Saccharomyces cerevisiae is a premier model system to study ageing in post mitotic cells. In this study, we show that Mtl1, member of the Cell Wall Integrity pathway (CWI), plays a positive role in Chronological Life Span (CLS). The absence of Mtl1 shortens CLS whereas its overexpression extends it. In mtl1 cells, we observe mitochondrial dysfunction during diauxic shift that is reflected in i) increase in uncoupled respiration associated to low oxygen consumption; ii) significant increase in mitochondrial membrane potential; iii) ROS (Reactive Oxygen Species) accumulation and as well as iv) a descent in aconitase activity. We demonstrate that this mitochondrial dysfunction observed in mtl1 mutant is a consequence of improper regulation of key signaling pathwaysrequired for entry in quiescence. TOR1/SCH9 deletion and less effectively PKA (Protein Kinase A) inactivation in mtl1 not only suppressed the mitochondrial defects but also increased the CLS. Mtl1 links mitochondrial dysfunction with TOR (Target of Rapamycin) and PKA pathways in quiescence. In the absence of Mtl1, the stability of the inhibitory subunit of PKA, Bcy1 is severely reduced, mainly as a consequence of a high PKA activity. Mtl1 regulates PKA inactivation through Bcy1 phosphorylation, both in diauxic conditions and mainly in response to glucose depletion. In these conditions, Mtl1 negatively regulates Tor1/Sch9 function to phosphorylate Bcy1 and thus to inhibit PKA through phosphorylation of Bcy1 by Slt2 MAPK, although additional kinases might be also involved in this signal. We also show that Mtl1 function in CLS does not totally depend on CWI pathway since mtl1slt2 double mutant presents synthetic lethality. Mtl1 acts as a glucose sensor thereby it regulates both NCR (Nitrogen Catabolite Repression) and RTG (Retrograde Response Mitochondrial- Nucleus) pathways through Snf1 kinase upon glucose depletion, although independent of TORC1 and PKA functions. Again, additional targets are not completely ruled out. In conclusion, Mtl1 is an efficient transceptor involved in sensing and signaling nutrient availability in quiescence, mainly glucose, and in regulating multiple pathways involved in life extension. / Saccharomycescerevisiae es un sistema modelo muy adecuado para el estudio de los procesos de envejecimiento en células posmitóticas. En el presente estudio se muestra que Mtl1, un miembro de la ruta de integridad celular (CWI), tiene una función positiva en el proceso de extensión cronológica de la vida (CLS). La ausencia de Mtl1 provoca un acortamiento de la CLS mientras que su superexpresión la prolonga. En el mutante mtl1 se observa una disfunción mitocondrial durante el shiftdiauxico, lo que se evidencia tras la observación de los siguientes parámetros: i) incremento de la respiración desacoplada ligado a un bajo consumo de oxígeno; ii) aumento significativo del potencial de membrana; iii) acumulación de ROS (Especies Reactivas de Oxígeno); así como iv) un descenso en la actividad de la aconitasa.Nosotros demostramos que la disfunción mitocondrial observada en el mutante mtl1ocurre como consecuencia de ladesregulación de las rutas de señalización que se necesitan para la correcta entrada en la fase de quiescencia. La delección de los genes TOR1 y SCH9 y con menor eficiencia la inactivación de PKA (Protein Quinasa A),suprimen los defectos mitocondriales de mtl1 y provocan un aumento sustancial de su CLS. Mtl1 es el nexo de unión entre la disfunción mitocondrial y las vías TOR (Target of Rapamycin) y PKA en la quiescencia. La estabilidad de Bcy1, una subunidad inhibitoria de PKA, está muy reducida en ausencia de Mtl1. Esta proteína regula la inactivación de la función PKA a través de la fosforilación de Bcy1 durante el shiftdiauxico y principalmente en respuesta a la depleción de glucosa. En ambas condiciones, Mtl1 regula negativamente a la función Tor1/Sch9, lo que activa a la MAP quinasa Slt2, la cual fosforila a Bcy1, hecho que inhibe la función PKA. Sin embargo, no se descarta la posibilidad de que otras quinasas estén también involucradas en este proceso. También se muestra que la función de Mtl1 en la CLS no depende totalmente de la ruta CWI puesto que los genes MTL1 y SLT2 presentan letalidad sintética en estas condiciones.Mtl1 actúa como un sensor de glucosa y como tal también regula la función de Snf1 en respuesta a la depleción de glucosa, y como consecuencia a los genes regulados por los sistemas NCR (Represión Catabólica Nitrogenada) y RTG (Respuesta Retrógrada Núcleo-Citoplasma), además, este proceso es independiente de TORC1 y PKA. En conclusión, Mtl1 es un transceptor que detecta y señaliza la disponibilidad de nutrientes (principalmente glucosa) en quiescencia para regular la función de múltiples vías de señalización relevantes para la extensión de la vida. / Saccharomyces cerevisiae és un sistema model molt adecuat pels procesos d’envelliment en cèl.lules postmitòtiques. En aquest estudi es demostra que Mtl1, un membre de la vía d’integritat cel.lular (CWI), té una funció positiva en el procés d’extensió cronológica de la vida (CLS). L’absència de Mtl1 redueix la CLS mentre que la seva sobre expressió l’allarga. En el mutant mtl1 s’observa una disfunció mitocondrial durant el shift diàuxic, que es fa evident al observar els següents paràmetres: i) increment de la respiració desacoplada unit a un baix consum d’oxígen; ii) augment significatiu del potencial de membrana; iii) acumulació de ROS (Espècies Reactives d’Oxígen); així com iv) un descens en l’activitat de l’aconitasa. Nosaltres demostrem que la disfunció mitocondrial observada en el mutant mtl1 succeeix com a conseqüència de la desregulació de les vies de senyalització necessaries per a la correcta entrada a la fase de quiescencia. La delecció dels gens TOR y SCH9 i amb menor eficàcia, la inactivació de PKA (Protein Kinasa A), suprimeixen els defectes mitocondrials de mtl1 i indueixen una augment significatiu de la seva CLS. Mtl1 es el nexe d’unió entre la disfunció mitocondrial i les vies TOR (Target of Rapamycin) y PKA en quiescència. L’estabilitat de Bcy1, una subunitat inhibitoria de PKA, està molt reduïda en absència de Mtl1. Aquesta proteïna regula la inactivació de la funció de PKA mitjançant la fosforilació de Bcy1 durant el shift diàuxic i principalment en resposta a la depleció de glucosa. En ambdues condicions, Mtl1 regula negativament la funció Tor1/Sch9, fet que indueix l’activació de la MAP quinasa Slt2, la qual fosforila a Bcy1, procés que inhibeix la funció PKA. No obstant, no es descarta la possibilitat de que altres quinases estiguin participant en aquest procés. També es mostra que la funció de Mtl1 en la CLS no depen totalment de la vía CWI, donat que els gens MTL1 y SLT2 presenten sintètica letalitat en aquestes condicions. Mtl1 actua con un sensor de glucosa i com a tal, també regula la funció de Snf1 en resposta a la depleció de glucosa, i en conseqüència als gens regulats pels sistemes NCR (Repressió Catabòlica Nitrogenada) y RTG (Resposta Retrògrada Nucli-Citoplasma), a més a més, aquest procés es independent de TORC1 y PKA. Concluïnt, Mtl1 es un transreceptor que detecta i senyalitza la disponibilitat de nutrients (principalment glucosa) en quiescència per a regular la funció de múltiples vies de senyalització rellevants per l’extenció de la vida.

El agua de consumo subministrada a través de las redes de distribución deviene alterada durante su circulación en el mismo debido a la actividad microbiana. Estos cambios en la calidad a menudo afectan al sabor, color y al olor. En otros casos, la calidad sanitaria de agua es alterada debido al recrecimiento bacteriano. La masa del agua, es el mayor hábitat de un sistema de aguas potables, aunque la mayoría de cambios significativos en sus propiedades tienen lugar en las superficies de contacto las cuales están colonizadas por microorganismos creciendo en diferentes comunidades microbianas adaptadas a los bajos niveles de nutrientes, altos niveles de cloro, formando biopelículas. Este trabajo demuestra que el agotamiento de cloro en el suministro de agua es clave para la proliferación microbiana en todo el sistema. Un nivel adecuado de cloro (~ 0,5 mg / l) es suficiente para garantizar la ausencia de biopelículas incluso después de eventos de contaminación microbiana o la entrada de carbono orgánico en el sistema. Sin embargo, la reducción de los niveles de cloro, incluso sin la adición de carbono o el aumento de la carga microbiana suspendida, permite el desarrollo de una comunidad unida en aproximadamente 2 semanas. En este escenario, la liberación de células microbianas en la fase acuosa se incrementó 10 veces en la ausencia de cloro. Episodios posteriores de agotamiento del cloro pueden acelerar el desarrollo de las comunidades microbianas con susceptibilidad reducida a la desinfección en los sistemas de agua potable real. Se necesitan enfoques alternativos de desinfección, no sólo para la distribución de agua potable, sino también para el control del crecimiento de biopelículas En este trabajo se ha evaluado la aplicabilidad de una nueva familia de desinfectantes llamados tiol bismuto (BT), que representan una nueva generación de agentes antibacterianos. Estos agentes están basados en el Bismuto, pero su actividad antibacteriana se ha mejorado notablemente en combinación con ciertos compuestos de tiol lipófilos. BTs exhiben efectos residuales más persistentes que el cloro a pesar de su acción relativamente lenta. BTs podrían ser especialmente útiles para los ecosistemas de agua artificiales en las que es muy difícil mantener un nivel constante de cloro libre, tales como sistemas de agua caliente o torres de refrigeración. Los BT tienen efectos residuales más persistentes que el cloro y la hiper-calefacción en los sistemas de agua. Eficiencia del BT aumentó con la temperatura, pero, al igual que los iones de cobre y plata, su acción es relativamente lenta. La combinación de efectos bactericidas y residuales puede prevenir la acumulación de limo en sistemas de agua caliente. / The water supply released into the distribution system is altered during its passage through the system due to a large extent to microbial activity. These quality changes most often result in complaints about taste, odour, and colour. In other cases, the sanitary quality of water is altered due to bacterial regrowth. The water body is the major habitat of drinking water systems, though the most significant changes in drinking water properties are at contact surfaces, which are colonized by microorganisms growing in diverse microbial communities adapted to low nutrient and high chlorine levels, forming biofilms. This work demonstrates that chorine depletion in the water supply is key to microbial proliferation throughout the system. An adequate level of chlorine (~0.5 mg/l) is enough to ensure the absence of biofilms, even after microbial contamination events or the input of organic carbon into the system. However, reducing chlorine levels, even without adding carbon or increasing the suspended microbial load, allows the development of an attached community in approximately 2 weeks. In this scenario, the release of microbial cells into the water phase increased 10-fold in the absence of chlorine. Subsequent episodes of chlorine depletion may accelerate the development of microbial communities with reduced susceptibility to disinfection in real drinking water systems. Alternative disinfection approaches are needed, not only for the distribution of safe water, but also for the control of biofilm growth. In this job has been evaluated the applicability of a new family of disinfectant called bismuth thiol (BT), which represents a new generation of antibacterial agents. These agents are bismuth based, but their antibacterial activity has been enhanced markedly in combination with certain lipophilic thiol compounds. BTs exhibit more persistent residual effects than chlorine despite their relatively slow action. BTs could be especially useful for artificial water ecosystems in which it is very difficult to maintain a constant level of free chlorine, such as hot water systems or cooling towers. BTs have more persistent residual effects than chlorine and hyper-heating in water systems. BT efficiency increased with temperature but, like copper–silver ions, its action is relatively slow. The combination of bactericidal and residual effects may prevent slime build-up in hot water systems.

Tesi realitzada a l'Institut d'Investigació Biomèdica de Bellvitge (IDIBELL) / INTRODUCTION. Tumor cells undergo a complete metabolic reprogramming which allows them to grow and proliferate fast. The metabolic changes are driven by oncogenes and tumor suppressors and are aimed to increase glycolysis and biosynthetic pathways and to reduce oxidative phosphorylation. Cancer cells rely on glucose not only to produce energy but also to synthesize all the biomolecules necessary for their proliferation. They prefer to use glycolysis rather than oxidative phosphorylation, even in presence of oxygen. This metabolic reprogramming can be a disadvantage for tumors when nutrients are limiting. Treatment with anti-glycolytic drugs, such as 2-deoxyglucose, or glucose withdrawal have been shown to sensitize to radiotherapy or chemotherapy or to TRAIL stimulation, making these treatments good candidates for cancer therapy. Glucose deprivation can induce different types of cell death, such as apoptosis, usually through the mitochondrial pathway, or necrosis. OBJECTIVE. This thesis focuses on understanding the molecular mechanisms of apoptosis induced by glucose deprivation in different cell lines. The objective was to determine which platform is activating caspase-8 under glucose deprivation, which seems to be different from the canonical DISC (death-inducing signaling complex). RESULTS. We have described that HeLa cells die in a caspase-dependent manner when subjected to glucose deprivation, as the co-treatment with the caspase inhibitor Q-VD protects from cell death. We also show that Q-VD co-treatment and the silencing of caspase-8 protects HCT116 deficient for Bax and Bak from cell death due to glucose deprivation. Then, we studied the role of the Ripoptosome in caspase-8 activation in HeLa cells subjected to glucose removal. As we already described in Bax/Bak deficient MEFs, in HeLa the knockdown of RIPK1 did not prevent cell death. However, we have demonstrated that FADD is essential for the execution of cell death under glucose deprivation. Recently, it has been shown that an intracellular DISC (iDISC) can be formed upon proteasome inhibition or endoplasmic reticulum stress on autophagosomal membranes, independently of death ligands. We demonstrated by immunoprecipitation and immunofluorescence that caspase-8 interacts with p62, LC3-II and ATG5, proteins that associate with autophagosome, under glucose deprivation. However, we were unable to show significant translocation of caspase-8 to these organelles, or an essential role of p62 to activate caspase-8 and induce apoptosis under glucose deprivation. Furthermore, we observed that glucose deprivation induces the endoplasmic reticulum stress in different cell lines, as demonstrated by the induction of ATF4 and CHOP. Moreover, glucose withdrawal results in the induction of death receptors of TRAIL. We have shown that ATF4, but not CHOP, is responsible for the induction of TRAIL-R2 (DR5) after glucose removal. We show by immunoprecipitation that DR5 interacts with caspase-8 and localizes mostly at Golgi apparatus before and after the treatment, where maybe it could be accumulating and recruiting caspase-8. Moreover, the knockdown of DR5 in HeLa cells protects from apoptosis due to glucose deprivation, an effect that is more significant when Bcl-xL is stably expressed in these cells, suggesting that a component of death upon glucose deprivation is dependent on the mitochondrial pathway. Finally, we describe that caspase-8 is located to filament-like structures in Bax/Bak deficient MEFs subjected to glucose deprivation. We show that those filaments co-localize with β-tubulin, suggesting that a cytoskeleton scaffold could be involved in caspase-8 aggregation and activation under glucose deprivation. CONCLUSIONS. These data suggest that glucose deprivation could be used as potential therapeutic strategy against tumors with impaired mitochondrial pathway of apoptosis. / INTRODUCCIÓN. Las células cancerosas dependen de la glucosa, no sólo para producir energía, sino también para sintetizar bio-moléculas necesarias para su proliferación, lo que las hace más sensibles a la escasez de glucosa. La privación de glucosa puede inducir diferentes tipos de muerte celular, tales como la apoptosis, generalmente a través de la ruta mitocondrial, o la necrosis. OBJETIVO. Esta tesis se centra en la comprensión de los mecanismos moleculares de la apoptosis inducida por la privación de glucosa en diferentes líneas celulares. El objetivo fue definir qué plataforma está activando la caspasa-8 bajo privación de glucosa. RESULTADOS. En primer lugar, hemos descrito que las células HeLa sometidas a la privación de glucosa mueren por apoptosis dependiente de caspasas ya que el co-tratamiento con el inhibidor de caspasas Q-VD protege de esta muerte. También mostramos que el Q-VD y el silenciamiento de la caspasa-8 protegen a las células HCT116 deficientes en Bax y Bak de la muerte causada por la retirada de glucosa. Entonces, se estudió el papel del Ripoptosoma en la activación de la caspasa-8. El silenciamiento de RIPK1 no impidió la muerte celular. Sin embargo, hemos demostrado que FADD es esencial para la ejecución de la muerte celular bajo la privación de glucosa. Demostramos por inmunoprecipitación e inmunofluorescencia que bajo privación de glucosa la caspasa-8 interactúa con p62, LC3-II y ATG5, proteínas que se asocian con el autofagosoma. Sin embargo, no hemos podido demostrar translocación significativa de la caspasa-8 a estos orgánulos, o un papel esencial de p62 en activar la caspasa-8 e inducir la apoptosis bajo privación de glucosa. Además, se observó que la privación de glucosa induce por un lado, estrés del retículo endoplásmico en diferentes líneas celulares, como demuestra la inducción de ATF4 y CHOP, y por otro lado la inducción de los receptores de muerte de TRAIL. Hemos demostrado que ATF4, pero no CHOP, es responsable de la inducción de TRAIL-R2 (DR5) después de la retirada de glucosa. CONCLUSIONES. Estos datos sugieren que la privación de glucosa podría ser utilizada como posible estrategia terapéutica contra tumores resistentes a la ruta mitocondrial de apoptosis.

En aquesta tesi doctoral s’ha analitzat la utilitat dels gens malat deshidrogenasa (mdh)i recombinasa A (recA) com a marcadors moleculars per a la construcció de filogènies fiables del gènere Aeromonas. Les dades obtingudes han permès l’obtenció, mitjançant mètodes de màxima versemblança (ML) i d’inferència bayesiana (IB), de filogènies amb un alt suport estadístic en la majoria dels nodes dels arbres obtinguts, indicant que els arbres construïts a partir de les seqüències d’aquests gens són robusts. Com a resultat d’aquesta anàlisi, s’han reclassificat algunes soques mal identificades, s’ha detectat un fragment recombinant en 4 soques d’A.bestiarum, del qual s’ha pogut identificar l’inici i final, així com el parental recombinant del que molt probablement deriva aquest segment, i s’ha determinat el possible efecte d’aquest esdeveniment de recombinació a l’estructura i funció de la proteïna RecA. A partir de les filogènies obtingudes i utilitzant un punt de calibratge extern, s’ha determinat l’origen de l’ancestre comú d’Aeromonas i dels diferents llinatges d’aquest gènere bacterià. A més, s’ha pogut establir a partir de diferents aproximacions, el model de diversificació seguit al llarg dels anys en que Aeromonas ha estat evolucionant, així com la seva taxa de diversificació (nombre d’espècies/milió d’anys). Finalment, s’ha comparat l’evolució seguida per Aeromonas, des del seu origen fins a l’actualitat, amb la de totes les espècies animals. Els resultats suggereixen, que des de la gran extinció del Permià-Triàsic, Aeromonas hauria evolucionat paral·lelament a l’augment del nombre dels gèneres animals. L’explosiva proliferació d’organismes multicel·lulars i la seva decisiva influència en l’estructura i funció dels ecosistemes va proporcionar un nou univers de nínxols ecològics potencials pels llinatges bacterians presents. La bona correlació observada entre el nombre de gèneres animals i la diversificació d’Aeromonas en els darrers 250 Ma, podria ser explicada per la colonització d’aquests nous nínxols.

La fibrosis quística (FQ) es la enfermedad hereditaria autosómica recesiva más frecuente entre la población caucásica. La principal causa de morbilidad y mortalidad en estos pacientes es por afectación pulmonar; mayoritariamente se producen infecciones respiratorias por Staphylococcus aureus, Haemophilus influenzae, Pseudomonas aeruginosa, Stenotrophomonas maltophilia y algunas especies del complejo Burkholderia cepacia (Bcc). Cerca del 5% de los pacientes con FQ, se encuentran colonizados o infectados por Bcc, aunque éstas también son conocidas por infectar a pacientes con enfermedad granulomatosa crónica y por ser patógenas nosocomiales. Las especies del Bcc son bacilos gramnegativos fenotípicamente similares y con una relación genética muy estrecha; por ello la identificación y diferenciación mediante técnicas de microbiología convencionales es de elevada complejidad. Actualmente se han descrito 20 especies diferentes dentro Bcc. Debido a su elevada resistencia natural a numerosos antimicrobianos, su erradicación en los pacientes con FQ es dificultosa. Además el Bcc se caracteriza por poseer múltiples factores de virulencia, así como por su capacidad de formar biofilm. Entre las especies descritas del Bcc, B. multivorans y B. cenocepacia son las más prevalentes; no obstante esta distribución no se ha mantenido igual en el tiempo, ni en todos los países. Los objetivos del presente trabajo fueron; estudiar la epidemiolgía-molecular de los aislados bacterianos pertenecientes a Bcc obtenidos de muestras respiratorias de pacientes con FQ del Hospital Vall d’Hebron de Barcelona durante los años 2010 y 2012, determinar la sensibilidad a antimicrobianos y establecer la capacidad para formar biofilm de estos aislados. Por ello se identificaron mediante secuenciación del gen recA los aislados. También se comprobó la utilidad de MALDI-toF (VITEK MS y Daltonics MicroflexLT) para su identificación. La relación clonal se realizó por electroforesis en campo pulsante (PFGE) mediante la enzima SpeI. A su vez se determinaron los secuenciotipos (MLST) de los aislados y la relación clonal de éstos. Se estudió la sensibilidad a diferentes antimicrobianos utilizando la técnica disco-difusión y mediante la técnica del cristal violeta la capacidad de formar biofilm. El 5,3% de pacientes con FQ estuvo colonizado o infectado por Bcc. B. multivorans fue la especie más prevalente (43,8%), seguida de B. contaminans (37,5%), B. cepacia (18,8%) y B. stabilis (6,3%). Ambos MALDI-ToF ensayados determinaron el género del 100% de aislados, no obstante VITEK MS no determinó la especie de los aislados que pertenecían a B. stabilis y B. contaminans. Igualmente Daltonics MicroflexLT no identificó a nivel de especie los aislados de B. contaminans y un aislado de B. cepacia. En seis pacientes se aisló un mismo clon de B. contaminans (ST482), por lo que se constató la diseminación clonal de secuentiotipo. Se describieron los secuenciotipos ST17, ST450, ST723, ST724, ST725 y ST814 de B. multivorans; ST9 y ST726 de B. cepacia y ST51 de B. stabilis. De estos, ST723, ST724, ST725, ST726 y ST814 se describieron por primera vez en este estudio. El 68,2% de los aislados fueron sensibles a meropenem, 65,1% a piperacilina-tazobactam, 60,3% a ceftazidima, 54,6% a doxiciclina, 47,6% a trimetoprim-sulfametoxazol y 26,9% a ciprofloxacina. B. multivorans y B. cepacia fueron las especies más resistentes a antibióticos β-lactámicos, trimetoprim-sulfametoxazol y ciprofloxacina. B. contaminans y B. stabilis fueron los más sensibles a antibióticos β-lactámicos. Doxiciclina fue el antimicrobiano más activo frente a los aislados de B. multivorans y meropenem a los aislados de B. cepacia. Prácticamente todos los aislados tuvieron capacidad de formar biofilm. La capacidad de formar biofilm es diferente según la especie, siendo B. multivorans la que mostró mayor capacidad, aunque los aislados de un mismo clon mostraron cuantificaciones diferentes esgrimiendo la existencia de diferentes subpoblaciones de un mismo clon, con diferente capacidad de formar biofilm. / Cystic fibrosis (CF) is the most common autosomal recessive hereditary disease among caucasian population. The main cause of morbidity and mortality in patients with cystic fibrosis are the current and chronic lung infections. Staphylococcus aureus, Haemophilus influenzae, Pseudomonas aeruginosa, Stenotrophomonas maltophilia and some of the Burkholderia cepacia complex (Bcc) species are linked to the CF lung infections. About 5% of CF patients, mainly adults, are colonized or infected by Bcc, although this bacterial complex is also known to infect patients with chronic granulomatous disease and also as nosocomial pathogen. Bcc gram-negative bacilli are phenotypically very similar and genetically related, consequently the identification and differentiation using conventional microbiological techniques is difficult. Due to its high natural resistance to many antimicrobials, the eradication of Bcc in CF patients is complicated. Bcc is characterized by multiple virulence factors, including the ability to form biofilm. Among the Bcc species, B. multivorans and B. cenocepacia are the most prevalent among CF patients; however the distribution of Bcc species among the CF patients it’s changing over the years and countries. The aim of this study was to reveal the distribution of the Bcc species among the isolates obtained through respiratory samples from CF patients attended at the CF unit of Vall d’Hebron University Hospital (Barcelona) between 2010 and 2012; the susceptibility to antimicrobial agents and the ability to form biofilm were studied. 63 Bcc isolates were identified from 16 CF patients by sequencing the recA gene. Also the identification of these isolates by MALDI-TOF (VITEK MS and Daltonics Microflex LT) was determined. The clonal relatedness was performed by the PFGE employing the SpeI enzyme and the ST of all the clonal isolates by MLST. Finally the susceptibility to different antimicrobial and the biofilm quantification were analyzed by the disc-diffusion method and crystal violet technique respectively. 5,3% of CF patients were colonized or infected by Bcc. The most prevalent specie was B. multivorans (43,8%) followed by B. contaminans (37,5%), B. cepacia (18,8%) and B. stabilis (6,3%). Both MALDI-ToF analyzed in this study determined the genus of all isolates. However VITEK MS misidentified the all the B. stabilis and B. contaminans isolates. Daltonics Microflex also misidentified the B. contaminans isolates and one B. cepacia isolate. From six patients the same B. contaminans (ST482) clone was isolated, therefore the spread capacity of this clone is proven. The ST723, ST724, ST725, ST726 and ST814 have been described for the first time in this study. From all B. multivorans isolates, ST17, ST450, ST723, ST724, ST725 and ST814 were determined, from B. cepacia, ST726, ST9 and from B. stabilis, ST51 was found. By the antimicrobial susceptibility the 68,2% of the isolates were susceptible to meropenem, 65,1% to piperacillin-tazobactam, 60,3% to ceftazidime, 54,6% to doxycycline, 47,6% to trimethoprim-sulfamethoxazole and 26,9% to ciprofloxacin. B. multivorans and B. cepacia isolates were the most resistant to the betalactams, trimethoprim-sulfamethoxazole and ciprofloxacin antimicrobials. B. contaminans and B. stabilis were the most susceptible to betalactam. Doxycycline was the most effective antimicrobial agent against B. multivorans isolates and meropenem to B. cepacia isolates. Finally most of the Bcc isolates had the capacity to produce biofilm, nevertheless significant differences were determined among all the species, being B. multivorans the greatest. However the same clonal isolates showed significant differences at biofilm quantifications suggesting the presence of different subpopulations of the same clone, with different biofilm quantifications.

La formación de cuerdas en género Mycobacterium está directamente relacionada con la virulencia. Es aún desconocido el compuesto responsable de la formación de las cuerdas, pero dichas cuerdas fueron relacionadas con la composición del ácido α-micólico en Mycobacterium tuberculosis y Mycobacterium bovis BCG. Más concretamente con la presencia de un anillo de cis ciclopropano en la posición proximal del ácido α-micólico. Hay diferentes especies de micobacterias que no poseen tal ciclopropano en el ácido α-micólico y que también fueron descritas como formadoras de cuerdas. Por ello, se investigó la correlación entre la formación de cuerdas y la presencia del anillo de ciclopropano en la posición proximal del ácido α-micólico en Mycobacterium brumae, Mycobacterium fallax y Mycobacterium abscessus. Utilizando la microscopia electrónica de barrido se confirmó la formación de cuerdas en M. brumae, M. fallax y M. abscessus todas cepas con morfología colonia rugosa. Solamente las variantes de M. abscessus con morfología colonial lisa no formaban cuerdas. Además, se corroboró mediante la utilización de resonancia magnética nuclear que M. brumae y M. fallax no poseen anillo de ciclopropano en el ácido α-micólico. También se analizó por primera vez la estructura del ácido micólico de M. abscessus, concluyendo que no había diferencia en la composición de los ácidos micólicos de la variante con morfología colonial lisa y la variante con morfología colonial rugosa, como tampoco presentaban anillo de ciclopropano en su ácido micólico. Además, se confirmó que solamente la variante con morfología colonial lisa presentaba glicopeptidolípidos en la pared. Actualmente existe un gran interés por las micobacterias no tuberculosas como agentes causales de enfermedades en humanos. En países en vía de desarrollo las infecciones causadas por micobacterias no tuberculosas tienen un diagnóstico erróneo, y consecuentemente un tratamiento equivocado. En general las enfermedades provocadas por las micobacterias están asociadas a diversas enfermedades como por ejemplo: fibrosis quística, enfermedad pulmonar obstructiva y VIH. Entre estas especies encontramos M. abscessus, que es un patógeno emergente que presenta alta resistencia a antibióticos, lo que agrava su tratamiento clínico. En vista de los resultados anteriores, se decidió investigar la relación entre la formación de cuerdas y la virulencia en M. abscessus. Se pudo concluir que las variantes con morfología colonial rugosa, formadoras de cuerdas eran más virulentas que las variantes con morfología colonial lisa, siendo las primeras capaces de matar a los macrófagos, además de inducir a la producción de altos niveles de TNF-α y IL-6 por parte de los macrófagos. Otro resultado importante que se pudo observar mediante la utilización de diferentes técnicas microscópicas fue que las variantes rugosas formaban grandes agregados bacterianos, y estos se localizaban dentro de un mismo fagosoma. En cambio, las variantes lisas se presentaban como bacilos aislados. En este estudio se concluyó que este factor de agregación de los bacilos juntamente con la ausencia de los glicopeptidolípidos tiene un papel importante en la patogenicidad de M. abscessus, dejando expuestos los factores de virulencia de la micobacteria. / The capacity to form microscopic cords of Mycobacterium species has been related to their virulence. The compounds responsible for cording are unknown but the cord-like appearance formation of these strings of cells have been related to mycolic acids structure in Mycobacterium tuberculosis and Mycobacterium bovis BCG - concretely due to the detection of a cyclopropane ring to α-mycolic acids. There are, though, many different species of Mycobacterium which do not have the cyclopropane formation within the α-mycolic acid also described as cord formers. That is why we ran an investigation examining the correlation between the cording and cyclopropanation of α-mycolic acids in Mycobacterium brumae, Mycobacterium fallax and Mycobacterium abscessus. Scanning electron microscopy image, confirmed the fine structure of microscopic cords formation of M. brumae, M. fallax and M. abscessus, all the strains with similar rough morphology. It was only the M. abscessus variant with a smooth morphology that did not form true cords. Furthermore, performing nuclear magnetic resonance NMR analysis in M. brumae and M. fallax, was corroborated the absence of cyclopropane rings in their α-mycolic acids. In this study, it was also analysed for the first time, the mycolic-acids structure of M. abscessus; concluding there was no difference within the mycolic-acids composition between the smooth and rough morphological variants, no had these species cyclopropane rings had cyclopropane rings in their α-mycolic acids. The results confirmed that only the variant with a smooth morphology was showing glycopeptidelipids in its cell walls, too. Nowadays, there is a huge interest in non tuberculous mycobacteria as a major causing agent for human diseases. In developing countries, the infections caused by these bacteria have a wrong diagnoses’ approach, therefore, a wrong treatment is given. Generally, the diseases caused by Mycobacterium are associated to different illnesses such as: cystic fibrosis, chronic obstructive pulmonary disease and HIV. In these species we find the before mentioned, M. abscessus which is considered an emergent pathogen that shows high resistance to antibiotics and consequently, making its clinic treatment difficult. Regarding the previous results, it was decided to investigate the relationship between cord formation and virulence within the M. abscessus. The variants with a rough morphology were exhibiting a major virulence than the smooth ones while forming cords, being these ones able to kill the macrophages in addition to induce a high TNF-α and IL-6 level production by them. Another significant result observed through different microscopic techniques, was the big bacterial aggregation the rough variants were forming, being these ones located in the same phagosome. The smooth variants, however, were showing isolated bacilli. The study revealed that this bacilli aggregation factor in conjunction with the glycopeptidelipids absence has an important role in the M. abscessus pathogenicity, exposing the bacilli virulence factors.

La cepa 357 fué aislada en el año 2002 de una muestra de arena (Praia da Seda,Galicia, España) contaminada con petróleo del Prestige. Esta cepa, presuntamente afiliada al grupo Roseobacter, fue capaz de crecer utilizando naftaleno como única fuente de carbono y energía. Ante la falta de información genética y bioquímica sobre degradación de naftaleno en el grupo Roseobacter, decidimos abordar el trabajo presentado en esta tesis. Así, se ha confirmado taxonómicamente la afiliación de la cepa 357 a la especie Citreicella aestuarii. A continuación, utilizando técnicas genómicas, fisiológicas y analíticas, se ha caracterizado el potencial metabólico de la cepa 357 en el contexto del grupo Roseobacter. Además, se ha definido fisiológica, genética y bioquímicamente la vía catabólica del naftaleno. Así, C. aestuarii 357 es capaz de metabolizar el naftaleno vía salicilato y gentisato. Adicionalmente, hemos demostrado la capacidad de la cepa 357 de crecer con dibenzotiofeno como fuente única de carbono, energía y azufre. / Strain 357 was isolated in 2002 from an oil-polluted sand sample from Praia da Seda (Galicia, Spain). This strain, a plausible member of the Roseobacter clade, was able to grow using naphthalene as sole carbon and energy source. Due to the lack of genetic and biochemical information about naphthalene degradation in Roseobacter, the work presented in this PhD Thesis was started. Thus, it has been taxonomically demonstrated that strain 357 is a member of the Citreicella aestuarii species. Using physiology, genomic and analytical techniques the metabolic potential of strain 357 in the context of the Roseobacter clade has been characterized. Furthermore, it has been demonstrated that C. aestuarii 357 is able to metabolize naphthalene via salicylate and gentisate. Finally, it has been proven that strain 357 is able to use dibenzothiophene as unique carbon, energy and sulfur source.

Filamentous moulds may cause spoilage in raw materials, foods and feeds. Some of them synthesize mycotoxins which are a risk for human and animal health. For this reason, from the food safety point of view, only mycotoxins, as chemical hazards, are important. Nevertheless, despite the absence of direct correlation between mould growth and mycotoxins production, the prevention of fungal growth in raw materials and foods leads invariably to the prevention of mycotoxins presence. Due to the fact that moulds can contaminate foods from raw materials till end products, different strategies could be used at the different steps in the food chain. Preharvest strategies include the use of resistant varieties, crop rotation, soil preparation, optimal irrigation, fertilizer, herbicides, insecticides and chemical and biological agents application. Post-harvest strategies include improved drying and storage conditions, together with the use of natural and chemical agents. Predictive models may be used as a strategy to predict and prevent mycotoxigenjc fungal growth and mycotoxins accumulation. The present PhD work focused in two main strategies: a) The use of antifungals of natural origin to prevent from mycotoxigenic fungi and mycotoxins Equisetum arvense and Stevia rebaudiana extracts were analized as possible natural agents to inhibit growth and mycotoxin accumulation in in vitro and in vivo experiments. Both extracts were effective against mycotoxigenic moulds and the mycotoxigenic Aspergillus and Fusarium isolates studied were completely inhibited by a 3% of E. arvense. However, the effect decreased in the in vivo test. In the last case, Equisetum was effective against Aspergillus section Flavi and Fusarium section Liseola growth at high water activity levels and with high infection levels, but mycotoxins levels were not significantly affected. b) The assessment of the usefulness of predictive models to manage the mycotoxin problem In an initial experiment, four particular points which deserved in depth study to assess the viability of predictive microbiology in the moulds field were identified: 1) models should be developed for longer time periods; 2) food and raw materials prone to mycotoxin contamination are usually stored under marginal conditions for mould growth, thus performance of models should be checked under such conditions; 3) the impact of the inoculum size in the performance of the models; and 4) the impact of the potential intraspecies variability among isolates in prediction performance. Prediction of time to growth by kinetic models was clearly linked to inoculum size. On the other hand, the performance of predictive models may be compromised under marginal conditions for fungal growth, the higher variability of results under these conditions results in the need for a higher number of replicates required, specifically for kinetic models. For last, a high intraspecific variability on growth and mycotoxin levels has proven to be wider for the both isolates studies: A. carbonarius and P. expansum. For this reason, a greater number of strains should be included to develop models under non optimal condition for both, growth and for mycotoxin production. A matrix was built from which the number of strains and replicates to be planned for new experiments can be assessed for a reliable estimation of growth parameters and we conclude that increasing the number of strains in an experiment increases the explained variability much more than including further replicates. Finally, a first attempt was done to model aflatoxins production as a function of growth parameters and time. Aflatoxins accumulation was shown to be better correlated to colony area than either colony diameter or fungal biomass. Luedeking-Piret model was used for this purpose, and reasonable percentages of variability were explained. To conclude, probability models applied either to mould growth or mycotoxin production might be a valuable tool in food safety management through the food chain.

En aquesta Tesi s'estudiaren les variacions de les comunitats bacterianes marines en relació a la distància a la costa i la seva utilització com àrees recreatives (platges i ports). També s'analitzaren els canvis estacionals que es produeixen a les diferents poblacions detectades. I es compararen els resultats de les poblacions detectades amb canvis espacials i temporals de diferents paràmetres fisicoquímics analitzats. Es detectaren canvis poblacionals importants a dins i fora de les zones recreatives, a més, les poblacions majoritàries detectades a les zones d'impacte coincidien a diferents àrees geogràfiques de l'illa de Mallorca. Aquestes determinacions podrien permetre la utilització d'aquestes poblacions com a bioindicadors d'aigües costaneres que presenten un impacte antropogènic. El més innovador d'aquest estudi es l'aplicació dels Sistemes d'Informació Geogràfica (SIG) en l'àmbit de la microbiologia ambiental per a conèixer la repercussió dels impactes generats per l'ús de la costa.

Klebsiella pneumoniae és un bacil Gram negatiu que causa infeccions del tracte urinari així com pneumònies adquirides en la comunitat i nosocomials. La membrana externa de les bactèries Gram negatives està formada pel lipopolisacàrid (LPS). El LPS és una molècula formada per un polisacàrid, amb càrrega negativa, ancorat a una regió hidrofòbica, el lípid A, que posseeix característiques d’endotoxina i és, per tant, immunoestimuladora. Els sistemes de transducció de senyals de dos components en bactèries detecten canvies en l’ambient i regulen l’expressió de gens que modifiquen l’estructura del lípid A per tal de mantenir l’homeòstasi de la cèl•lula bacteriana, augmentar la resistència en front als pèptids catiònics o modular la resposta immune de l’hoste. En resultats previs del nostre laboratori va posar-se de manifest que la xaperona Hfq regula les modificacions del lípid A a Yersinia enterocolitica O8. En aquesta tesi doctoral posem de manifest que aquest fet no sols es dóna a Y. enterocolitica si no que Hfq també participa en la regulació de les modificacions dels lípid A tant a Salmonella Typhimurium com a K. pneumoniae. En la segona part d’aquesta tesi doctoral hem caracteritzat l’estructura de lípid A que K. pneumoniae expressa in vivo, durant una infecció, sense la necessitat de realitzar un pas previ d’aïllament bacterià en medis de cultiu tradicionals. Durant una infecció pulmonar, K. pneumoniae expressa un lípid A que es caracteritza per la presència d’una cadena de 2-hidroximiristat com acilació secundària. Les nostres observacions indiquen que el lípid A que K. pneumoniae expressa en el pulmó és menys inflamatori que el lípid A que la bactèria expressa quan creix en medis de cultiu tradicionals. A més a més, el lípid A que K. pneumoniae expressa in vivo juga un importantíssim paper conferint a la bactèria resistència en front als pèptids antimicrobians. / Klebsiella pneumoniae es un bacilo Gram negativo que causa infecciones del tracto urinario así como neumonías adquiridas en la comunidad y nosocomiales. La membrana externa de las bacterias Gram negativas se compone del lipopolisacárido (LPS). El LPS es una molécula formada por un polisacárido, cargado negativamente, anclado a un dominio hidrofóbico, el lípido A, que posee propiedades de endotoxina y, por tanto, es inmunoestimulador. Los sistemas de transducción de señales de dos componentes en bacterias detectan cambios en el ambiente y regulan la expresión de genes que remodelan la estructura del lípido A para mantener la homeóstasis de la célula bacteriana, aumentar su resistencia a péptidos catiónicos o modular la respuesta inmune del huésped. En resultados previos de nuestro laboratorio se puso de manifiesto que la chaperona Hfq participa en la regulación de las modificaciones del lípido A en Yersinia enterocolitica. En esta tesis doctoral se ha puesto de manifiesto que este hecho no sólo ocurre en Y. enterocolitica si no que también Hfq participa en la regulación de las modificaciones del lípido A tanto en Salmonella Typhimurium como en K. pneumoniae. En la segunda parte de esta tesis doctoral se ha caracterizado la estructura de lípido A que expresa K. pneumoniae in vivo durante una infección sin la necesidad de aislar la bacteria previamente en medios de cultivo tradicionales. Durante una infección pulmonar, K. pneumoniae expresa una estructura de lípido A caracterizada por la presencia de una cadena de 2-hidroximiristato como acilación secundaria. Nuestras observaciones indican que el lípido A expresado en el pulmón es menos inflamatorio que el expresado cuando la bacteria crece en medios de cultivo tradicionales. Además, el lípido A expresado por K. pneumoniae in vivo juega un importante papel en la resistencia de la bacteria frente a péptidos antimicrobianos. / K. pneumoniae is a Gram negative bacterium which causes urinary tract infections as well as community-acquired and nosocomial pneumonia. Lipopolysaccharide (LPS) is the major component of the outer membrane of Gram negative bacteria. LPS is a negatively charged polysaccharide anchored to a hydrophobic region, the endotoxic lipid A. In bacteria, two component transduction systems detect environmental changes and trigger the expression of genes responsible for lipid A modifications. Lipid A remodelling helps maintaining cellular integrity, confers resistance to many antimicrobial peptides as well as modulates host’s immune response. Previous results from our laboratory showed that Hfq regulates lipid A modifications in Yersinia enterocolitica O8. In this doctoral thesis we demonstrate that Hfq also regulates lipid A modifications in other Enterobacteriaceae such as Salmonella Typhimurium and K. pneumoniae. In a second study, we have characterised for the first time the lipid A structure expressed by K. pneumoniae in vivo during a lung infection without the need of a previous isolation step on traditional culture media. During the course of a lung infection, K. pneumoniae expresses a lipid A characterised by the presence of a 2-hydroxymiristate as a secondary acylation. Our results show that the lipid A expressed by K. pneumoniae in vivo in the lung is less inflammatory than the lipid A expressed when cultured on traditional culture media. Furthermore, this lipid A found in the lung plays a major role conferring resistance to antimicrobial peptides.