con un análisis computacional de la estructura tridimensional de la poliproteína estructural nos hacen pensar que la morfogénesis de astrovirus seguiría un modelo similar al de calicivirus basándose en el dímero de proteínas como unidad estructural del virus. / This thesis studies some topics about replication and morphogenesis of astrovirus. The astroviruses are non-enveloped, (+) ssRNA viruses of 28-43 nm in size. They are causal agents of gastroenteritis on children. First, we determined the level of viral loads excreted in faeces by children infected with astrovirus. For this purpose, a competitive RT-PCR was developed and applied to samples derived from an epidemiological study. The results showed that the level of viral loads depends on the virus genotype, being the genotypes IV-C and V-D the ones with highest viral loads excreted. Immediately, we studied the role of nsP1a/4 protein in virus replication. For this purpose, three clones of astrovirus, which only differed in the coding region of nsP1a/4 protein, were constructed; and quantification of viral RNA synthesis and virus production for each clone was performed. The results showed that the different clones had different replication strategy, and this fact could be only attributed to the biological properties of nsP1a/4 protein. In addition, the phosphorylation of this protein seems to be related with its regulation. Finally, virus-like particles were obtained and used as a virus model for morphogenesis studies. The results showed that the N-terminal region of the structural polyprotein is not necessary for capsid assembly and VLPs of 38 nm in size were observed. In addition, we stated that the presence of EDTA disrupt the VLPs into smaller structures (rings of 16 nm in size) when they are purified in CsCl gradients. This phenomenon is reversible if the EDTA is removed and divalent cations are added. As a conclusion of the work with VLPs , we consider that morphogenesis of astrovirus could be explained according to the calicivirus model based in a protein dimmer as structural unit of the virus.

El virus de l'hepatitis A (HAV), prototip del gènere Hepatovirus, té vàries característiques biològiques que el diferencien dels altres membres de la familia Picornaviridae. Entre elles val la pena destacar la necessitat del factor d'iniciació de traducció eIF4G intacte, i per tant la impossibilitat de silenciar la síntesi proteica de la cèl·lula hoste mitjançant els mateixos mecanismes que fan servir altres picornavirus. Com a conseqüència, l'HAV ha de competir de forma ineficient per la maquinària de traducció, explicant-se d'aquesta manera el pobre creixement en cultiu cel·lular. En aquest context de competència entre el virus i la cèl·lula, l'HAV ha adoptat estratègicament un ús de codons altament deoptimitzat de forma natural. S'hauria d'esperar, per tant, una síntesi proteica baixa, incloent la d'aquelles proteïnes involucrades en la replicació de l'RNA que es trobarien en concentracions limitants. Així doncs, una taxa de traducció molt baixa i una taxa de replicació també molt baixa, podrien tenir un cert paper per evitar les defenses de la cèl·lula hoste. D'aquesta manera el virus pot créixer d'una forma quiescent. Aquest fet podria explicar l'elevada infectivitat específica de l'HAV tot i l'ús de codons deoptimitzat de forma natural, fet que indicaria infeccions no abortades per la resposta antiviral de la cèl·lula. A més a més, l'ús de codons deoptimitzat es materialitza en l'ús de codons abundants i codons rars. Diferents agrupacions d'aquests codons rars es presenten a la superfície de la càpsida, jugant un paper decisiu en la sòlida estabilitat del virió de l'HAV. Per tant, és molt probable que la baixa taxa de traducció, deguda a l'acumulació de codons rars, contribueixi al fet que la càpsida viral sigui altament estable. Estabilitat necessària per a completar el complex cicle biològic del virus, que inclou el pas pels conductes biliars, amb altes concentracions de sals biliars, un llarga supervivència fora de l'hoste, el pas per l'estómac, i un complex recorregut des de l'intestí fins arribar altre cop al fetge. / Hepatitis A virus (HAV), the prototype of genus Hepatovirus, has many biological characteristics that distinguish it from other members of the Picornaviridae family. Among these it is worth of note the need for an intact eIF4G factor for the initiation of translation and thus the inability to shut down host protein synthesis by a similar mechanism as in other picornaviruses. Consequently, HAV must inefficiently compete for the cellular translational machinery and this may explain its poor growth in cell culture. In this context of virus/cell competition HAV has strategically adopted a naturally highly deoptimized codon usage. Accordingly, a low protein synthesis may be expected with those proteins involved in RNA replication existing at limiting concentrations. Thus, a very low translation rate and a very low RNA replication rate may play a role in escaping to host cell defenses, allowing the virus to grow in a quiescent way. This could explain the high specific infectivity of HAV in spite of its naturally deoptimized codon usage, which would indicate non-abortive infections due to the antiviral cell response. Additionally, the deoptimized codon usage conveys in the use of abundant and rare codons. Many clusters of such rare codons are present in the capsid surface playing a seminal role in the highly cohesive stability of the HAV virion. Thus, the slow translation rate, resulting from the accumulation of rare codons, is likely to contribute to the highly stable viral capsid necessary for a prolonged survival outside the host body.

Microbial mats are prokaryotic communities that are thought to represent the present-day analogues of the first ecosystems on Earth. Their study reveals microbial strategies for survival under a broad range of environments. The aim of this work was the application of new techniques and combination of existing ones to give an integrated vision of the structure and physiology, and also characterize less-known microbial populations involved in important processes in the mat. As a result of this study, we can conclude that the application of the "Signature Lipid Biomarker approach" in microbial mat samples has proved to be an effective method to obtain information about physiology and composition of natural microbial assemblages. However, more studies need to be performed in order to increase the sensibility and reproducibility of these techniques, and to evaluate the model of distribution of data in mat samples.In addition, the combination of lipid analysis and nucleic acid-based methods in microbial mats at different depths has provided useful information about the temporal dynamic of populations, their phylogenetic affiliation and physiological status. This study has revealed the importance of heterotrophic bacteria in the photosynthetic layers, the presence of green non-sulfur bacteria in several 'niches', as well as fermentative bacteria in the deepest layers. Besides, divergence analysis has showed that depth-related changes might have a greater influence than temporal changes. Apart from that, the application of the quinone profiling method has been useful for taxonomic purposes, biomass estimation and microbial redox state. In this case, we have observed important differences in the community structure and redox status in microbial mats from different locations that were apparently very similar. In addition, we have performed a preliminarily study about the detection of intact polar lipids in mat samples that will be improved in the future because of its higher taxonomical potential. We have also detected archaeal members that might have an important role in the physiology of the system. The mentioned approaches were also applied to microbial mat samples along a circadian cycle in order to evaluate changes as a response to daily processes. We observed a pattern of physicochemical responses of the mat that reproduces every day. During this study, we have also observed daily changes attributed to anaerobic microorganisms, and for this reason we have isolated representative members of anaerobic spore-formers. As a result of the data obtained after the application of combined analysis in mats, we realized about the importance of the heterotrophic bacteria in the regulation of metabolic processes in the photic zone. Previous studies have investigated the heterotrophic diversity in mats, but the information about their role and the interactions with other microbial groups are still limiting. In this work, we have isolated and characterized two microbial strains involved in the metabolic interactions of the photic zone. We have demonstrated the metabolic capacities of Pseudoalteromonas sp. EBD and the relationship with cyanobacteria. On the other hand, a member of the Sphingomonas genus has been also characterized and its importance in the nutrient cycling and in the polyhydroxyalkanoate dynamics will be investigated.Finally, we have studied the microbial diversity of sulfur-oxidizers involved in the sulfur cycle of transition zones between oxygen and sulfide. In this case, we have investigated the morphological succession in microbial 'blooms' in sulfur-rich environments to predict their reproducibility. In addition, we have applied molecular techniques that have provided important information about the composition of the 'sulfur-blooms' and have permitted the design of probes that will be applied in future studies for the detection of the observed microorganisms in mats.

La Ribonucleotidil Reductasa (RNR) és un enzim essencial encarregat de reduir els ribonucleòtids (NTP) als seus corresponents deoxiribonucleòtids (dNTP) per a la síntesi i reparació de l’ADN, és per això que requereix de ser finament regulat per mantenir els correctes nivells de dNTP cel•lulars. A diferència dels organismes eucariotes, els quals només codifiquen per una classe d’aquest enzim en el seu genoma (la classe Ia), els organismes procariotes poden codificar tres classes diferents de l’enzim (classe I, II i III) i diferents combinacions d’elles en el cromosoma. Les diferents classes de RNR s’expressen a diferents condicions ambientals, incrementant així la seva adaptació ambiental. El microorganisme Escherichia coli codifica en el seu genoma per la RNR de classe I (subdividida en classe Ia i Ib), la qual és activa en condicions aeròbiques, i classe III, només activa en condicions d’anaerobiosi. El principal objectiu d’aquesta tesi titulada “Estudi de l’expressió i funció de les Ribonucleotidil Reductases d’Escherichia coli” ha estat estudiar l’expressió diferencial i la funció de les RNR d’aquest bacteri en diferents condicions ambientals així com, intentar saber més sobre la seva regulació transcripcional. S’ha estudiat l’efecte del regulador global de transcripció gènica H-NS en la transcripció de les tres classes de RNR presents en E. coli i s’ha delimitat la regió d’unió del transcripcional en la regió promotora de la RNR de classe Ia. A més a més, s’ha volgut estudiar diferents efectes ambientals com l’osmolaritat, la temperatura i la disponibilitat d’oxigen en la regulació d’H-NS sobre les diferents classes de RNR. També s’ha pretés analitzar l’expressió diferencial de les diferents classes de RNR durant un procés de formació de biofilm i els mecanismes que fan canviar l’expressió de les RNR durant la maduració d’aquest complex bacterià. L’estudi s’ha dut a terme en una soca no patògena d’E. coli (la soca MG1655) però també en una soca enteropatogènica (la soca E2348/69) per intentar observar diferències o semblances en el patró d’expressió de les diferents classes de RNR durant la formació de biofilm. Seguidament, el fet que els organismes procariòtics expressin més d’una classe de RNR va fer que es volgués investigar una possible funció en la virulència bacteriana d’alguna de les diferents classes de RNR. En aquesta línia d’investigació s’ha estudiat l’expressió diferencial de les RNR durant un procés infectiu utilitzant la soca adhesiva i invasiva d’E. coli (AIEC) LF82, principal soca colonitzadora de malalts de Crohn i que te la capacitat de replicar dins del macròfag. Finalment, en aquesta tesi també s’ha inclós un estudi transcriptòmic global del factor transcripcional NrdR, inicialment descrit com a repressor de les diferents classes de RNR, amb l’objectiu de trobar més gens pertanyents al seu reguló i intentar trobar similituds en el seu mecanisme de regulació transcripcional gènica. / Ribonucleotide Reductase (RNR) is an essential enzyme responsible to provide the required dNTP for the DNA synthesis and repair. Surprisingly, eukaryotic organisms only encode for one class of the enzyme in their genome whereas in the prokaryotic world we can find three different classes of the enzyme (class I, II and III) and also different combinations of them encoded in the genome. The different classes of RNR are expressed in different environmental conditions and require to be tightly regulated to maintain the cellular dNTP pools. Escherichia coli encodes in its genome for the class I (subdivided in class Ia and Ib) and class III RNR. The global aim of this thesis has been to study the transcriptional regulation and the differential expression and function in different environmental conditions of the E. coli RNR classes. It has been provided the effect of the histone-like protein H-NS on the E. coli class Ia and III RNR transcription, the differential expression of the RNR classes during the biofilm formation of a non-pathogenic E. coli (MG1655 strain) and of an enteropathogenic E. coli (E2348/69 strain), the differential expression different RNR classes of the adherent and invasive E. coli (AIEC) LF82 during the infection and a global transcriptomic analysis of the NrdR transcriptional factor, only known for its repressive role on the transcription of RNR.

Nuclear receptor LXR is a ligand dependent transcription factor. The activating ligands of LXR are specific oxidized forms of cholesterol (oxysterols) and intermediate products of the cholesterol biosynthetic pathway. This thesis has been developed in two main parts. In the first part, we have characterized the anti-inflammatory role of LXR in foam cells, a predominant cell type in atherosclerotic plaques, activated by the endogenous cytokine Interferon-gamma (IFN-γ) and the bacterial component lipopolysaccharide (LPS). We have observed that the conversion of macrophages to foam cells itself has an inhibitory effect on the inflammatory response to LPS, but not to IFN-γ. These inhibitory effects on the LPS response in foam cells do not seem to be mediated by impairing activation of ERK and p38 MAPK pathways, nor by inhibiting IκBα degradation. We also compared the antiinflammatory effects of the LXR ligands with the effects mediated by ligands of another member of the nuclear receptors superfamily, PPAR-γ, in peritoneal macrophages. We have found subsets of genes that are specifically repressed by PPAR-γ in the absence of LXR, and another group that is only repressed by LXR. In the second part of this work we have determined the role of LXR on the (IL-4-induced) alternative activation of macrophages. The expression of the main markers of alternative activation of macrophages is not affected by LXR agonists. However, we have observed that LXR exerts specific inhibitory effects over a group of chemokines associated to inflammatory lung diseases such as asthma. We have characterized the effect of an LXR agonist in a murine model of allergic asthma and we observed that LXR ameliorates the respiratory capacity upon induction of the asthmatic response. Moreover, LXR deficient mice developed significantly worsened airway responses in comparison with the wild type animals in this type of test. Finally, in this work we have also observed that IL-4 exerts negative reciprocal effects on the induction of selective LXR target genes in a STAT-6 dependent manner. This IL-4-mediated inhibition is selective and only affects a subset of targets of LXR. / El receptor nuclear LXR es un factor de transcripción dependiente de ligando. Los ligandos activadores de LXR son formas derivadas del colesterol. Esta tesis se ha elaborado en dos grandes bloques. En el primero, hemos caracterizado el papel antiinflamatorio que LXR ejerce en células espumosas, un tipo celular predominante en la placa aterosclérotica, activadas por la citoquina Interferon-gamma (IFN-γ) y por el componente bacteriano lipopolisacárido (LPS). Así mismo, hemos observado que la conversión de macrófagos en células espumosas, per se, tiene un efecto inhibitorio de la señal inflamatoria inducida por LPS, pero no de la inducida por IFN-γ. Estos efectos inhibitorios de la respuesta a LPS en células espumosas no están mediados por la inhibición de la activación de las vías de MAPKs ERK-1/2 o p38, ni tampoco por una inhibición de la degradación de IκBα. También hemos comparado los efectos antiinflamatorios de los ligandos de LXR con los de otro miembro de la familia de los receptores nucleares, PPAR-γ, en macrófagos peritoneales y hemos encontrado subgrupos de genes que son específicamente inhibidos por PPAR-γ en ausencia de LXR, y otros que son inhibidos únicamente por LXR. En el segundo bloque de esta tesis hemos determinado el papel de LXR sobre la activación alternativa de los macrófagos (inducida por IL-4). Los marcadores de activación alternativa de macrofagos mejor caracterizados no se ven afectados por los agonistas de LXR. Sin embargo, hemos observado que LXR ejerce efectos inhibitorios específicos sobre un subgrupo de quimioquinas asociadas a enfermedades inflamatorias pulmonares como el asma. Hemos caracterizado el efecto de un agonista de LXR sobre un modelo murino de asma inducida por alérgeno y hemos observado que LXR es capaz de mejorar la capacidad respiratoria tras la inducción de la respuesta asmática, y de inhibir la expresión de mediadores proinflammatorios en el pulmón de ratones asmáticos. Además, ratones deficientes para ambas isoformas de LXR tienen una peor respuesta pulmonar en comparación con los wild type en este tipo de ensayos. En este trabajo también hemos observado que IL-4 ejerce efectos negativos recíprocos sobre la actividad de LXR, de forma dependiente de STAT-6; esta inhibición mediada por IL-4 es selectiva y solo afecta a un subgrupo de genes diana de LXR.

Gene expression begins by an enzymatic complex known as RNA polymerase (RNApol). The basic unit (core) of RNApol in bacteria is formed by 5 protein subunits (α2ββ’ω). The three-dimensional structure of the RNApol defines two spaces that play a relevant role during transcription, defined as primary and secondary channel. The holoenzyme needs the binding of a σ subunit to recognise promoter sequences and initiate the transcription process. Transcription is a dynamic process controlled at different steps. Genetic regulation during transcription initiation has been highly studied, and several mechanisms of regulation exist. However, the aim of this project is to study some aspects of the regulation during transcription elongation. It has been described that the alamone ppGpp, as well as several proteins, such as GreA, GreB or DksA, enter within the secondary channel and interact directly with the catalytic centre of the RNApol. The swap between the different factors that bind to the secondary channel of the RNApol may cause changes in the expression pattern. It has been postulated that DksA and ppGpp act as cofactors, however, a previous study performed in our research group, indicated that the phenotype of ppGpp and DksA deficiencies were not always identical, letting us suggest that the occupancy degree of the secondary channel of the RNApol may have significant impact in the expression pattern in E. coli. The data obtained clearly indicate that upregulation of some genes, such as fliC, that occurs in absence of DksA, was the result of the vacancy of the secondary channel generated in a dksA strain rather than being the result of DksA having a direct repressor effect. We suggested that in the absence of DksA, the interactions of other proteins, such as GreA, are promoted and responsible of the upregulation observed. In this project, functional, structural and phylogenetical studies of the protein GreA were performed to determine which amino acids are important for i) the functionality of GreA, ii) the ability to bind to the secondary channel of the RNApol or iii) the capacity to compete with other factors, such as DksA. We have determined that greA overexpression produces a negative effect of the bacterial growth. Moreover, this negative effect is enhanced in absence of DksA, highlighting the hypothesis of a competition between factors that bind into the secondary channel. The effect of this competition between GreA and DksA was also determined studying the expression of the fliC gene. Our data showed that both, GreA and DksAare required for fliC expression but act at different levels in the regulatory cascade of flagella expression regulation. GreA may control fliC expression during transcription elongation whereas DksA may act during transcription initiation. Changes in the amount of GreA, could affect the competition between factors that bind to the secondary channel of the RNApol. Therefore, we have determined the expression pattern of greA. Transcriptional studies showed a crosstalk between the different factors that bind into the secondary channel of the RNApol exists. Finally, transcriptomic studies were performed to determine the effect of ppGpp and DksA on the expression pattern of Salmonella enterica serovar Typhimurium. The results obtained indicate : i) the effect of the possible competence between the factors that interact into the secondary channel of the RNApol and ii) the effect of ppGpp and DksA on the expression of several virulence factors as well as different mobile elements present in Salmonella. / El control de l’expressió gènica en bacteris recau principalment sobre un complex enzimàtic anomenat ARN polimerasa (ARNpol). A procariotes, la seva unitat bàsica (core) està formada per 5 subunitats proteiques (a2bb’w). S’han determinat dos canals entre les diferents subunitats de l’ARNpol: el canal primari, on es desenvolupa la transcripció, i el canal secundari, que comunica el medi exterior amb el centre catalític de l’ARNpol. Tot i així, aquest holoenzim necessita la unió d’una subunitat σ per ser capaç de reconèixer una seqüència promotora i iniciar la transcripció. S’han descrit diferents factors, tant proteics com no proteics, que poden interaccionar amb el canal secundari de l’ARNpol i causar alteracions a l’expressió gènica. En aquesta tesi ens hem centrat en la possible competència entre els diferents factors que poden interaccionar amb el canal secundari de l’ARNpol. Estudis anterior duts a terme en el nostre grup d’investigació, ens van permetre postular una possible competència entre els diferents factors que interaccionen amb el canal secundari de l’ARNpol, més concretament entre les proteïnes GreA i DksA. Aquesta competència provocaria alteracions en el patró d’expressió gènica d’Escherichia coli. En aquest treball s’han dut a terme estudis funcionals, estructurals i filogenètics de la proteïna GreA que ens han permès determinar quins aminoàcids, i com a conseqüència quins dominis, podrien ser importants per la funcionalitat de la proteïna, la seva capacitat d’unir-se a l’ARNpol i la seva capacitat de competir amb altres factors. A més, hem estudiat quin efecte té la competència entre els diferents factors que interaccionen amb el canal secundari sobre l’expressió d’un gen diana. Canvis en els nivells de la proteïna GreA, poden afectar la competència pel canal secundari de l’ARNpol Per això hem determinat el patró d’expressió del gen greA, així com l’existència d’una regulació creuada entre les diferents proteïnes que interaccionen amb el canal secundari. Finalment, hem dut a terme un estudi transcriptòmic en Salmonella enterica serovar Typhimurium, amb l’objectiu de determinar quin és l’efecte d’aquesta competència en l’expressió de factors de virulència.