El seleni és un element essencial en la dieta humana present en selenoproteïnes, que té propietats anticancerígenes a concentracions baixes tot i que és tòxic a dosis elevades. Contràriament als microorganismes multicel•lulars, el Se no és essencial pel creixement de Saccharomyces cerevisiae, ja que manca de selenoproteïnes. La proteïna quinasa Snf1/AMPK juga un paper central en la regulació de l’homeòstasi del metabolisme del carboni en S. cerevisiae. En aquest treball s’ha demostrat que l’activitat d’aquesta quinasa és necessària per protegir les cèl•lules front la toxicitat per selenit. A més, Snf1 juga un paper protector quan l’homeòstasi redox del metabolisme del glutatió es troba alterada cap a un ambient intracel•lular més oxidant. D’altra banda, aquest treball demostra que el selenit provoca la inducció del reguló Aft1 de forma específica i diferent del que s’observa en condicions de dèficit de ferro. Mentre que Aft1 protegeix les cèl•lules front la toxicitat per selenit depenent dels nivells de ferro intracel•lulars, Aft2, factor transcripcional paràleg d’Aft1, juga una funció independent front aquesta protecció. A més, Rim101 (qui regula la via de resposta a pH alcalí) també protegeix front al selenit, tot i que el seu rol protector no està relacionat ni amb Aft1 ni amb Aft2. Addicionalment, Rim101 regula l’expressió de gens d’algunes subunitats de l’ATPasa V-H+ al llarg d’un tractament amb selenit. / El selenio es un elemento esencial en la dieta humana presente en forma en selenoproteínas, que tiene propiedades anticancerígenas a concentraciones bajas aunque es tóxico a dosis elevadas. Contrariamente a los microorganismos multicelulares, el Se no es esencial para el crecimiento de Saccharomyces cerevisiae, ya que carece de selenoproteínas. La proteína quinasa Snf1/AMPK juega un papel central en la regulación de la homeostasis del metabolismo del carbono en S. cerevisiae. En este trabajo se ha demostrado que la actividad de esta quinasa es necesaria para proteger las células frente a la toxicidad por selenito. Además, Snf1 juega un papel protector cuando la homeostasis redox del metabolismo del glutatión se encuentra alterada hacia un ambiente intracelular más oxidante.Por otra parte, este trabajo demuestra que el selenito provoca la inducción del regulón Aft1 de forma específica y diferente de lo que se observa en condiciones de déficit de hierro. Mientras que Aft1 protege las células frente a la toxicidad por selenito dependiendo de los niveles de hierro intracelulares, Aft2, factor transcripcional parálogo de Aft1, juega una función independiente frente a esta protección. Además, Rim101 (quien regula la vía de respuesta a pH alcalino) también protege frente al selenito, aunque su rol protector no está relacionado ni con Aft1 ni con Aft2. Adicionalmente, Rim101 regula la expresión de genes de algunas subunidades de la ATPasa V-H+ a lo largo de un tratamiento con selenito. / Selenium is an essential element in human diet present in a number of selenoproteins, which has anticarcinogenic properties at low concentrations although it is toxic at high dosis. In contrast to multicellular organisms, Se is not essential for growth of Saccharomyces cerevisiae, which lacks selenoproteins. The AMPK/Snf1 protein kinase has a central role in carbon metabolism in S. cerevisiae. In this study it has been demonstrated that Snf1 activity is needed for protection against selenite toxicity. Moreover, Snf1 plays a role in protecting yeast cells when glutathionedependent redox homeostasis is altered to a more oxidant intracellular environment.On the other hand, this study demonstrates that selenite provokes the induction of the Aft1 regulon in a specific manner, and different from that observed in iron limitation conditions. While Aft1 protects cells against selenite in an iron-dependent manner, Aft2, Aft1 paralog transcription factor, has independent roles in such protection. Moreover, Rim101 (which mediates the alkaline pH response pathway) also protects against selenite, although its role is not related neither to Aft1 nor to Aft2. Additionally, Rim101 regulates the expression of some genes encoding ATPase VH+ vacuolar subunits during selenite treatment.

La microscopia de fuerza atómica (AFM) permite estudiar las superficies de materiales biológicos a escala nanométrica y obtener imágenes de elevada resolución de la topografía de la muestra. En este trabajo, la utilización de esta poderosa técnica ha permitido observar, caracterizar y explorar tanto la superficie celular como la estructura del biofilm que forman distintas cepas de Candida albicans, las cuales presentan mutaciones por deleción en genes que codifican por proteínas con un dominio denominado CFEM (Common in several Fungal Extracelular Membrane), que podrían estar implicadas en la formación, desarrollo y/o mantenimiento de la estructura del biofilm en C. albicans. De este modo, se han podido realizar diversos estudios en los que se ha evaluado la rugosidad de las superficies celulares y de los biofilms, parámetro que nos ayuda a caracterizar una superficie; se ha observado la formación, estructura y complejidad de los diferentes biofilms obtenidos; explorado la influencia de diferentes tipos de sustrato en la formación de biofilms y se han analizado las fuerzas de adhesión de las distintas cepas de C. albicans estudiadas ante diversos sustratos, recubiertos con una película formada por componentes de la saliva, mediante la técnica de AFM de espectroscopia de fuerza. Por otro lado, con el fin de estudiar la eficacia de distintos tipos de luz láser de gran aplicación en el tratamiento endodóntico y evaluar el efecto de la terapia fotodinámica en la eliminación de microorganismos, la microscopia de fuerza atómica ha sido de gran utilidad para analizar las lesiones producidas sobre la superficie celular de Enterococcus faecalis tratados con luz láser y terapia fotodinámica, tanto en suspensiones celulares como formando biofilms, mediante la visualización de cambios en la morfología celular y análisis de la rugosidad de superficie. Los estudios realizados aplicando la técnica de AFM han revelado como la falta de expresión de proteínas CFEM por C. albicans puede afectar a la estructura y organización del biofilm, y se ha podido evaluar la influencia positiva de distintos tipos de superficies sobre la adhesión celular. Además, los resultados obtenidos han demostrado un enfoque práctico de la técnica de AFM para examinar alteraciones sustanciales en la superficie celular de E. faecalis, tanto en suspensiones celulares como en biofilms formados por este microorganismo, inducidas después de los tratamientos con luz láser y terapia fotodinámica. El estudio llevado a cabo indica que estos tratamientos podrían ser eficaces en la eliminación de biofilms, erradicación de células persistentes y descontaminación de superficies orales. / The atomic force microscopy (AFM) allows to study several properties of biological surfaces at the nanoscale and also to obtain high resolution images of the sample’s topography. In this work, the use of this powerful technique has allowed us to observe, characterize and explore both the cell surface and biofilm structure forming of different strains of Candida albicans, in which deletion mutations occur in genes encoding proteins with a domain named CFEM (Common in several Fungal Extracellular Membrane). Thus, it was possible to perform various studies that have evaluated the surface roughness parameter, which helped us to characterize cellular and biofilm surfaces; have observed the formation, structure and complexity of the different biofilms obtained; explored the influence of different types of substrate in the formation of biofilms and analyzed the adhesion forces of different strains of C. albicans to various substrates studied by the technique of AFM Force Spectroscopy. Furthermore, in order to study the effectiveness of various types of laser lights of wide application in endodontic treatment and to evaluate the effect of photodynamic therapy in the eradication of microorganisms, atomic force microscopy has been useful for analyzing lesions produced on the cell surface of Enterococcus faecalis treated by laser lights and photodynamic therapy, both cell suspensions as biofilms, by visualizing changes in cell morphology and analysis of surface roughness. Studies using AFM revealed that the lack of CFEM protein expression by C albicans can affect the structure and organization of the biofilm, and we assessed the positive influence of different types of surfaces on cell adhesion. Moreover, the results obtained have shown a practical approach of AFM to examine substantial alterations in cell surface of E. faecalis, both cell suspensions and biofilms formed by this microorganism, induced after treatment with laser light and photodynamic therapy. The study carried out indicated that these treatments could be effective in removing biofilms, persistent cells eradication and decontamination of oral surfaces.

El riesgo de infección en cualquier ser humano depende, por un lado, de la intensidad de la exposición a microorganismos potencialmente patógenos y, por el otro, de la integridad de los mecanismos de defensa del huésped, incluidas las barreras anatómicas, la inmunidad humoral y la mediada por células. El estado de salud y la condición premórbida del paciente representan factores de riesgo adicionales al generar defectos cualitativos o cuantitativos en el funcionamiento de la respuesta inmune que pueden aumentar el riesgo de padecer diferentes tipos de infecciones. Ejemplo de ello son la diabetes mellitus o las enfermedades hepática, cardíaca o renal crónicas. Los pacientes con neoplasias son un ejemplo paradigmático, pues tienen un riesgo aumentado de infección debido a diferentes motivos: el daño a las barreras anatómicas es común después de la quimio o radioterapia o luego de procedimientos invasivos como son, por ejemplo, catéteres endovenosos o cirugías; además, la propia malignidad subyacente o las intervenciones terapéuticas inmunosupresoras (quimioterapia, corticosteroides y la radioterapia) son responsables de defectos inmunes. Por todo lo expuesto esta población de pacientes puede englobarse en el término inmunodeprimido. Los inmunodeprimidos son un problema relevante de salud, debido al aumento de su prevalencia, y también por el alto consumo de recursos que suponen. Los pacientes inmunodeprimidos tienen mayor riesgo de enfermar y, consecuentemente, de requerir ingreso en las Unidades de Cuidados Intensivos (UCI). Dos de esas poblaciones, especialmente relevantes por el aumento de su incidencia y por sus potenciales complicaciones son los pacientes hemato-oncológicos y los pacientes con infección por el virus de la inmunodeficiencia humana (VIH). Cada vez con mayor frecuencia observamos en nuestra actividad diaria en UCI la necesidad de asistir a estos pacientes. Los pacientes hospitalizados tienen riesgo de desarrollar infecciones nosocomiales. Estas infecciones son relevantes por su potencial gravedad y el elevado coste que generan, sobre todo en el ámbito de la UCI. Una particularidad de estas infecciones es que, con frecuencia, son debidas a microorganismos multirresistentes (MMR), ya que el ingreso a estas unidades condiciona un cambio de la microflora endógena de los pacientes, provocando colonización por gérmenes del ámbito hospitalario, con una sensibilidad a antibióticos diferente. Existe la sensación que los pacientes inmunodeprimidos críticos tienen un riesgo aumentado de presentar infecciones nosocomiales por MMR, así como de una peor evolución cuando las presentan. Sin embargo, hay pocos estudios que hayan analizado esta circunstancia. Esto resulta de interés pues serviría para elaborar guías y protocolos con la intención de determinar la mejor estrategia de uso de antibióticos, y establecer los factores potencialmente modificables para mejorar el pronóstico. Por este motivo se planteó el desarrollo de esta Tesis Doctoral. En ella se incluyen dos trabajos que tienen como principales objetivos evaluar y comparar pacientes críticos con neoplasias malignas (hematológicas y nohematológicas) con aquellos sin neoplasia en términos de adquisición de MMR, infecciones y mortalidad (Artículo 1); y evaluar y comparar pacientes críticos infectados por el VIH con aquellos sin esta infección en los mismos términos (Artículo 2). Para ello se realizó un estudio observacional, prospectivo de cohortes de pacientes ingresados en una UCI médica de ocho camas para adultos en un hospital universitario de 700 camas durante un período de 35 meses. Se obtuvieron frotis de fosas nasales, de faringe y de recto, y se recogieron cultivos de secreciones respiratorias dentro de las 48 h del ingreso y tres veces por semana a partir de entonces. Además se obtuvieron otros cultivos según se considerara necesario por el médico tratante. Se recogieron también variables clínicas cuantitativas y cualitativas que se consideraron de importancia, como factores de riesgo o pronóstico, además de las escalas de gravedad al ingreso y durante la estancia en UCI. Se utilizó un análisis de regresión logística multivariante para evaluar la mortalidad en la UCI. El protocolo del estudio fue aprobado por el Comité de Ética en Investigación Clínica del Hospital Clínic de Barcelona. Los principales resultados de ambos estudios demuestran que ambas poblaciones de pacientes críticos inmunodeprimidos (hemato-oncológicos o infectados por VIH) no parecen tener un mayor riesgo de adquisición de microorganismos resistentes o infecciones durante su estancia en UCI. Además, el pronóstico de su estancia en UCI no se relaciona con la adquisición de estos agentes patógenos o las infecciones adquiridas intra-UCI, ni tampoco con tener o no infección por VIH, sino a la gravedad de la enfermedad al ingreso y a la condición de tener una neoplasia hematológica.

Introducción: Pseudomonas aeruginosa es un patógeno oportunista que causa una gran variedad de infecciones, entre las que destacan las infecciones respiratorias agudas y crónicas y las infecciones de heridas por quemaduras. En un trabajo previo, usamos anticuerpos específicos para detectar la presencia del epítopo de fosforilcolina en la superficie bacteriana asociado al factor de elongación Tu (EF-Tu). Identificamos que el gen eftM (Elongation Factor Tu Modifying enzime) es el responsable de la incorporación de fosforilcolina a EF-Tu. Además demostramos que este epítopo es crucial para la colonización inicial del tracto respiratorio por P. aeruginosa y el desarrollo de neumonía. En esta tesis hemos investigado la contribución de la fosforilcolina en la interacción de P. aeruginosa con los queratinocitos epidérmicos humanos y en las infecciones de heridas por quemadura causadas por este patógeno. Contenido de la investigación: La proteína EF-Tu recombinante purificada de un aislado clínico y de un mutante isogénico desprovisto del gen eftM funcional fue analizada por espectrometría de masas. El análisis comparativo demostró que el producto de eftM es una metiltransferasa (EftM) que incorpora tres grupos metilo al residuo 5 de lisina de EF-Tu dando lugar a un epítopo estructuralmente igual a la fosforilcolina. Mediante la combinación de técnicas de fraccionamiento celular, microscopía electrónica e inmunología, demostramos que EftM trimetila EF-Tu en el citoplasma, el cual es posteriormente transportado a la membrana externa, dejando el residuo 5 trimetilado expuesto hacia el exterior. Los ensayos de invasión y transmigración con cultivos de queratinocitos humanos polarizados infectados con la cepa parental o el mutante en eftM demostraron que la trimetilación de EF-Tu media la migración de P. aeruginosa a través de la barrera epitelial. Esto es debido a que la cepa parental es capaz de alterar, de forma más eficiente que el mutante, la permeabilidad de la barrera epitelial mediante la reducción de la expresión de ZO-1, una proteína clave para la integridad del epitelio. Los ensayos con un antagonista del receptor del factor activador de plaquetas (PAFR) demostraron que este receptor media la interacción de P. aeruginosa con los queratinocitos a través de EF-Tu trimetilado. Sin embargo, la reducción de ZO-1 no es debida directamente a la interacción EF-Tu-PAFR, sino que está inducida por la activación, por parte de P. aeruginosa, del factor de transcripción celular NF-κB. Finalmente, los experimentos en un modelo murino de infección por quemadura demostraron que la mutación de eftM reduce notablemente la virulencia y la capacidad de diseminación de P. aeruginosa. Conclusiones: Se ha identificado el gen eftM, que codifica una nueva metiltransferasa que incorpora tres grupos metilo al residuo 5 de lisina de EF-Tu. EftM está muy conservado y ampliamente distribuido entre especies y es necesario y suficiente para metilar EF-Tu en P. aeruginosa o en otros sistemas heterólogos. EF-Tu está en la membrana externa exponiendo la región N-terminal trimetilada hacia el exterior. Dicha trimetilación facilita la invasión y transmigración bacteriana a través de queratinocitos humanos mediante la interacción con PAFR. P. aeruginosa reduce los niveles de proteína ZO-1 incrementando la permeabilidad paracelular de la barrera epitelial, proceso mediado por la activación de NF-κB. La carencia de EftM reduce la virulencia de P. aeruginosa en un modelo murino de infección de quemadura. La nueva metiltransferasa podría ser una nueva diana para el diseño de fármacos contra P. aeruginosa. / Introducció: Pseudomonas aeruginosa és un patogen oportunista que causa una gran varietat d’infeccions, entre les quals destaquen les infeccions respiratòries agudes i cròniques i les infeccions de ferides per cremada. A un treball previ, vàrem utilitzar anticossos específics per detectar la presència de l’epítop de fosforilcolina a la superfície del bacteri associat al factor d’elongació Tu (EF-Tu). Vàrem identificar que el gen eftM (Elongation Factor Tu Modifying enzime) és el responsable de la incorporació de fosforilcolina a EF-Tu. A més a més demostrarem que aquest epítop és clau per la colonització inicial del tracte respiratori per P. aeruginosa i el desenvolupament de pneumònia. En aquesta tesi hem investigat la contribució de la fosforilcolina a la interacció de P. aeruginosa amb els queratinocits epidèrmics humans i a les infeccions de ferides per cremades causades per aquest patogen. Contingut de la recerca: La proteïna EF-Tu recombinant purificada d’un aïllament clínic i d’un mutant isogènic desproveït del gen eftM funcional va ser analitzat per espectrometria de masses. L’anàlisi comparativa va demostrar que el producte de eftM és una metiltranferasa (EftM) que incorpora tres grups metil al residu 5 de lisina de EF-Tu donant lloc a un epítop estructuralment igual a la fosforilcolina. Mitjançant la combinació de tècniques de fraccionament cel·lular, microscopia electrònica i immunologia, hem demostrat que EftM trimetila EF-Tu al citoplasma, el qual és posteriorment transportat a la membrana externa, deixant el residu 5 trimetilat expossat cap a l’exterior. Els assajos d’invasió i transmigració amb cultius de queratinocits humans polaritzats infectats amb la soca parental o el mutant d’eftM demostraren que la trimetilació d’ EF-Tu facilita la migración de P. aeruginosa a través de la barrera epitelial. Això és degut al fet que la soca parental és capaç d’alterar, de forma més eficient que el mutant, la permeabilitat de la barrera epitelial mitjançant la reducció de l’expressió de ZO-1, una proteïna clau per a la integritat de l’epiteli. Els assajos amb un antagonista del receptor del factor activador de plaquetes (PAFR) demostraren que aquest receptor actua com a intermediari en la interacció de P. aeruginosa amb els queratinòcits a través d’EF-Tu trimetilat. No obstant això, la reducció de ZO-1 no és deguda directament a la interacció EF-Tu-PAFR, sino que està induïda per l’activació, per part de P. aeruginosa, del factor de transcripció cel·lular NF-κB. Finalment, els experiments a un model murí d’infecció per cremada demostraren que la mutació d’eftM redueix la virulència i la capacitat de disseminació de P. aeruginosa. Conclusions: S’ha identificat el gen eftM, que codifica una nova metiltransferasa que incorpora tres grups metil al residu 5 de lisina d’EF-Tu. EftM està molt conservat i àmpliament distribuït entre espècies i és necessari i suficient per metilar EF-Tu a P. aeruginosa o a altres sistemes heteròlegs. EF-Tu està a la membrana externa exposant la regió N-terminal trimetilada cap a l’exterior. Aquesta trimetilació facilita la invasió i transmigració bacteriana a través de queratinocits humans mitjançant la interacció amb PAFR. P. aeruginosa redueix els nivells de proteïna ZO-1, incrementant la permeabilitat paracel·lular de la barrera epitelial, procés mitjançat per l’activació de NF-κB. La mancança d´EftM redueix la virulència de P. aeruginosa a un model murí d’infecció de cremada. La nova metiltransferasa podria ser una nova diana pel disseny de fàrmacs contra P. aeruginosa. / Introduction: Pseudomonas aeruginosa is an opportunistic pathogen responsible of a wide range of infections including acute and chronic respiratory infections and wound burn infections. In a previous study, we used specific antibodies to detect the presence of the phosphorylcholine epitope on the bacterial surface linked to the elongation factor Tu (EF-Tu). We identified the gene eftM (Elongation Factor Tu Modifying enzime) as the responsible of the modification of EF-Tu with phosphorylcholine. In addition, we demonstrated that this epitope is crucial for initial colonization of the respiratory tract by P. aeruginosa and for development of pneumonia. In this Thesis we have investigated the contribution of the phosphorylcholine in the interaction of P. aeruginosa with the human epidermic keratinocytes and in the burn wound infections caused by this pathogen. Research: A tandem mass spectrometry analysis was choosen to compare recombinant EF-Tu purified from a clinical isolate and from an isogenic eftM deficient mutant. Comparative analysis shown that the product of eftM, is a methyltransferase (EftM) that transfers three methyl groups to the lysine residue 5 of EF-Tu resulting in a chemical structure similar to phosphorylcholine. Through a combination of approaches, including sub-cellular fractionation, electronic microscopy and immunological techniques, we demonstrated that EftM trymethylates EF-Tu in the cytoplasm, which is subsequently transported to the outer membrane, leaving the trimethylated residue 5 exposed outwards. Invasion and transmigration experiments with cultured human polarized keratinocytes infected with the wild-type strain or the eftM mutant demonstrated that the trimethylation of EF-Tu mediates the migration of P. aeruginosa through the epithelial barrier. Accordingly, the wild-type strain increased the paracellular permeability and reduced the expression of ZO-1, a key protein for the integrity of the epithelial barrier, more efficiently than the mutant. An antagonist of the platelet activating factor receptor (PAFR) reduced the invasion and transmigration of the wild type strain but had no effect on the mutant suggesting that PAFR on the keratinocytes mediates the interaction with the modified EF-Tu. However, reduction of ZO-1 is not directly due to the interaction EF-Tu-PAFR, but is due to the activation of the transcription factor NF-κB induced by P. aeruginosa. Finally, we demonstrated the mutation of eftM impaired the virulence and the dissemination capacity of P. aeruginosa in murine model of wound burn infection. Conclusions: We have identified the gen eftM, encoding a novel methyltransferase, which links three methyl groups to the lysine residue 5 of EF-Tu. EftM is conserved and widely distributed among different species and is sufficient and necessary to methylate EF-Tu in P. aeruginosa and other heterologous systems. EF-Tu is on the outer membrane exposing the N-terminal trimethylated region outward. Trimethylation of EF-Tu promotes invasion and transmigration of the microorganisms via PAFR. Activation of NF-κB by P. aeruginosa induces the reduction of ZO-1 and increase the paracellular permeability of the epithelial barrier. Mutation of eftM reduces the virulence of P. aeruginosa in a murine model of wound burn infection. This opens up new avenues for the development of new drugs targeting this new methyltransferase.

Tesi realitzada a l'Hospital Universitari Mútua Terrassa / Acquired Immunodeficiency Syndrome (AIDS) was identified more than 30 years ago. The challenges for the clinicians and Human Immunodeficiency Virus (HIV)-infected individuals have changed over the years. Nowadays, viral replication is suppressed with Antiretroviral Therapy (ART). ART prevents AIDS related complications and decreases morbidity and mortality in HIV-infected subjects. However, mortality rates among HIV-infected individuals remain 3-15 times higher than those observed in the general population. The excess of mortality observed among HIV-infected subjects can be partly attributed to HIV-related illnesses. However, more than half of the deaths observed among HIV-infected patients treated with ART are due to co-morbid disorders related to aging. It is nowadays considered that HIV-infected patients are aging prematurely. Multiple hypotheses have been made to explain this premature aging. Chronic systemic inflammation, reduced vascular endothelial reactivity, increased endovascular hypercoagulability and immune activation have been suggested as possible mechanisms. These processes are more prevalent in HIV-infected patients (treated and non-treated) than in the general population. Therefore, HIV-infected patients are prone to develop age-related diseases or co-morbidities. Among these co-morbidities, HIV-infected patients present increased cardiovascular risk, more prevalence of traditional cardiovascular risk factors and early onset of the atherosclerotic disease. However, the underlying mechanisms are not known yet. HIV-infection has been suggested as a potential contributor to atherosclerosis. Given the unique effects of HIV on the immune system, it is plausible to consider that HIV infection itself could be involved in atherosclerosis. The link between both may be the result of a generalized increase in the activity of the inflammatory pathways, especially the cytokine network. It is possible that these alterations in the inflammatory system may modulate the risk of atherosclerosis in HIV-infected individuals. These alterations may be caused by DNA sequence variants and/or by changes in the expression patterns of inflammatory pathway genes induced by the HIV-infection or by ART. The purpose of this study was to investigate the possible association between genetic variants and gene expression of genes involved in inflammation and cardiovascular risk measures in a cohort of HIV-infected subjects. The associations identified between genetic variants in the studied genes and CVR measures were modest. This suggests that SNPs may play a minor role and not be the underlying cause of the increased CVR observed in HIV-infected individuals. HIV-related CVD is probably influenced by non-genetic factors such as traditional CVR factors, the HIV-virus itself and by ART. The gene expression of the investigated genes is altered in HIV-related atherosclerotic disease. The findings regarding 5-LO pathway are the most relevant of this study. This part of the inflammatory pathway is important in the metabolism of lipids, which is closely related to atherosclerosis. To our knowledge this is the first study describing the implication of the 5-LO pathway in HIV-related atherosclerosis. Genetic variants in two key genes of this pathway (ALOX5 and ALOX5AP) were associated with HIV-related atherosclerosis. Although no differences were found in their gene expression, ART introduction reduced ALOX5AP gene expression levels, but not to the levels observed in uninfected controls justifying the importance of early ART initiation. Importantly, the 5-LO pathway interlinks lipid metabolism and inflammation and it is altered in HIV-infection. Thus, 5-LO pathway dysfunction may be critical in HIV-related atherosclerosis development. In summary, the findings reported in this thesis show that there is an intricate relationship among HIV-infection, antiretroviral treatment, atherosclerotic disease and the inflammatory pathway.

El Orden Pleosporales incluye hongos dematiáceos con distribución cosmopolita y que suelen comportarse como saprofitos o parásitos de la madera y las hojas. Tienen notable repercusión agrícola debido a que causan cuantiosas pérdidas económicas por infección de cultivos, principalmente de cereales, verduras, frutales y pastos, y de plantas en general. En patología humana y veterinaria se han relacionado con afecciones que van desde colonizaciones cutáneas leves hasta infecciones diseminadas fatales, pasando por el hecho de que dentro de este orden se encuentran algunos de los hongos alergénicos más reconocidos como Alternaria y Epicoccum. La aerobiología de las conidias de Alternaria ha sido ampliamente estudiada por su gran importancia como fitopatógeno y alérgeno, no obstante, a pesar de que se ha demostrado alta homología entre algunas de sus moléculas alergénicas y factores de virulencia con las de otros géneros dentro de los Pleosporales, poco se conoce acerca de la diversidad y distribución en la atmósfera y del efecto de los factores ambientales sobre estos otros Pleosporales. Barcelona y su área metropolitana es una zona densamente poblada con un clima templado influenciado por el mediterráneo y caracterizado por veranos cálidos y secos e inviernos no muy fríos y otoños y primaveras lluviosos, condiciones consideradas óptimas para el desarrollo de la mayoría de los hongos. La prevalencia de enfermedades alérgicas en la zona es alta, y la sensibilización a alérgenos fúngicos afecta a más del 23% de la población atópica, asociándose principalmente a la frecuencia de las esporas de Alternaria en el aire. No obstante, el aporte de otros taxones filogenéticamente relacionados con Alternaria a la aerospora de Barcelona se desconoce. Con el propósito de dilucidar el comportamiento aerobiológico de los Pleosporales en Barcelona, se procedió a: 1) establecer el comportamiento estacional de las esporas de Pleosporales más frecuentemente identificadas en el aire de tres regiones en Cataluña con diferentes características ambientales (Barcelona, Bellaterra y Lleida), su dinámica a través de un periodo de 15 años y la correlación con los parámetros meteorológicos por medio del análisis retrospectivo de las bases de datos de la Xarxa Aerobiològica de Catalunya desde 1995 al 2009; 2) identificar las esporas de Pleosporales (diversidad) en el aire de la ciudad de Barcelona durante el año 2010, determinando el comportamiento horario y diario de cada taxón y el efecto de las variables meteorológicas sobre su presencia y variabilidad en la atmósfera; y 3) analizar la presencia de Pleosporales en el aire y el polvo sedimentado en ambientes intra y extradomiciliarios de las viviendas de individuos sensibilizados a Alternaria y un grupo control (no sensibilizados al hongo) en Barcelona durante las cuatro estaciones climáticas y empleando métodos para hongos viables y no viables, además de determinar los niveles del alérgeno Alt a 1 en las muestras de polvo del interior de las viviendas. El estudio retrospectivo de 15 años de monitoreo, permitió establecer que los Pleosporales mitospóricos predominaron en la aerospora de todas las zonas estudiadas, siendo Alternaria el taxón más frecuentemente observado. Las mayores concentraciones se presentaron en zonas rurales (Lleida) o semiurbanas (Bellaterra) comparadas con los ambientes urbanos (Barcelona). Los Pleosporales mitospóricos presentaron un comportamiento estacional con un incremento del nivel de las esporas asociado al aumento de la temperatura y la disminución de la humedad relativa. En contraste, los Pleosporales meiospóricos no mostraron un patrón claro, aunque si evidenciaron un comportamiento contrario a los mitospóricos, correlacionándose principalmente a periodos de humedades relativas altas. Durante el año 2010 se identificaron 32 taxones de Pleosporales, nuevamente con el predominio de los estadios mitospóricos a expensas de las conidias de Alternaria, Epicoccum y Stemphylium. Dentro de los Pleosporales meiospóricos las ascosporas de Leptosphaeria y Pleospora fueron las más representativas. Aunque el comportamiento horario no fue común entre todos los Pleosporales, se describió una tendencia a la liberación diurna (hacia el mediodía) de las esporas entre los mitospóricos y nocturna (hacia la madrugada) en los meiospóricos. Con respecto al estudio de los ambientes intra y extradomiciliarios, los hallazgos corroboran la infravaloración de los niveles de hongos cuando se emplean solamente los métodos para organismos viables ya que no permiten el crecimiento de Pleosporales meiospóricos y la cuantificación de los mitospóricos en forma de unidades formadoras de colonias (UFC) da resultados significativamente inferiores a los métodos para no viables. Adicionalmente se observó que las concentraciones fueron evidentemente mayores en el exterior que en el interior, y que eran aún superiores cuando la vivienda se ubicaba en zonas rurales que en semiurbanas. Alternaria fue también el taxón más comúnmente observado en el método viable, tanto en las muestras de aire en el interior como en las del exterior. En cuanto a las superficies, aquellas obtenidas de exteriores presentaron un mayor número de esporas o UFC por cm² y una mayor diversidad de Pleosporales que las de interiores, y estuvieron dominadas por los Pleosporales productores de macroconidias. Las esporas y UFC fueron significativamente mayores durante el verano, tanto en el aire interior como en el exterior, no obstante sobre las superficies de exterior los mayores recuentos se presentaron en invierno o en otoño. Algunas características de las viviendas, como la presencia de moquetas, la ventilación natural por ventanas abiertas y la presencia de mascotas, se correlacionaron con los niveles de algunos taxones de Pleosporales. Los hallazgos sugieren que la abundancia de los Pleosporales en la atmósfera podría representar riesgo de sensibilización para los individuos expuestos o de exacerbación de los síntomas en los ya sensibilizados a los alérgenos de Alternaria u otros Pleosporales, debido principalmente a la reactividad cruzada. Para establecer el riesgo real que supone la exposición a estos agentes, es necesario demostrar la presencia del gen que codifica para Alt a 1 y la producción de esta proteína en los géneros de Pleosporales comunes en el aire. También hay que continuar con la búsqueda de otras moléculas alergénicas determinando la prevalencia de sensibilización a estos nuevos alérgenos en la población. / Order Pleosporales includes dematiaceous fungi with cosmopolitan distribution and usually behaving as saprophytes or parasites of wood and leaves. Pleosporales have an important impact on agriculture because they cause economic losses by infecting crops (mainly cereal, vegetables, fruits and pastures), and plants in general. In human and veterinarian pathology they have been linked to a wide range of illnesses from mild skin colonization to fatal disseminated infections, and through allergy, as the most recognized allergenic fungi (Alternaria and Epicoccum) are comprised amongst of them. Aerobiology of Alternaria conidia has been intensively studied because of its huge importance as phytopathogen and allergen; however, despite high homology between some allergenic molecules and virulence factors with other Pleosporales genera has been demonstrated , little is known about the diversity and distribution in the atmosphere of these other Pleosporales and the effects that environmental factors have on them. Barcelona and its metropolitan area is a densely populated area with a mild climate influenced by the Mediterranean Sea. It is characterized by warm and dry summers and mild winters, as well as by rainy springs and falls. These conditions are considered optimal for the development of most fungi. The prevalence of allergic diseases in the area is high, and sensitization to fungal allergens affects more than 23% of the atopic population, mainly associated with the frequency of Alternaria spores in the air. However, the contribution to the aerospora of Barcelona of other taxa phylogenetically related to Alternaria is unknown. In order to elucidate the aerobiological behavior of the Pleosporales in Barcelona, this study aimed to: 1) establish the seasonal behavior of the most common Pleosporales spores identified in the air of three regions with different environmental characteristics in Catalonia (Barcelona, Bellaterra and Lleida); their dynamics in the atmosphere and correlation with meteorological parameters in a 15 years period using data from 1995 to 2009 provided by the Xarxa Aerobiològica de Catalunya , 2) identify Pleosporales spores (diversity) in the air of Barcelona year 2010, determining for each taxon the hourly and daily distribution and the effect of meteorological parameters, and 3) analyze the presence of Pleosporales spores in the air and settled dust in indoors and outdoors housing environments of people sensitized to Alternaria and a control group (not sensitized to the fungus) in Barcelona, at four moments in the year corresponding to climatic seasons, using methods for viable and non-viable fungi and also measuring the alt a 1 allergen in the indoor dust samples. The study of the 15 years dataset showed that Alternaria was the most frequent mitosporic Pleosporales taxon in the aerospora of the three studied areas. The highest concentrations occurred in the rural (Lleida) and suburban (Bellaterra) areas, while the urban environment (Barcelona) showed lower levels. Mitosporic Pleosporales presented seasonal behavior, increasing their levels with increasing temperature and decreasing relative humidity. In contrast, meiosporic Pleosporales did not show a clear pattern, and correlated mainly with periods with high relative humidity. In 2010, 32 Pleosporales taxa were identified, again with the predominance of mitosporic stages due to the abundance of Alternaria, Epicoccum and Stemphylium conidia. Within meiosporic Pleosporales, Leptosphaeria and Pleospora ascospores were the most representative. Regarding the hourly behavior, mitosporic Pleosporales showed a tendency to be released during daylight (about noon) while meiosporic Pleosporales showed a nocturnal release tendency (toward dawn). With regard to the study of indoors and outdoors environments, our results corroborated that fungi levels were underestimed not only when using measuring methods for viable organisms, which do not allow meiosporic Pleosporales growth, but also when making the quantification of colony forming units (CFU) of mitosporic taxa and comparing them with total spore counts. Additionally, it was found that the concentrations were obviously higher outdoor than indoor, and were even higher in rural than in suburban areas. Alternaria was also the most commonly observed taxon in the viable method, both in indoor and outdoor air samples. Regarding outdoor surfaces, they showed higher number of spores or CFU/cm² and higher Pleosporales diversity than indoor surfaces and were dominated by taxa producing macroconidia. Counts of Spores and CFU were significantly higher during summer, both in indoors and outdoors air, however, counts of the outdoor surfaces samples were higher in winter and autumn. Some characteristics of homes, such as presence of carpets, natural ventilation through open windows and having pets, showed correlations with the levels of some taxa Pleosporales. These findings suggest that the abundance of Pleosporales spores in the atmosphere could be a risk of sensitization to the exposed people and of exacerbation of symptoms in those already sensitized to allergens of Alternaria or other Pleosporales, mainly due to cross-reactivity. To establish the actual risk of the exposure to these particles, it is necessary to demonstrate the presence of the gene coding for Alt a 1 and the production of this protein in common Pleosporales taxa in the air. It is also important to pursue the search for other allergenic molecules and to determine the prevalence of sensitization of the population to these new allergens.

Se ha estudiado el efecto de la alimentación en las zonas húmedas construidas de flujo sub_superficial horizontal, en la eficacia y eficiencia para eliminación de materia orgánica, nutrientes y microorganismos, de las aguas residuales municipales. El fin perseguido es dar aportes en la gestión de este tipo de tratamientos, comunes en pequeñas comunidades (de menos de 1000 habitantes). Para lograr ese objetivo general, se realizó el estudio en unas zonas húmedas construidas piloto en la EDAR de Montcada i Reixac, así como también se estudiaron los casos de las zonas húmedas localizadas a ambos márgenes del río Besòs, la EDAR de Els Hostalets de Pierola y el sistema de zonas húmedas terciarias del río Ripoll. En la EDAR de Montcada i Reixac, se analizaron los desempeño de 4 de las zonas húmedas piloto, de las cuales, dos operaban con cubierta vegetal de Phragmites australis, mientras las otras dos no la poseían. Además dos de las zonas húmedas operaron con alimentación continua, mientras que las otras dos lo realizaron de manera fraccionada, manteniendo constante la carga hidráulica en cada una de ellas. Asimismo se analizaron cuatro estudios de caso, con diferentes calidades del influente: dos de ellos empleado las zonas húmedas como mejorador paisajístico, en dos parques fluviales. Un tercer estudio de caso se realizó empleando como influente agua residual de una porqueriza (con elevados valores de materia orgánica). El último estudio de caso se realizó en la EDAR de Els Hostalets de Pierola, que permite la operación de su zona húmeda, como un tratamiento secundario o terciario. Se observa que la alimentación fraccionada mejora notablemente la eficiencia en la reducción de materia orgánica, nutrientes y microorganismos: Esto debido a que el humedal construido, logra mejorar sus condiciones aeróbicas, por lo que se facilita la eliminación de materia orgánica mediante mecanismos aeróbicos, así como la oxidación de los compuestos nitrogenados, fomentando la formación de nitratos los cuales posteriormente son eliminados en las zonas anaerobias de la zona húmeda. De los estudios de caso se puede señalar varias conclusiones: La primera de ellas es que las zonas húmedas construidas son sistemas muy nobles que permiten una amplia variación en la carga del influente, tanto de carga hidráulica como de carga contaminante. Sin embargo, se debe asegurar una adecuada composición C/N (expresada como DQO/N-NO3) para que las bacterias logren realizar los procesos de nitrificación/ desnitrificación y asi eliminar el nitrógeno del agua. Otra de las conclusiones obtenidas al realizarse los estudios de caso, es que la alimentación interrumpida (con periodos de llenado y vaciado del mismo), mejora las condiciones de eliminación de materia orgánica, no así de la eliminación de nutrientes. Finalmente se detallan una serie de acciones a realizar por el gestor del humedal artificial, para llegar a mejorar la eficiencia y eficacia de las zonas húmedas construidas de flujo subsuperficial horizontal. / This study is mainly focused in the feeding effect for effectiveness and efficiency at horizontal subsurface flow constructed wetlands, for organic matter, nutrients and microorganism removal, from municipal wastewater. The main objective is to provide guides for the management of this type of wastewater treatment, commonly used at small communities (with less than 1000 inhabitants) To achieve this overall objective, the study was conducted in some pilots wetlands at the Montcada and Reixac´s WWTP (Barcelona, Spain), and also some test were carry on as case studies in other constructed wetlands. Four pilot wetlands were tested at the WWTP of Montcada andi Reixac. Two of these pilots were operating with vegetation cover (Phragmites australis), while the other two had not. Furthermore two pilot wetlands operated with continuous feeding, while the other two it performed fractionally but maintaining constant the hydraulic load in each one. The four case studies where take with different qualities of influent: two of them used the constructed wetland’s effluent, to improve the water quality of two rivers: the Besos´s river and the Ripoll´s river. The third case study was performed by using influent wastewater as a pigsty (with high values of organic matter, and nutrients). And the final case study was conducted in the Els Hostales de Pierola´s WWTP which allows the operation of its constructed wetland as a secondary or tertiary treatment. The study shows that fractional feeding improves the efficiency for organic matter and nutrients removal. Mainly, this is due to the aeration improving by the fractional feeding and by this way, is possible to increase the nitrification rate. So, the constructed wetlands allow the nitrification and the denitrification to take place and by this way nutrients (as nitrogen) can be removed. From the case studies several points can be indicated as main conclusions: The first is that constructed wetlands are very noble treatments systems, because they allow a wide variation in the influent load (by hydraulic and pollutant load). However, an appropriate C/N relation (expressed as COD/NNO3) had to achieve in order to increase bacteria perfom of nitrification/denitrification rates. By frequent interrupting feeding (with periods of filling and emptying of the wastewater), the constructed wetlands increase the organic matter removal, but not the nutrients removal.

El sistema SOS es una respuesta génica global muy extendida dentro del dominio Bacteria que se induce en presencia de lesiones en el DNA y permite la reparación del material genético y la supervivencia celular. La activación del sistema SOS no sólo genera un aumento en la expresión de genes que codifican las proteínas reguladoras del sistema, LexA (represor transcripcional) y RecA (proteína activadora), o de otros genes involucrados en procesos de reparación del DNA, recombinación o inhibición de la división celular. La activación del sistema SOS también está asociada a la expresión de toxinas, la inducción del ciclo lítico de profagos residentes, la expresión y diseminación de resistencias a antibióticos y la transferencia horizontal de islas de patogenicidad y elementos conjugativos. Todo ello sugiere la implicación del sistema SOS en el desarrollo del proceso infectivo. Asimismo, mutantes defectivos en el gen recA de diversos patógenos bacterianos son atenuados, demostrando la importancia de la proteína activadora del sistema en la virulencia. Sin embargo, además de actuar como activadora del sistema SOS, RecA es la principal responsable de los procesos de recombinación homóloga. Esta doble función de la proteína RecA ha impedido establecer si es la incapacidad para inducir la respuesta SOS o la incapacidad para realizar recombinación homóloga la responsable de la atenuación de los mutantes defectivos en recA. Por este motivo, el objetivo principal de este trabajo ha sido determinar el papel del sistema SOS y de la proteína RecA en el proceso infectivo de Salmonella enterica sv. Typhimurium (S. Typhimurium), uno de los principales agentes causales de toxiinfección alimentaria a nivel mundial. Los resultados obtenidos en este estudio demuestran que la sobreexpresión de recA genera un descenso significativo en la capacidad infectiva de este patógeno, lo que indica que durante la infección por S. Typhimurium es necesario el mantenimiento de unos niveles basales de expresión de dicho gen. Asimismo, las pruebas realizadas demuestran que la sobreexpresión de recA genera un descenso en la capacidad para invadir células epiteliales y para traspasar el epitelio intestinal, dos procesos esenciales para que S. Typhimurium pueda establecerse en el intestino y causar infección. De igual modo, este trabajo demuestra que la acumulación de proteína RecA en el interior celular inhibe el movimiento en enjambre (o swarming), un movimiento poblacional sobre superficies semisólidas asociado a la capacidad de numerosos patógenos, entre ellos S. enterica, para invadir tejido epitelial. Esta inhibición tiene lugar a través de la interacción de la proteína RecA con la proteína CheW, implicada en la ruta de señalización de quimiotaxis asociada a este movimiento. Por lo tanto, los resultados de este trabajo añaden el movimiento poblacional a la lista de procesos celulares conocidos que se asocian al sistema SOS y confieren una nueva función a este sistema y a la proteína RecA como reguladores de dicho movimiento en S. Typhimurium. De este modo, la inducción de la respuesta SOS en entornos lesivos para el DNA inhibe el movimiento en enjambre e impide el acercamiento de las células a entornos con concentraciones mayores de compuestos lesivos. / The SOS response is a wide-spread regulatory network in the Bacteria domain. Induction of this response occurs in the presence of DNA lesions and it is targeted to address DNA damage and to allow cell survival. The induction of the SOS response causes an increase in the expression of the genes encoding for the system regulatory proteins, LexA (the transcriptional repressor) and RecA (the activator protein), and an increase in the expression of other genes involved in DNA repair processes, homologous recombination and inhibition of cell division. But the induction of the SOS response is also associated with the expression of toxins, the induction of the lytic cicle of resident prophages, the expression and horizontal dissemination of antibiotic resistances, and the horizontal dissemination of pathogenicity islands and integrating conjugative elements. These data suggest that the SOS system plays a key role during the infection process. Moreover, recA mutants of several pathogenic bacteria are avirulent. This demonstrates that the SOS activator is involved in virulence. However, besides acting as the activator of the SOS system, RecA is primarily responsible for the homologous recombination processes. Due to the dual role of the RecA protein, the decrease in virulence of the recA mutants may be attributed either to the reduction of the recombination frequency, or to the inhibition of the SOS system induction, or to both processes. The aim of this work is to elucidate the role developed by the SOS system and by the RecA protein during the infection process of Salmonella enterica sv. Typhimurium (S. Typhimurium), one of the most important pathogens causing foodborne outbrakes in the world. The results obtained in this work show that the overexpression of the recA gene causes a significant decrease in the fitness of this pathogen. Thus, the expression of this gene must remain at its basal level during the infection process developed by S. Typhimurium. Moreover, the overexpression of the recA gene causes a decrease in the ability of this pathogen to invade epithelial cells and to pass through the intestinal epithelium, two essential processes allowing S. Typhimurium to cause the infection. Furthermore, this work demonstrates that the increase in the intracellular concentration of the RecA protein inhibits swarming motility, a multicellular movement over semisolid surfaces associated with the ability of several pathogens, including S. enterica, to invade epithelial cells. This inhibition is caused by the interaction between the RecA protein and the CheW protein, which is associated to the chemotaxis system. The results exposed in this work increase the number of known cellular processes that are associated to the SOS response, conferring a new role on this system and on the RecA protein as regulators of swarming motility in S. Typhimurium. In this context, the induction of the SOS response in the presence of DNA damaging compounds inhibits this kind of motility, avoiding the exposure of the cells to even higher concentrations of such compounds.

Les anomalies cromosòmiques numèriques i estructurals, són sovint causa d'infertilitat. Es conegut el fet que els homes portadors de translocacions recíproques equilibrades presenten un increment en la incidència de pèrdues embrionàries i de descendència afectada. La característica principal de l'espermatogènesi d'aquests pacients és la presència d'un tetravalente que permet l'aparellament a paquité dels cromosomes reorganitzats amb els seus homòlegs. La configuració del tetravalent determina el seu comportament i, conseqüentment, la producció de diferents proporcions de gàmetes equilibrades i desequilibrades. La seva estructura està condicionada pels fenòmens de recombinació. Diferents factores poden alterar la freqüència de recombinacions dins el tetravalente, com per exemple la morfologia dels cromosomes implicats i la llargada dels segments intersticials i translocats. Els cromosomes translocats poden segregar seguint quatre patrons diferents: alternant, adjacent I, adjacent II i 3:1. El fenotip alternant és el més freqüent, i també és l'únic que pot donar lloc a descendència normal. Cal remarcar que, en el cas que ocorri una recombinació intersticial, el fenotip alternant també pot produir-se a partir de la segregació adjacent I.En aquest treball, hem analitzat mostres d'esperma i/o biòpsies testiculars en cinc pacients portadors de les següents translocacions: t(4;8)(q28;p23), t(1;13)(q41;q22), t(3;19)(p21;p13.3) t(11;17)(q13.1;p11.2) i t(10;14)(q24;q32). L'ús de tècniques d'hibridació in situ fluorescent (FISH) ha permès establir els percentatges de gàmetes equilibrades i desequilibrades per a cada un dels pacients. Els resultats obtinguts oscil·len entre 30.5% i 44.3% per a les formes equilibrades, i entre 55.7% i 69.5% per a les desequilibrades. La segregació meiòtica del portador de la t(4;8)(q28;p23) es va determinar a partir de dues metodologies diferents, el sistema hàmster-humà i la tècnica de nuclis d'espermatozoide descondensats. La comparació dels resultats obtinguts no mostrà diferències significatives entre el total de gàmetes equilibrades i desequilibrades. No obstant, les freqüències de la segregació 3:1 obtingudes en els dos anàlisis sí foren significativament diferents (p<0.0001). Aquesta diferència es podria explicar per factors limitants de cada una de les tècniques (una mala eficiència d'hibridació o una descondensació excesiva del DNA poden donar lloc a guanys o pèrdues aparents de senyals fluorescents).L'ús de FISH sobre nuclis descondensats també permet la detecció de possibles efectes intercromosòmics (ICE). Els resultats obtinguts en l'anàlisi realitzat en els cinc pacients no evidencia la presència d'ICE, excepte en el portador de la t(4;8).L'aplicació de FISH sobre cromosomes meiòtics dels portadors t(11;17) i t(10;14) ha permès la identificació dels cromosomes translocats en estadi de MI i MII. Així, s'han obtingut dades relatives a la configuració del tetravalent, a la distribució de les recombinacions en el tetravalent i a la segregació dels cromosomes. Els resultats obtinguts mostren una disminució en el nombre de recombinacions per cèl·lula en la t(11;17) (p=0.001). En la t(10;14), la freqüència de recombinació en el segment intersticial és major que l'observada en bivalents controls dels cromosomes 10 i 14. També s'ha analitzat el comportament dels cromosomes sexuals al llarg del procés meiòtic. La incidència de les anomalies sexuals disminueix a mesura que avança l'espermatogènesi. Resumint, els nostres resultats suggereixen que el bloqueig meiòtic estaria més condicionat per la presència d'univalents que per la presència de desequilibris cromosòmics originats durant la segregació del tetravalent. Finalment, hem aplicat la tècnica de cenM-FISH sobre extensions de complexes sinaptonemals, prèviament detectades mitjançant immunocitogenètica, identificant cada un dels bivalents en el 92% de les cèl·lules analitzades (n=60). Posteriorment, els bivalents es poden cariotipar en estadi de paquitè. La tècnica de cenM-FISH pot ser molt útil per a la caracterització simultània de tots els bivalents en paquitè. / As it is well known, chromosome aberrations are a major cause of infertility. Moreover, male heterozygous carriers of reciprocal translocation have an increased risk of pregnancy loss and the birth of handicapped progeny. The main particularity of the spermatogenesis in human male translocation carriers is the way the translocated chromosomes found to associate themselves during the meiosis I. This structure is known as quadrivalent. The configuration of the quadrivalent determines the behaviour of this structure, and consequently the production of different proportions of balanced and unbalanced gametes. The quadrivalent structure's configuration is strongly defined by the formation of crossing-over. Different factors can affect the likelihood of crossing-over within the quadrivalent: the morphology of the chromosomes involved and the length of the interstitial and translocated segments are some of them. Translocated chromosomes segregate following one of the four possible segregation modes: alternate, adjacent I, adjacent II and 3:1. The predominant forms of segregation are alternate and adjacent I. Alternate phenotype is the most common found in many of the translocations studied and it is also the only phenotype that yields normal offspring. It is important to observe that if an interstitial chiasma occurs, alternate phenotypes may also be generated by an adjacent I segregation, and vice versa. In this study, meiotic analysis has been performed by either sperm data (human-hamster system or decondensed sperm nuclei) or testicular biopsy analysis in five different translocation carriers, t(4;8)(q28;p23), t(1;13)(q41;q22), t(3;19)(p21;p13.3) t(11;17)(q13.1;p11.2) and t(10;14)(q24;q32) . Using fluorescence in situ hybridisation techniques (FISH), percentages of balanced and unbalanced spermatozoa have been established for each carrier. The results obtained range between 30.5% and 44.3% for balanced and 55.7% and 69.5% for unbalanced gametes. Part of this work was the determination of meiotic segregation of a t(4;8)(q28;p23) carrier by two different methods, human-hamster system and sperm nuclei. Comparison made between the results obtained in the two analyses showed a lack of statistical differences between the total of balanced versus unbalanced forms. However, a statistically significant difference was found between the frequencies of 3:1 segregants obtained from the two methods (p<0.0001). Technical artefacts could explain this discrepancy (overlapping of signals in the sperm nuclei assay, unequal hybridisation efficiency of the used probes or even an over decondensation of the DNA can lead to apparent gains of fluorescent signals). FISH on decondensed sperm nuclei also allows for the detection of interchromosomal effects. Results obtained in the aneuploidy analysis performed on all five subjects have not shown any evidence for an interchromosomal effect, except for t(4;8) carrier.FISH has also been applied on meiotic chromosome spreads to identify translocated chromosomes in two different translocation carriers, t(11;17) and t(10;14). In doing so, data about pairing of homologous chromosomes, configurations of the quadrivalent, crossing-over distributions within a tetravalent, and segregation pattern frequencies have been obtained. Results obtained have shown a significant decrease in the chiasma frequency per cell in t(11;17) (p=0.001). In t(10;14), the recombination frequency within the interstitial segment of the quadrivalent is higher than the observed in control bivalents of chromosomes 10 and 14. The behaviour of sex chromosomes throughout meiotic process has been analysed. The incidence of sex anomalies decreased progressively in subsequent spermatogenic stages. Our results suggest that meiotic arrest processes would be more conditioned by the presence of univalents rather than by chromosomal unbalances. Finally, cenM-FISH has been applied on synaptonemal complexes spreads previously analysed using immunocytogenetic technique, allowing us to unequivocally identify all chromosomes in 92% of the studied cells (n=60). Then, bivalents can be karyotyped at pachytene stage. CenM-FISH can be a very useful tool for the simultaneous characterization of all pachytene chromosomes.

INTRODUCCIÓN: Los aminoglucósidos han ido perdiendo su lugar en el arsenal terapéutico para combatir las infecciones por enterobacterias, en parte debido al surgimiento de otros antibióticos de mayor espectro y menor toxicidad, como las cefalosporinas de 3a y 4a generación o las fluoroquinolonas, y en parte al incremento de resistencias, debidas fundamentalmente a la presencia de enzimas modificadoras de aminoglucósidos (EMAG). Sin embargo, tras la aparición de cepas multiresistentes para las que las alternativas terapéuticas son muy limitadas, los aminoglucósidos recuperaron importancia en el tratamiento de infecciones, especialmente en el medio hospitalario. En el laboratorio de Microbiología Clínica los aminoglucósidos representan un grupo de antimicrobianos para los que es difícil la interpretación del antibiograma de disco difusión. OBJETIVOS: Conocer la prevalencia de resistencia a aminoglucósidos en Enterobacteriaceae en nuestro medio y la prevalencia de genes de EMAG, así como las características fenotípicas de los halos de inhibición. Determinar la asociación entre la resistencia por técnica de disco difusión, la presencia de genes de EMAG y las características fenotípicas del borde del halo de inhibición, creando reglas que ayuden a la interpretación del antibiograma de disco difusión de aminoglucósidos en Enterobacteriaceae. METODOLOGÍA: Se ha realizado un estudio transversal descriptivo y observacional en el que se han analizado 788 aislados de enterobacterias aisladas entre el 1 de Enero de 2006 y el 31 de Marzo de 2006 en el Hospital de la Santa Creu i Sant Pau de Barcelona, España. Estudio de la sensibilidad a kanamicina, gentamicina, tobramicina, amikacina, netilmicina, neomicina, estreptomicina y espectinomicina por técnica de disco difusión, detección de los genes aph(3")-Ia, aph(3")-Ib, ant(3")-Ia, aph(3')-Ia, ant(2")-Ia, aac(3)-IIa, aac(6')-Ia, aac(6')-Ib, aac(6')-Ic, aac(3)-Ia, aac(3)-Ib, aac(2')-Ia mediante la técnica de la reacción en cadena de la polimerasa (PCR). Estudio de relación clonal de los aislados mediante ERIC-PCR y PFGE. RESULTADOS y CONCLUSIONES: La sensibilidad a los antimicrobianos en Enterobacteriaceae entre 2004 y 2006 en el Hospital de la Santa Creu i Sant Pau se ha mantenido estable en el grupo de los betalactámicos, mientras que ha aumentado un 30% la resistencia a las quinolonas y ha aparecido resistencia a amikacina, manteniéndose la resistencia a gentamicina y tobramicina menor al 10%. El patrón de resistencia a aminoglucósidos más prevalente fue el provocado por aph(3’’)-Ib que confiere resistencia a estreptomicina, presente en un tercio de los aislados resistentes a alguno de los aminoglucósidos estudiados. De los patrones que afectan aminoglucósidos de uso clínico, el más prevalente fue el provocado por aac(3)-IIa: resistencia a gentamicina y tobramicina, presente en el 60% de los aislados con resistencias a aminoglucósidos de uso clínico. La presencia de características fenotípicas en los halos de inhibición (halo cortante y salto de colonias) se asoció de manera significativa con la presencia de genes de EMAG en los 8 aminoglucósidos evaluados. / INTRODUCTION: Aminoglycosides have been losing their place in the therapeutic arsenal for combating enterobacterial infections, partly due to the emergence of other antibiotics greater spectrum and lower toxicity, such as cephalosporins or 3rd and 4th generation fluoroquinolones, and partly the increase of resistance, mainly due to the presence of aminoglycoside modifying enzymes (AME). However, after the emergence of multi-resistant strains for which therapeutic options are very limited, aminoglycosides regained importance in the treatment of infections, especially in hospitals. In the Clinical Microbiology Laboratory aminoglycoside antibiotics represent a group that is difficult for the interpretative reading of disk diffusion antibiogram. OBJECTIVES: To determine the prevalence of aminoglycoside resistance in Enterobacteriaceae in our area, the prevalence of AME genes and phenotypic characteristics of the inhibition zone edge. To determine the association between resistance by disk diffusion technique, the presence of AME genes and phenotypic features of the inhibition zone edge, creating rules to assist the interpretative reading of disk diffusion antibiogram of aminoglycosides in Enterobacteriaceae METHODS: We performed an observational descriptive study which analyzed 788 isolates of Enterobacteriaceae isolated between January 1, 2006 and March 31, 2006 at the Hospital de la Santa Creu i Sant Pau, Barcelona, Spain. Study of sensitivity to kanamycin, gentamicin, tobramycin, amikacin, netilmicin, neomycin, streptomycin and spectinomycin by disk diffusion technique, detection of genes aph (3")-Ia, aph (3")-Ib, ant (3")-Ia, aph (3')-Ia, ant (2")-Ia, aac (3)-IIa, aac (6')-Ia, aac (6')-Ib, aac (6')-Ic , aac (3)-Ia, aac (3)-Ib, aac (2')-Ia by the technique of polymerase chain reaction (PCR). Study of clonal relationships of isolates by ERIC-PCR and PFGE. RESULTS AND CONCLUSIONS: The antimicrobial susceptibility in Enterobacteriaceae between 2004 and 2006 in the Hospital de la Santa Creu i Sant Pau, Barcelona, Spain has remained stable in the beta-lactam group, while resistance to fluoroquinolones increased up to 30%, and has appeared amikacin resistance, while resistance to gentamicin and tobramycin continued below 10%. The most prevalent aminoglycoside resistance pattern was caused by aph (3'')-Ib conferring resistance to streptomycin, present in one third of the isolates resistant to one of the aminoglycosides studied. Of patterns affecting aminoglycosides in clinical use, the most prevalent was caused by aac (3)-IIa: resistance to gentamicin and tobramycin, present in 60% of isolates with resistance to aminoglycosides in clinical use. The presence of phenotypic features in the inhibition zone edge (sharper zone and colonies inside inhibition zone) was significantly associated with the presence of AME genes in the 8 aminoglycosides tested.