Les glutaredoxines (GRXs) són tiol oxidoreductases àmpliament repartides entre organismes procariotes i eucariotes. La Grx5 de llevat Saccharomyces cerevisiae es troba a la matriu mitocondrial i participa en la síntesi dels centres ferro-sofre (ISCs), que són co-factors necessaris per a diversos processos cel•lulars essencials des la respiració, la regulació de l'expressió gènica i el metabolisme de l'ADN-ARN. Algunes proteïnes amb ISCs estan involucrades en el metabolisme de l'ADN, més precisament en la replicació de l'ADN o en els processos de reparació del mateix. Treballs recents van demostrar que els defectes en el metabolisme de ISCs comprometen l'estabilitat del genoma cel•lular, i aquesta inestabilitat està associada a la predisposició a múltiples càncers humans. Mitjançant l'ús d'un mutant Δgrx5 de S. cerevisiae com a model d'estudi vam intentar entendre millor la relació entre la inestabilitat genòmica i els defectes en la biosíntesi de ISCs. L'absència de la proteïna mitocondrial Grx5 condueix a un augment de la inestabilitat genètica. Aquesta inestabilitat del genoma no depèn de l'acumulació de ferro que es produeix en les cèl • lules que no tenen Grx5. Les cèl • lules que no expressen Grx5 tenen majors nivells de dany constitutiu a l'ADN, que s'associa específicament a la formació de "focis" associats a Rad52. Les cèl • lules que no tenen Grx5 i Ssq1 són hipersensibles a agents que danyen l'ADN de forma additiva. Aquesta sensibilitat és independent de l'estat d'estrès oxidatiu constitutiu que es produeix en les cèl • lules que no tenen Grx5. L'absència de les proteïnes Grx5 i Ssq1 provoca un retard en la progressió del cicle cel • lular a través de la fase S. La via de reparació de l'ADN, recombinació homòloga podria tenir un paper important en la reparació dels danys en l'ADN en les cèl • lules del mutant Δgrx5. / Las glutaredoxinas (GRXs) son tiol oxidoreductasas ampliamente distribuídas entre organismos procariotas y eucariotas. La proteína Grx5 de levadura Saccharomyces cerevisiae se encuentra en la matriz mitocondrial y participa en la síntesis de los centros hierro-azufre (ISCs), que son co-factores necesarios para varios procesos celulares esenciales, tales como la respiración hasta la regulación de la expresión génica y el metabolismo del ADN-ARN. Algunas proteínas asociadas a ISCs están involucradas en el metabolismo del ADN, más precisamente en su replicación o en procesos de reparación del mismo. Trabajos recientes demostraron que los defectos en el metabolismo de ISCs comprometen la estabilidad del genoma celular, y esta inestabilidad está asociada a la predisposición a múltiples cánceres humanos. Mediante el uso de un mutante Δgrx5 de S. cerevisiae como modelo de estudio quisimos abordar la comprensión de la relación entre la inestabilidad genómica y los defectos en la biosíntesis de ISCs. La ausencia de la proteína mitocondrial Grx5 conduce a un aumento de la inestabilidad genética. Esta inestabilidad del genoma no depende de la acumulación de hierro que se produce en las células que carecen Grx5. Las células que no expresan Grx5 tienen mayores niveles de daño constitutivo al ADN, que se asocia específicamente a la formación de “focis” asociados a Rad52. Las células que carecen Grx5 y Ssq1 son hipersensibles a agentes que dañan el ADN de forma aditiva. Esta sensibilidad es independiente del estado de estrés oxidativo constitutivo que se produce en las células que carecen de Grx5. La ausencia de las proteínas Grx5 y Ssq1 provoca un retraso en la progresión del ciclo celular a través de la fase S. La vía de reparación del ADN, recombinación homóloga podría desempeñar un papel importante en la reparación de los daños en el ADN en las células del mutante Δgrx5. / Glutaredoxins (GRXs) are thiol oxidoreductases widely spread among prokaryotic and eukaryotic organisms. Saccharomyces cerevisiae Grx5 is located at the mitochondrial matrix and participates in the synthesis of iron-sulphur clusters (ISCs), which are co-factors required for several essential cellular processes, such as respiration, regulation of gene expression and DNA-RNA metabolism. Some ISC proteins are involved in DNA metabolism, more precisely in DNA replication and/or repair processes. Recent works reported that defects in ISC metabolism compromise the stability of the cellular genome, and this instability is associated to human predisposition towards multiple types of cancers. Using the yeast grx5 mutant as a model we wanted to gain further insight in the relationship between genomic instability and defects in ISC biosynthesis.The absence of mitochondrial protein Grx5 leads to an increase in genetic instability. This genomic instability is not dependent on the iron accumulation produced in cells lacking Grx5. The cells that do not express Grx5 have higher levels of constitutive DNA damage, specifically associated with the formation of "focis" related with Rad52. Cells lacking Ssq1 and Grx5 are hypersensitive to DNA-damaging agents in an additively way. This sensitivity is independent of the constitutive oxidative stress state that occurs in the cells depleted of Grx5. The absence of proteins Ssq1 and Grx5 causes a delay in cell cycle progression through S phase. The DNA repair pathway homologous recombination could play an important role in the repair of DNA damage in cells Δgrx5 mutant.

La utilización de antimicrobianos, de forma metafiláxica, para mantener la salud de los animales en las granjas de producción, puede ser problemático en un futuro próximo, debido a las altas tasas de resistencias que se están observando. Esta situación obliga a replantearse medidas alternativas, las más habituales basadas en el uso de prebióticos, probióticos o la combinación de ambos (simbióticos). El objetivo principal de este trabajo ha sido el de seleccionar cepas de diferentes especies del género Bacteroides para ser utilizadas en conejos como probiótico. El género Bacteroides constituye uno de los principales componentes de la microbiota intestinal de los mamíferos (hasta 1011 UFC/g heces, en humanos). Degradan moléculas complejas, especialmente carbohidratos, y juegan un papel importante en el control de la colonización del tracto digestivo por parte de patógenos; también, en algún caso, pueden actuar como patógenos oportunistas. Están implicados además en la maduración del sistema inmunitario asociado a la mucosa intestinal. Los Bacteroides spp. podrían tener actividad probiótica por dos mecanismos diferentes: bien produciendo sustancias inhibidoras del crecimiento de otros componentes de la microbiota intestinal (bacteriocinas, metabolitos secundarios…), bien estimulando al sistema inmune, incrementando las defensas de forma inespecífica (inmuno-moduladores). Basándonos en la colección de Bacteroides spp. del CReSA, en este trabajo se han realizado estudios in vitro para seleccionar cepas, con ausencia de características negativas y presencia de características positivas, que pudieran utilizarse en estudios in vivo, en gazapos durante la fase de lactación, y poder analizar su rol como posible probiótico. La presencia de resistencias a determinados antibióticos, especialmente de marcadores transferibles, ha sido la característica más restrictiva a la hora de seleccionar las cepas a analizar in vivo. Después de seleccionar cuatro cepas, se procedió al estudio in vivo, en una granja comercial, examinando el efecto sobre la microbiota intestinal y diferentes parámetros inmunitarios. De los resultados obtenidos podemos inferir que algunas de las cepas probadas pueden ser candidatos para el desarrollo de un probiótico para conejo. / The metaphylactic use of antimicrobials to maintain the health of animals in food production farms can be problematic in the near future, due to the high rate of resistances observed. This situation forces to looking for alternative measures, the most common based on the use of prebiotics, probiotics or a combination of both (symbiotic). The main objective of this work was to select strains of different species of the Bacteroides genus that could be used as probiotic in rabbits. Bacteroides genus is one of the main components of the mammalian intestinal microbiota (1011 CFU/g feces, in humans). These bacteria degrade complex molecules, especially carbohydrates, and play an important role in the control of the colonization of the digestive tract by pathogens; but, in some cases, they can act as opportunistic pathogens. Furthermore, they are involved in the maturation of the immune system associated with intestinal mucosa. The Bacteroides spp. could have probiotic activity in two different ways: producing inhibitory substances against other components of intestinal microbiota (bacteriocins, secondary metabolites…) or stimulating the immune system, increasing the nonspecific defenses of host (immune-modulators). Using the collection of Bacteroides spp. of CReSA, in this work different in vitro studies were conducted to select strains, looking for the absence of negative characteristics and the presence of positive characteristics, to be used for the in vivo studies on rabbits during the lactation period and to analyze their role as probiotic. The presence of resistances against antimicrobials, especially when transferable markers were present, was the most restrictive characteristic for the selection of the strains that were analyzed in vivo. After the selection of four strains, the in vivo study on a commercial farm was conducted, examining the effect on the intestinal microbiota and on different immune parameters. By the analysis of the obtained results can be inferred that some of the tested strains may be candidates for the development of probiotics for rabbit.

Cerca del 80% de los aceites y las grasas producidas mundialmente son aceites vegetales y el resto de origen animal. Dicha cantidad de ácidos grasos sirve como fuente para la producción de una serie de compuestos nuevos: diácidos o epóxidos de cadena larga o ácidos grasos omega-hidroxilados. Pseudomonas aeruginosa 42A2 es un bacilo gramnegativo que produce ácidos grasos trans-hidroxilados (HFA) a partir del ácido oleico cuando es cultivado en un medio mineral. Dichos HFA, los ácidos 10(S)-hidroxi-8(E)-octadecenoico ((10S)-HOME) y 7,10(S,S)-dihidroxi-8(E)-octadecenoico ((7S,10S)-DiHOME), son producidos a través de un sistema de aireación no dispersivo que permite una mayor oxigenación y homogeneidad del medio de cultivo en los que son producidos. Tanto es así que se han conseguido unos valores de productividad para estos HFA de 0.29 y 0.31 g•L-1•h-1, respectivamente. Éstos han sido purificados a unos niveles superiores del 91% para poder ser polimerizados y obtener estólidos, poliésteres de trans-HFA. Por medio de una búsqueda exhaustiva, se decidió que Novozym 435, lipasa B de Candida antarctica, era la lipasa ideal para realizar dicha polimerización in-vitro. En una primera aproximación, se sintetizaron estólidos a partir de (10S)-HOME en medio orgánico, n-hexano. Se optimizó las condiciones de reacción y el mayor rendimiento obtenido fue del 30%. Esta nueva generación de estólidos trans ha requerido unas nuevas técnicas analíticas. Estos poliésteres han sido analizados a través de MALDI-TOF-MS utilizando una matriz de DHB neutralizada con LiOH, ya que, el ion 7Li+ ayuda a estabilizar dichos compuestos y por ende obtener espectros de masas menos fragmentados. Dicha técnica estructural ha resultado ser más rápida y barata que una LC-MS convencional. Dímeros del derivado monohidroxilado fueron sintetizados. En una segunda aproximación, se sintetizaron estólidos a partir de (10S)-HOME y (7S,10S)-DiHOME en medio libres de disolventes orgánicos usando Novozym 435. Rendimientos del 71 y del 94% de conversión, respectivamente, fueron obtenidos después de optimizar los medios de reacción. Estos estólidos fueron analizados por MALDI-TOF-MS con una matriz de DHB saturada en acetonitrilo para incrementar la sensibilidad de los oligómeros de mayor peso molecular. Mediante esta técnica se llevaron a detectar oligómeros de hasta 6 y 7 unidades monoméricas, respectivamente. Así mismo se usó la RMN para determinar la estructura de los compuestos analizados con gran éxito. Finalmente, se decidió sintetizar etil ésteres de los ácidos (10S)-HOME y (7S,10S)-DiHOME debido a las propiedades aromáticas. Estos ésteres se sintetizaron en medio orgánico, cloroformo, y en un medio libre de disolventes con unos rendimientos totales, en ambos casos. Dichos etil ésteres fueron analizados por MALDI-TOF-MS y RMN para determinar su masa molecular y estructura, respectivamente. Finalmente, se realizó un estudio de diversas propiedades físico-químicas de estos compuestos obtenidos. La viscosidad y diversos parámetros calorimétricos obtenidos a partir de curvas DSC y TGA fueron determinados para saber de la naturaleza de esta nueva generación de ésteres. / About 80% of the oil and fats produced worldwide are vegetable oils and the rest are from animal origin. This amount of fatty acids is used as a source for producing new compounds: long chain diacids or epoxides or omega-hydroxylated fatty acids. Pseudomonas aeruginosa 42A2 is a gramnegative bacillus which produces hydroxy-fatty acids (HFA) when is cultivated in a mineral médium using oleic acid as carbon source. These HFA, 10(S)-hydroxy-8(E)-octadecenoic acid ((10S)-HOME) and 7,10(S,S)-dihidroxi-8(E)-octadecenoic acid ((7S,10S)-DiHOME), are produced with a non-dispersive aeration system that enhanced oxygenation and homogeneity of the culture media. The following volumetric productivity for these HFA were achieved: 0.29 y 0.31 g•l(-1)•h(-1), respectively. These HFA were purified with levels higher than 91% of purity for being later polymerizated and obtaining estolides, polyesters of HFA. For that purpose Novozym 435, lipase B from Candida antarctica, was chosen among other lipases to performance this enzymatic reaction. First of all, (10S)-HOME estolides were synthesized in organic media, n-hexane. Reaction conditions were optimized, reaching a 30% reaction yield. This new family of trans-estolides required adapted analytical techniques. These polyesters were analyzed with MALDI-TOF-MS using a DHB matrix neutralized with LiOH. 7Li+ ion stabilizes such compounds and less fragmented mass spectra were observed. This technique was less time-consuming than LC-MS. Dimers of the monohydroxylated compound were produced. Secondly, estolides from (10S)-HOME y (7S,10S)-DiHOME were synthesized in a solvent-free media using Novozym 435. Reaction yields of 71 and 94% were reached, respectively, after optimizing reaction media. These compounds were analyzed by MALDI-TOF-MS using a DHB matrix saturated in acetonitrile for detecting higher mass oligomers. This technique could detect oligomers composed of 6 and 7 monomeric units, respectively. Moreover, NMR were also used to determine the structure of these polyesters. Thirdly, trans-HFA ethyl esters were synthesized due to their aromatic properties. Such esters were produced in organic media, chloroform, and in a solvent-free media, in both cases with a total conversion. trans-HFA ethyl esters were analyzed by MALDI-TOF-MS and NMR for determing their molecular mass and structure, respectively. Finally, a physicochemical study of these compounds, estolides and ethyl ester, was carried out. Viscosity and some calorimetric parameters from DSC and TGA curves were determined.

Los datos acerca de las leishmaniosis y sus vectores, los flebotomos, en las Islas Baleares son escasos y focalizados. La tasa global de casos humanos (LH) se sitúa entre los 0,7-3,5 casos anuales/100.000 habitantes y la prevalencia de la leishmaniosis canina (LCan) varía entre el 0 y el 45%, dependiendo de la isla y de la población analizada. Se han identificado cinco especies de flebotomos en las islas, pero no se dispone de un estudio extensivo de su distribución y densidad. El objetivo general de esta tesis es profundizar en el conocimiento de la epidemiología de la leishmaniosis en Mallorca y Menorca, que presentan un grado de endemicidad diferente, ausente de Menorca y con una prevalencia elevada en Mallorca. La metodología ha variado en función de los objetivos específicos planteados. Para el estudio de la infección natural por leishmania de los vectores se ha aplicado una PCR-anidada y para analizar la utilidad de dicha técnica en estudios epidemiológicos se ha observado, además, el estado de digestión sanguínea de las hembras de flebotomos. La identificación de la especie de Leishmania se llevó a cabo mediante RFLP. Para obtener datos de la LCan se ha realizado una encuesta a los veterinarios de las Islas Baleares y un estudio serológico prospectivo a perros de la isla de Menorca. El estudio de los vectores, Phlebotomus perniciosus, se ha llevado a cabo mediante capturas con trampas adhesivas durante el periodo estival. Resultados:. El 38,7% de las hembras analizadas presentaron una PCR-anidada positiva para leishmania, variando entre el 0% y el 78% de acuerdo al grado de LH y y LCan en el área. Se observó un incremento significativo del riesgo de positividad en la PCR-anidada al incrementar el grado de digestión sanguínea (OR = 1,3; p = 0,025). El genotipado permitió identificar a L. infantum en todos los casos. El análisis retrospectivo de la LCan en las Islas Baleares permitió observar que el 50% de los veterinarios opinaba que la incidencia de la LCan no había sufrido cambios. Sin embargo, el 50% de los veterinarios de Menorca consideraban que la LCan había incrementado y el 100% consideraba que los nuevos casos diagnosticados eran autóctonos. El estudio serológico transversal, mostró una tasa de seroprevalencia del 24% en la isla, siendo del 31% en los perros locales sin antecedentes de desplazamientos a zonas endémicas. El estudio entomológico permitió detectar la presencia de Phlebotomus perniciosus, uno de los vectores de L. infantum en la región mediterránea. En Menorca se capturó entre 31–161 m, con una frecuencia del 56,8%, y en Mallorca entre 6-772 m, con una frecuencia de 69,4%. La densidad en Menorca disminuyó significativamente con respecto a un estudio anterior. El análisis estadístico en ambas islas permitió observar que P. perniciosus se localiza preferentemente alejada de los núcleos urbanos y que su presencia está además influenciada por la flora adyacente y el tipo de muro donde se colocan las trampas. Conclusiones: La PCR-anidada, en combinación con el análisis de la digestión sanguínea, se muestra útil para estudios epidemiológicos de las leishmaniosis. En Menorca se ha detectado un foco autóctono de LCan, cuya emergencia no parece estar relacionada con un aumento en la densidad de P. perniciosus, sino con la introducción continua de perros infectados con leishmaniosis. En ambas islas el vector se encuentra ampliamente distribuido, con el consecuente riesgo de transmisión de la leishmaniosis. En Mallorca hay una mayor probabilidad de encontrarlo a altitudes entre 51-150 m, en presencia de garriga, en los límites de poblaciones y entre éstas y en la proximidad de granjas de ovejas. / Data on leishmaniosis and its vectors (sandflies) in the Balearic Islands are scarce and focused. The overall rate of human leishmaniosis (HL) is 0.7-3.5 cases per year/100,000 inhabitants, and the prevalence of canine leishmaniosis (CanL) varies between 0 and 45%, depending on the island and the population tested. Five species of sandflies have been identified in the islands, but their distribution and density have not been extensively studied to date. Objective: To obtain a greater understanding of the epidemiology of leishmaniosis in Majorca and Minorca, which show different degrees of endemicity. Results: In the application of a nested-PCR (n-PCR) to determine leishmania parasitism, 38.7% of analysed female sandflies tested positive, ranging from 0% to 78% according to the presence of CanL and HL. The probability of a positive n-PCR increased significantly with the degree of blood digestion (P=0.025 OR=1.3). Genotyping (RFLP) allowed Leishmania infantum identification in all cases. In response to a questionnaire on CanL trends, 50% of participating Balearic Island veterinarians thought its incidence had not changed overtime. However, in Minorca 50% of veterinarians considered CanL to be increasing, while 100% thought that the newly diagnosed cases were autochthonous. A cross-sectional serological study in Minorca showed an overall seroprevalence rate of 24%, or 31% in local dogs with no history of having travelled to endemic areas. The entomological study employing sticky traps in Minorca and Mallorca confirmed the presence of Phlebotomus perniciosus, vector of L. infantum. In Minorca, it was captured with a frequency of 56.8% at 31-161 m.a.s.l. and in Majorca of 69.4% at 6-772 m.a.s.l. The density in Minorca was significantly lower compared to a previous study. The statistical analysis of both islands showed that P. perniciosus is mainly located far from urban settlements, and its presence is also influenced by the type of adjacent flora and wall construction. Conclusions: n-PCR coupled with blood digestion analysis is a useful technique for epidemiological studies of leishmaniosis. The emergence and establishment of an autochthonous focus of CanL in Minorca is apparently related with the continuous introduction of leishmaniosis-infected dogs rather than an increase in P. perniciosus density. The vector was found throughout both islands, with the consequent risk of leishmaniosis transmission. In Majorca, P. perniciosus is most likely found at altitudes of 51-150 m.s.a.l., in garrigue vegetation, between and at the edge of settlements, and in the proximity of sheep farms.

Tesi realitzada als Centres Científics i Tecnologògics (CCIT-UB) / La Microscopía Electrónica de Transmisión (TEM) combinada con la Tomografía Electrónica (ET) ha proporcionado una visión más precisa de la complejidad de la estructura de las células procariotas. A su vez, la crioinmovilización de muestras por enfriamiento rápido permite la observación de muestras biológicas en un estado cercano al natural, mejorando la caracterización de estructuras bacterianas conocidas y permitiendo el descubrimiento de nuevas. La crioinmovilización por alta presión (HPF) seguida de criosustitución (FS) e inclusión en resina de la bacteria Antártica Pseudomonas deceptionensis M1T permitió observar una estructura nueva que no se correspondía con ningún tipo de inclusión o estructura descrita previamente como componente del citoplasma bacteriano. Ésta, se observaba frecuentemente al cultivar la bacteria en condiciones de crecimiento lento a bajas temperaturas (medio TSA, 0ºC, 12 días). La aplicación de la ET a temperatura ambiente (RT-ET) demostró que la nueva estructura estaba constituida por un número variable de discos ovalados, planos, apilados, de tamaño variable, grosor constante, rodeados aparentemente por una membrana y próximos a la membrana plasmática (PM) bacteriana. Debido a esta apariencia de discos apilados, esta nueva estructura se denominó “Stack”. Las células que los presentaban, podían contener uno o varios simultáneamente, en cuyo caso se observaban aislados o agrupados en una misma localización, difiriendo en sus orientaciones. La visualización de los “Stacks” mediante diferentes técnicas de (Cryo-)TEM: Tokuyasu, criofractura, secciones vítreas y bacteria entera crioinmovilizada por Plunge freezing (PF), corroboró su existencia y descartó un origen artefactual. La Criotomografía electrónica (CET) de bacterias completas crioinmovilizadas por PF permitió el estudio de la distribución espacial de los “Stacks” en el contexto celular, confirmando su estructura tridimensional formada por discos ovalados planos, su presencia aislada o agrupada, y su ubicación periférica en el citoplasma bacteriano, coincidiendo con los resultados obtenidos por RT-ET. No se observó continuidad entre la membrana que rodeaba las subunidades de los “Stacks” y la PM, por lo que no parecen ser invaginaciones de la misma. Asimismo, la CET de secciones vítreas (CETOVIS) demostró que la membrana que rodeaba los discos del “Stack” presentaba el perfil de bicapa lipídica. El estudio comparativo del grosor de la membrana de estas subunidades y del de la PM, tanto en bacteria completa como en secciones vítreas, mostró diferencias significativas, apuntando a una composición diferente entre ambas. Los “Stacks” se detectaron en otras especies del género Pseudomonas cultivadas en condiciones de crecimiento lento a bajas temperaturas. En todos los casos estudiados, los “Stacks” se encontraron muy próximos a microfibras de DNA, apareciendo parcial o totalmente envueltos por el nucleoide bacteriano. El estudio de la correlación entre el número de “Stacks” y del número de bacterias en fase de septación, cuantificado en secciones de resina de P. deceptionensis M1T cultivadas en TSA a 0ºC a diferentes tiempos, apuntó también a una posible relación entre la presencia de “Stacks” y alguna fase de la dinámica del cromosoma bacteriano. / In recent years, improvements in transmission electron microscopy (TEM) and tomography have provided a more accurate view of the complexity of the structure of prokaryotic cells. This fact has allowed the study of biological samples in a close-to-native state, enabling us to refine our knowledge of already known bacterial structures and to discover new ones. Application of these techniques to the new Antarctic cold-adapted bacterium Pseudomonas deceptionensis M1T has demonstrated the existence of a previously undescribed cytoplasmic structure that does not correspond to known bacterial structures and which we called “Stack”. This structure was mainly visualized in slow growing cultures of P. deceptionensis M1T and can be described as a set of stacked discs surrounded by a membrane-like structure, located close to the cell membrane, but not continuous with it, and found in variable number. Stacks were mostly observed very close to DNA fibers. Stacks are not exclusive to P. deceptionensis M1T and were also visualized in slow-growing cultures of other bacteria. Cryo-electron microscopy (Cryo-EM) and CET of frozen-hydrated P. deceptionensis M1T cells confirmed that stacks were found at different locations within the cell cytoplasm, in variable number, separately or grouped together, very close to the plasma membrane (PM), and thus establishing that they were not artifacts of the previous sample preparation methods. CET of plunge-frozen whole bacteria and vitreous sections verified that each stack consisted of a pile of oval disc-like subunits, each disc being surrounded by a lipid bilayer membrane. Stacks did not appear to be invaginations of the PM because no continuity between both membranes was visible when whole bacteria were analyzed. We are still far from deciphering the function of these new structures, but a first experimental attempt links the stacks with a given phase of the cell replication process.

Una pila microbiana de combustible es un sistema bioelectroquímico en el cual las bacterias oxidan materia orgánica y transfieren los electrones a un electrodo produciendo electricidad. La eficiencia de este sistema depende de la actividad metabólica de los microorganismos creciendo en el ánodo, pero también de un gran número de factores relacionados con el diseño y la operación del sistema. El objetivo de esta tesis es contribuir al análisis y control de algunos de estos factores, así como ayudar a determinar el papel de los diferentes mecanismos de transferencia de electrones en el funcionamiento de estos dispositivos. En primer lugar, este trabajo analiza factores relacionados con el diseño que afectan al rendimiento de una pila microbiana. Así, se centra en el efecto de diferentes catalizadores abióticos así como en la relación entre las áreas del cátodo y ánodo necesarias para no afectar la potencia obtenida. Los resultados revelan que catalizadores solubles permiten potencias mucho mayores, y por tanto necesitan menor relación entre las áreas de cátodo y ánodo que en el caso de las pilas con cátodos de platino. No obstante, a largo plazo, las pilas con catalizadores solubles de hierro muestran un descenso progresivo del rendimiento de la celda de combustible que las hace poco adecuadas para aplicaciones que requieren operaciones de larga duración. Recientemente, la búsqueda de catalizadores adecuados para el cátodo ha llevado a los investigadores a explorar el posible uso de biocátodos. En esta tesis se demuestra la capacidad de Shewanella oneidensis MR-1 para catalizar la reacción del cátodo tanto en condiciones aeróbicas como anaeróbicas, siendo capaz de aceptar la corriente proporcionada por las bacterias presentes en el ánodo. El potencial de las bacterias que se encuentran en el ánodo para la producción de corriente no sólo depende de los niveles de actividad microbiana y de la supresión de las limitaciones producidas por el cátodo, sino que es afectada también por factores relacionados con el funcionamiento del sistema. Nosotros mostramos la importancia de una operación ininterrumpida como otro factor relevante para determinadas aplicaciones. Periodos de interrupción del circuito producen una alteración en los valores de corriente en forma de picos, que aparecen cuando el circuito es cerrado tras un periodo de interrupción y que caen lentamente hasta alcanzar valores normales de corriente. Mediante análisis más exhaustivos de este fenómeno se demuestra la capacidad de Shewanella oneidensis MR-1 para almacenar carga eléctrica en ausencia de aceptores de electrones. Finalmente, se estudió la contribución en la producción de corriente de los diferentes mecanismos de transferencia de electrones en pilas con comunidades microbianas complejas. La pila con el ánodo descubierto muestra que los mecanismos de transferencia directa son responsables de la mayor parte de la corriente generada. La comunidad microbiana formada se encuentra relacionada con la vía de transferencia de electrones disponible con especies microbianas como Shewanella, Aeromonas, Pseudomonas o Propionibacterium. Los mecanismos de transferencia mediante mediadores le siguen en importancia, siendo los responsables del 40% de la corriente producida. Esta pila cuya corriente depende de la producción de mediadores muestra una gran cantidad de especies redox en el anolito, algunas de ellas no relacionadas con mediadores ya descritos. Por último, en la pila con el electrodo cubierto de nafion, la única especie química capaz de llegar a la superficie del ánodo es el hidrógeno. En este caso, la producción de corriente es sostenida gracias a la relación entre algunos organismos como Comamonas, Alicycliphilus, Diaphorobacter o la archaea Methanosaeta y el ánodo. La oxidación de acetato mediante estos microorganismos resulta en la producción de hidrógeno, el cual es oxidado en la superficie del ánodo tras cruzar el nafion. / A Microbial Fuel Cell (MFC) is a bioelectrochemical system, in which bacteria oxidize organic matter and transfer the electrons through their electron transport chains onto an electrode surface producing electricity. The efficiency of the system depends on the metabolic activity of the microorganisms growing at the anode but also on a large number of factors related to the design and operation of the MFC. The purpose of this work is to contribute to the analysis and control of some of these factors as well as to throw some light on the role of different electron transfer mechanisms in MFC operation. To achieve this goal different experiments using the electrogenic bacterium Shewanella oneidensis MR-1 have been carried out. First of all, this works analyses the role of several design factors in MFC performance. This part of the research focuses on the effect of different abiotic catalysts as well as the cathode to anode ratio required for unhindered power output. The results indicate that soluble catalysts such as ferricyanide allow much higher power values, and therefore need smaller cathode/anode ratios than platinum-based cathodes. In the long term, however, MFCs containing soluble iron catalysts show a progressive degradation of fuel cell performance make them unfit for applications requiring extended operations. In recent years, the search for a suitable catalyst at the cathode has led researchers to explore the possible use of biocathodes. In this work, we demonstrate the capacity of Shewanella oneidensis MR-1 to catalyse the cathode reaction both under aerobic and anaerobic conditions, being able to sustain the current provided by bacteria present in the anode. The potential of anode bacteria for current production does not only depend on the levels of microbial activity and on the removal of cathodic limitations but seems to be also affected by factors related to the operation of the system. We have shown the importance of continuous MFC operation as another important factor to take into account for some applications. Periods of circuit interruption produce an alteration of the normal current output in the form of defined current peaks that appear when closing the circuit after a short period of current interruption and that decay slowly back to the original stable values. In depth analysis of this response demonstrates the capacity of Shewanella oneidensis MR-1 to store charge when no electron acceptors are present. Finally, we intended to determine the contribution of the different electron transfer mechanisms to current production in MFCs harbouring complex microbial communities. The MFC with a naked anode shows that direct electron transfer mechanisms are responsible for most of the current generated. The microbial community formed agrees with the electron transfer pathways available. So, this MFC presents species able of direct and mediated electron transfer as Shewanella, Aeromonas, Pseudomonas or Propionibacterium. The MFC sustained by shuttle-dependent electron transfer follows in importance being responsible for as much as 40% of current output. This reactor shows a great quantity of different redox species in the anolyte bulk, some of them not related to mediators currently described in the literature. Finally, in the MFC with a nafion-coated anode, the only chemical species able to diffuse to the anode surface is hydrogen. In this case, current production is sustained by the interaction between some organisms, such as Comamonas, Alicycliphilus, Diaphorobacter or the archaea Methanosaeta and the anode. Oxidation of acetate by these microorganisms results in hydrogen production that is therefore oxidised at the anode surface after crossing the nafion barrier. Current production by this mechanism would account for not more than 5% of the total current evolved in an unrestricted MFC.

Grx6 i Grx7 són dues glutaredoxines (GRXs) de la via secretora responsables de la reducció dels ponts disulfur mixtes entre el glutatió i les proteïnes. D’una banda, el mutant Δgrx6 mostra una inducció constitutiva de la via Crz1-calcineurina. L’absència de Grx6 afecta l’homeòstasi del Ca2+, provocant un increment dels nivells de Ca2+ citosòlic, que es reflecteix en alteracions en la sensibilitat del mutant als quelants de Ca2+ i a altes concentracions de Ca2+ extracel·lular. Donada l’estreta relació entre l’homeòstasi de diversos ions a la cèl·lula, el mutant Δgrx6 també acumula un excés de fosfat, potassi i sodi. D’altra banda, es mostra una relació entre l’estrès de RE i ambdues GRXs, ja que en condicions d’estrès de RE, tant la falta de GRX6 com de GRX7 provoquen canvis en la inducció de la resposta degut a les proteïnes mal plegades. Aquestes GRXs estan relacionades funcionalment amb la maquinària de plegament proteic, ja que l’absència de GRX6 o GRX7 contraresta els defectes de creixement d’un mutant amb baixos nivells d’Ero1, de manera similar al que succeeix en presència de l’oxidant diamida, probablement creant unes condicions oxidants al RE que compensen l’absència d’Ero1. Similarment, els anàlisis per pols i caça mostren que l’absència de GRX6 o GRX7 contraresta els defectes de secreció de la proteïna carboxipeptidasa Y (CPY) d’un mutant amb baixos nivells d’Ero1. Finalment, es demostra que l’acumulació de Ca2+ en el mutant Δgrx6 es produeix independentment de l’afectació en la secreció de CPY. / Grx6 i Grx7 son dos glutaredoxinas (GRXs) de la vía secretora responsables de la reducción de los puentes disulfuro mixtos entre el glutatión y las proteínas. Por una parte, el mutante Δgrx6 muestra una inducción constitutiva de la vía Crz1-calcineurina. La ausencia de Grx6 afecta la homeostasis del Ca2+, provocando un incremento de los niveles de Ca2+ citoplasmático, que se refleja en alteraciones en la sensibilidad del mutante a los quelantes de Ca2+ i a elevadas concentraciones de Ca2+ extracelular. Debido a la estrecha relación entre la homeostasis de varios iones en la célula, el mutante Δgrx6 también acumula un exceso de fosfato, potasio y sodio. Por otra parte, se muestra una relación entre el estrés de RE y esas GRXs, ya que en condiciones de estrés de RE, tanto la falta de GRX6 como de GRX7 provocan cambios en la inducción de la respuesta debido a las proteínas mal plegadas. Estas GRXs están relacionadas funcionalment con la maquinaria de plegamiento proteico, ya que la ausencia de GRX6 o GRX7 contrarresta los defectos de crecimiento de un mutante con bajos niveles de Ero1, de manera similar a lo que sucede en presencia del oxidante diamida, probablemente creando unas condiciones en el RE que compensan la ausencia de Ero1. Similarmente, los análisis por pulso y caza muestran que la ausencia de GRX6 o GRX7 contrarresta los defectos de secreción de la proteína carboxipeptidasa Y (CPY) en un mutante con bajos niveles de Ero1. Finalmente, se demuestra que la acumulación de Ca2+ en el mutante Δgrx6 se produce independientemente de la afectación en la secreción de CPY. / Grx6 and Grx7 are two glutaredoxins (GRXs) of the secretory pathway responsible for the reduction of mixed disulphide bridges between glutathione and proteins. On the one hand, the Δgrx6 mutant shows a constitutive induction of the Crz1-calcineurin pathway. The absence of Grx6 affects Ca2+ homeostasis, causing an increase in cytosolic Ca2+ levels, which is reflected in changes in the sensitivity of the Δgrx6 mutant to Ca2+ chelators and to elevated Ca2+ concentrations. Given the close relationship between homeostasis of various ions in the cell, the Δgrx6 mutant also accumulates an excess of phosphate, potassium and sodium. On the other hand, it shows a link between ER stress and Grx6/Grx7, since under ER stress conditions, both the absence of GRX6 or GRX7 leads to changes in the unfolded protein response induction. These GRXs are functionally related with the protein folding machinery, since the absence of GRX6 or GRX7 counteracts the growth defects of a mutant with ERO1-downregulated expression, similar to what happens in the presence of the oxidant diamide, probably creating oxidizing conditions that compensate for the absence of Ero1. Similarly, pulse and chase analyses show that the absence of GRX6 or GRX7 counteracts carboxypeptidase Y (CPY) secretion defects of a mutant with ERO1-downregulated expression. Finally, it is shown that the accumulation of Ca2+ in the Δgrx6 mutant occurs independently of the effect on CPY secretion.

Haemophilus parasuis es una bacteria Gram negativa común en el tracto respiratorio superior de cerdos sanos y es el agente etiológico de la enfermedad de Glässer, que se caracteriza por poliserositis fibrinosa y poliartritis. En los últimos años, la prevalencia de las infecciones respiratorias, incluyendo la producida por H. parasuis, ha aumentado debido a prácticas de manejo de los animales, como el destete precoz, y a la aparición de virus inmunosupresores. Poco se sabe acerca de la patogénesis y los factores de virulencia de H. parasuis y esto complica el control de la enfermedad. Las fosfatasas ácidas son ubicuas en organismos eucariotas y procariotas y han recibido mucha atención con la finalidad de entender sus estructuras, funciones y mecanismos catalíticos. En bacterias Gram negativas estos enzimas tienen un papel esencial en numerosos procesos, incluyendo la patogénesis bacteriana. Resultados previos de nuestro grupo demostraron la presencia de fosfatasa ácida secretada en sobrenadantes de ciertas cepas de H. parasuis. De especial interés fue la observación de que la secreción de la fosfatasa se perdía tras pases de la bacteria en el laboratorio, indicando un papel de este enzima en la infección. Por lo tanto el objetivo principal de esta tesis fue identificar y caracterizar los genes responsables de esta actividad fosfatasa. El análisis de una genoteca de la cepa virulenta H. parasuis ER-6P permitió la identificación de 2 clones con actividad fosfatasa. Estos clones contenían los genes aphA y pgpB, respectivamente. El clonaje y análisis posterior de estos genes confirmó que codificaban dos fosfatasas. Específicamente, AphA muestra características típicas de fosfatasas ácidas bacterianas de clase B, incluyendo el dominio catalítico típico (motivo F-D-I-D-D-TV-L-F-S-S-P, localizado en el N-terminal y el motivo Y-G-D-[AS]-D-X-D-[IV] localizado cerca del C-terminal), un peso molecular teo rico de 24,33 KDa e inhibicio n por EDTA. Las fosfatasas ácidas bacterianas de clase B son un grupo de enzimas que forman homotetra meros y esta n presentes en una minorí a de bacterias, que incluye pato genos importantes. Por otro lado, PgpB es una fosfatasa de fosfatidilglicerofosfato, con seis dominios transmembrana, que pueden explicar su localización celular en la bacteria. Ambas proteínas, AphA y PgpB, mostraron un pH óptimo distinto que la actividad fosfatasa secretada por H. parasuis al sobrenadante. En un intento de purificar la fosfatasa secretada, sobrenadantes de H. parasuis fueron fraccionado por cromatografía de flujo por tamaño y las fracciones con actividad fosfatasa fueron analizadas por SDS-PAGE y MALDI-TOF-TOF. La proteína hipotética HPS_05483 se identificó en las fracciones con actividad fosfatasa, pero su expresión nativa recombinante no fue posible. Sin embargo, sí pudo ser purificada con una cola de His y se detectaron anticuerpos frente a ella en cerdos infectados, indicando que ésta proteína se expresa durante la infección. Se produjeron anticuerpos monoclonales (Acm) frente a un sobrenadante de H. parasuis con actividad fosfatasa y una selección inicial detectó Acm frente a Apha. Sin embargo, se debe realizar una selección más exhaustiva de los hibridomas para identificar Acm específicos frente a la fosfatasa del sobrenadante de H. parasuis. Finalmente, se estudió el efecto de sobrenadantes con actividad fosfatasa sobre los macrófagos. La expresión de marcadores de superficie de macrófagos alveolares CD163, SLAI, SLAII, sialoadhesina y SWC3 no se vio afectada por incubación con sobrenadantes de H. parasuis o sobrenadante de un clon que secretaba AphA. En conclusión, hemos identificado y caracterizado parcialmente dos fosfatasas de H. parasuis, AphA y PgpB. Sin embargo, más estudios son necesarios para determinar si la proteína hipotética HPS_05483 es realmente una fosfatasa. El papel de estos enzimas en la biología de H. parasuis debería ser estudiado en más profundidad. / The Gram-negative bacterium Haemophilus parasuis is common in the upper respiratory tract of healthy swine and is the etiological agent of Glässer´s disease, which is characterized by fibrinous polyserositis and polyarthritis. In the last few years the prevalence of respiratory infections, including those by H. parasuis, has increased due to management practices, as early weaning, and the emergence of immunosuppressive viruses. Little is known about the pathogenesis and virulence factors of H. parasuis and this complicates the control of the disease. Acid phosphatases are ubiquitous in eukaryotic and prokaryotic organisms and much attention has been given to these enzymes in order to understand their structures, functions, and catalytic mechanisms. In many Gram-negative bacteria these enzymes have been determined to play a critical role in numerous processes, including pathogenesis. Previous results by our group showed the presence of a secreted acid phosphatase in the culture supernatant of some strains of H. parasuis. Interestingly, the secretion of the phosphatase activity was lost after passages of the bacteria in the laboratory, indicating a role of this enzyme in the infection. Therefore the main objective of this thesis was to identify and characterize the genes responsible for this secreted phosphatase activity. Screening of a genomic library from the virulent strain ER-6P of H. parasuis identified 2 clones with phosphatase activity. These clones contained genes aphA and pgpB, respectively. The subsequent cloning and analysis of the genes demonstrated that their products were in fact phosphatases. Specifically, AphA presented characteristics of bacterial class B acid phosphatases, including the typical catalytic domain (motif F-D-I-D-D-TV-L-F-S-S-P, located in the N-terminal moiety, and Y-G-D-[AS]-D-X-D-[IV] located near the C-terminus), a predicted molecular weight of 24.33 KDa and inhibition by EDTA. Bacterial class B acid phosphatases are a group of homotetrameric enzymes, which are present in a minority of bacteria, most of which are important pathogens. PgpB is a phosphatidylglycerophosphate phosphatase, with six transmembrane domains in the predicted protein, which would explain its location in the bacterial cell. Both proteins, AphA and PgpB, showed a different optimal pH than the activity secreted by H. parasuis into the supernatant. In an attempt to purify the phosphatase from the H. parasuis supernatant, a size exclusion chromatography was performed and fractions with phosphatase activity were analyzed by SDS-PAGE and MALDI-TOF-TOF. A hypothetical protein HPS_05483 was identified in the fractions with phosphatase activity, but cloning and native expression of the gene was not achieved. However, the protein HPS_05483 was purified as a His-tagged protein and antibodies in infected pigs were detected against it, indicating that this protein is expressed during infection. Monoclonal antibodies (mAb) were produced against a phosphatase-positive supernatant from H. parasuis and an initial screening of the mAb identified several hybridomas with reaction against AphA. Further screenings are needed to identify mAb against the secreted phosphatase found in the supernatant of H. parasuis. Finally, the effect of the phosphatase-positive supernatant on porcine alveolar macrophages was studied. The level of macrophage surface markers CD163, SLAI, SLAII, sialoadhesin and SWC3 was not affected by incubation with supernatants from H. parasuis or supernatant from a clone secreting AphA. In conclusion, we have identified and partially characterize 2 phosphatases of H. parasuis, AphA and PgpB. More studies are needed to determine if the hypothetical protein HPS_05483 is in fact a phosphatase. The role of these enzymatic activities in the biology of H. parasuis needs to be further studied.

La prevención de la contaminación bacteriana desde las superficies en los ambientes de elaboración de alimentos, industrias de este sector y ambientes domésticos, requiere de productos desinfectantes que sean efectivos frente a distintas especies microbianas, que sean seguros durante su empleo y que tengan acción bactericida residual para proteger a las superficies de la adhesión bacteriana. Asimismo, el empleo de superficies con propiedades antibacterianas que inhiban la formación de biofilms es una medida para evitar la propagación de bacterias patógenas o alterantes de la calidad de los alimentos. Los objetivos del presente trabajo fueron: evaluar la eficacia y el efecto residual de productos desinfectantes, evaluar superficies con propiedades bacteriostáticas y estudiar la formación de biofilms de Flavobacterium psychrophilum en el sector de la acuicultura. De los resultados obtenidos, la acción bactericida del peróxido de hidrógeno frente a Staphylococcus aureus y Enterococcus hirae sobre superficies de acero inoxidable se incrementó al emplearlo conjuntamente con cloruro de benzalconio y polímeros catiónicos. Pseudomonas aeruginosa es más sensible en comparación de Staphylococcus aureus a la actividad bactericida de productos basados en peróxido de hidrógeno. Los productos basados en el cloruro de benzalconio presentaron efecto residual bactericida transcurridas 24 horas en las superficies tratadas. El hipoclorito de sodio presenta efecto residual al combinarse con otros compuestos como el hidróxido de sodio y el alcohol graso etoxilado. Escherichia coli es más sensible que Staphylococcus aureus y Klebsiella pneumoniae a la acción antibacteriana del triclosán en superficies de plástico. Las superficies con propiedades bacteriostáticas presentaron mayor grado de actividad en condiciones secas de ensayo en comparación de las condiciones húmedas, encontrándose una relación entre la concentración del compuesto bacteriostático y la inhibición bacteriana. En condiciones de acuicultura, se observó una mayor actividad bactericida de los desinfectantes sobre las superficies para el peroximonosulfato de sodio al 1,0%, hipoclorito de sodio al 5,25%, y la combinación de compuestos formados por tensoactivos y ácido láctico. Flavobacterium psychrophilum tiene la capacidad para formar biofilms en superficies de acero inoxidable, superficies plásticas, vidrio y madera. En estas condiciones, la adhesión bacteriana puede inhibirse empleando superficies plásticas con propiedades antibacterianas. / In prevention of the bacterial contamination from surfaces in the food processing environments, industries in this sector and domestic environments requires disinfectant products that have to be effective against different bacterial species, safe during their use and have bacterial residual action to protect surfaces of the bacterial adhesion. In the same way, the use of surfaces with antibacterial properties which inhibit the biofilm formation is a measure to prevent the spread of pathogenic bacteria and the spoilage of the food quality. The objectives of this study were to evaluate the efficacy and the residual effect of disinfectants products, evaluate the bacteriostatic properties of surfaces and study the biofilm formation produced by Flavobacterium psychrophilum in the aquaculture sector. From the results, the bactericidal action of hydrogen peroxide in Staphylococcus aureus and Enterococcus hirae on stainless steel surfaces is increased when it is used together with benzalkonium chloride and cationic polymers. Pseudomonas aeruginosa is more sensitive than Staphylococcus aureus to the bactericidal activity of products based on hydrogen peroxide. Benzalkonium chloride products showed bactericidal residual effect after 24 hours on the treated surfaces. Sodium hypochlorite has residual effect when it is combined with other compounds such as sodium hydroxide and ethoxylated fatty alcohol. Escherichia coli is more sensitive than Staphylococcus aureus and Klebsiella pneumoniae to the antibacterial action of triclosan on plastic surfaces. Surfaces with bacteriostatic properties showed greater activity in dry conditions compared to wet conditions, which demonstrated a relationship between the bacteriostatic compound concentration on the surfaces employed and the bacterial inhibition. In the aquaculture conditions, the bactericidal activity on surfaces was higher for potassium peroxymonosulfate 1,0%, sodium hypochlorite 5,25%, and the combination of compounds of surfactants and lactic acid. The biofilm formation of Flavobacterium psychrophilum appeared on stainless steel surfaces, plastic surfaces, glass and wood. Under these conditions, the bacterial adhesion can be inhibited using plastic surfaces with antibacterial properties.

L’objectiu inicial de la present tesi és la miniaturització d’un sistema per a la mesura ràpida de la DBO en mostres d’aigua. Per això, s’incorporaran cultius microbians a dispositius microfluídics que permeten la realització de mesures electroquímiques. Aquest camp, que ha experimentat un ràpid creixement en els darrers anys, es basa la utilització d’elements biològics —com són espècies o comunitats microbiològiques, proteïnes o enzims— com a element sensor o com a reactor de mesures electroquímiques. Aquestes aproximacions haurien de ser vàlides i suficientment ràpides per ser utilitzades com a element de control en àmbits com el seguiment ambiental o processats industrials diversos. Això és rellevant, ja que els mètodes analítics emprats més habitualment requereixen de diversos dies per obtenir els resultats, fet que els fa inadequats per fer el seguiment de processos. A més a més, es planteja enfocar aquests desenvolupaments donant un paper clau a les eines de simulació i modelització matemàtica, de tal forma que es pugui validar el dispositiu dissenyat, en el major grau possible, abans d’entrar en les fases de fabricació i test experimental. Si bé les eines de simulació matemàtica ja són àmpliament utilitzades, en la major part dels casos s’utilitzen com a validació de dispositius que ja han estat fabricats i testats. Plantejar les simulacions matemàtiques com una eina combinada en la fase del disseny, implica que aquestes simulacions hauran d’abastar el conjunt d’elements rellevants per al problema o dispositiu, però a la vegada hauran de permetre contrastar els resultats i adaptar el disseny abans de les fases de més requeriments en recursos i temps, que són la fabricació de prototips i la seva validació experimental. Pel que fa a la fabricació del dispositiu, es maximitzarà l’ús de tecnologies ràpides i de baix cost, tant per al desenvolupament dels diferents prototips, com per ser una constricció remarcable de cara a la seva fabricació i introducció a gran escala. Finalment, també es tindrà l’objectiu que els dispositius construïts siguin el més versàtils possible, tant de cara a adaptar-los a altres usos i processos analítics com en termes de facilitar-ne la integració en altres dispositius, en la línia del que es coneix com a sistemes de lab-on-a-chip. / El objetivo inicial de esta tesis es la miniaturización de un sistema de medida rápida de la DBO en muestras de agua. Para eso, se incorporan cultivos microbianos a dispositivos microfluídicos que permitan la realización de medidas electroquímicas. Este campo, que ha experimentado un rápido crecimiento en los últimos años, se basa en la utilización de elementos biológicos –como son especies o comunidades microbiológicas, proteínas o enzimas– como elemento sensor o como reactor de medidas electroquímicas. Estas medidas deben ser válidas y suficientemente rápidas para ser utilizadas como elemento de control en ámbitos como el seguimiento ambiental o procesados industriales diversos. Esto es relevante, ya que los métodos analíticos utilizados más habitualmente requieren de varios días para obtener resultados, lo que los hace inadecuados para realizar el seguimiento de procesos. Además, se plantea enfocar estos desarrollos dando un papel clave a las herramientas de simulación y modelización matemática, de tal forma que se pueda validar el dispositivo diseñado, en el mayor grado posible, antes de entrar en la fase de fabricación y test experimental. Si bien las herramientas de simulación matemática ya son ampliamente utilizadas, en la mayor parte de los casos se utilizan como una validación de dispositivos que ya han sido fabricados y testados. Plantear las simulaciones matemáticas cómo una herramienta combinada en la fase de diseño, implica que estas simulaciones deben abarcar el conjunto de elementos relevantes para el problema o dispositivo, pero a su vez deberán permitir contrastar los resultados y adaptar el diseño antes de las fases de más requerimiento de recursos, que son la fabricación de prototipos y su validación experimental. En lo referente a la fabricación del dispositivo, se maximizará el uso de tecnologías rápidas y de bajo coste, tanto para el desarrollo de los diferentes prototipos, como por ser una constricción remarcables de cara a su fabricación e introducción a gran escala. Finalmente, también se ha tenido el objetivo que los dispositivos construidos sean lo más versátiles posible, tanto en el sentido de adaptarlos a otros usos y procesos analíticos como en términos de facilitar su integración en otros dispositivos, en la línea de lo que se conoce como sistemas de lab-on-a-chip. / The initial objective of this thesis is the miniaturization of a system for rapid measurement of the BOD (Biological Oxygen Demand) in water samples. So, microbial cultures are incorporated into microfluidic devices that enable electrochemical measurements. This field, which experienced a fast growth in recent years, is based on the use of biological elements –such as microbial species or communities, proteins or enzymes– as sensor element or reactor for electrochemical measures. These measures should be valid and fast enough to be used as a control parameter in areas such as environmental monitoring and various industrial processing. This is relevant because the analytical methods used most commonly require several days to get results, which makes them unsuitable for process monitoring. In addition, we propose to approach these developments giving a key role to simulation tools and mathematical modelling, so you can validate the device designed, to the greatest possible extent before entering the production and experimental test phases. While mathematical simulation tools are already widely used, in most cases they are used as a validation tool for devices that have already been manufactured and tested. Raise mathematical simulations how a combination tool in the design phase, implies that these simulations should cover all relevant elements for the problem or device, but in turn should allow contrast results to adapt the design before the more resource requiring phases, which are prototyping and experimental validation. With regard to device fabrication, the use of fast and low cost technology, for the development of the various prototypes, and as being a remarkable constriction towards their manufacture and large-scale introduction, will be maximized. Finally, it has also been a target for constructed devices to be as versatile as possible, both in the sense of adapting to other uses and analytical processes, and in terms of having an easy integration into other devices, in line with what is known as lab-on-a-chip systems.