Els prions són els agents causants de les encefalopaties espongiformes transmissibles: malalties amb un llarg període d'incubació associades a una neurodegeneració progressiva i letal, i la deposició d'una proteïna resistent a la degradació amb proteases coneguda com PrPres. L'aparició d'una nova malaltia humana (la variant de la malaltia de Creutzfeldt-Jakob) i la seva associació amb malalties priòniques animals com l'encefalopatia espongiforme bovina (EEB) ha produït en els últims anys un increment dels esforços i els estudis per al control i l'eradicació d'aquestes i d'altres malalties priòniques ja existents com la tremolor ovina o scrapie del bestiar oví. En aquest treball, s'ha avaluat per primera vegada el paper dels prions com a contaminants ambientals i el risc associat a la seva possible transmissió.En els escorxadors on es processen animals de risc i animals infectats per malalties priòniques existeix un risc associat al material infecciós (teixit cerebral, medul·la, nerviós) que s'aboca a les aigües residuals. Mitjançant la detecció d'adenovirus porcins i bovins per PCR niada en aquestes aigües es va determinar la presència de contaminació d'origen animal específica de bestiar boví i porcí. En les primeres, gràcies al desenvolupament d'un protocol basat en centrifugacions i detecció per western-blot, es va determinar l'existència de nivells inferiors a 2-4 µg de material infecciós en 15 ml d'aigua residual. D'acord amb els estudis d'infectivitat presents en bibliografia, aquestes dades equivalen a una presència inferior a 10-6-10-7 dosis letals 50 per via oral en humans.L'excreció de proteïnes priòniques per via fecal pot representar una entrada directa d'agents infecciosos en el medi. Un cop desenvolupat un mètode detecció basat en elució amb detergents i immunoprecipitació abans de la detecció per western-blot,es va determinar el patró d'excreció de prions en ratolins alimentats amb material infecciós i en ratolins en la fase terminal de la malaltia. En els darrers, els nivells es van mostrar indetectables, mentre que en els segons es van detectar prions 24-48 h post-administració. Aquestes dades indiquen la possibilitat d'una excreció de prions al medi en animals que ingereixen aliments contaminats. Considerant l'elevada resistència dels prions als processos inactivadors, es va determinar la persistència de la molècula de PrPres en el medi i, concretament, en medis vehiculars com l'aigua. Mitjançant un protocol de concentració per ultracentrifugació i detecció per western-blot, es va estimar el temps necessari d'inactivació del 90% i 99% (t90 i t99) de la PrPres associada a l'agent infecciós EEB i scrapie inoculats en aigua de mar, aigua residual urbana i d'escorxadors. Les t99 obtingudes per a EEB foren de 25 a 60 dies, aproximadament del doble en el cas d'scrapie. i 10 cops superiors en el cas de solucions fisiològiques. La pèrdua de l'activitat infectiva està essent valorada actualment mitjançant bioassajos murins. Les dades obtingudes en aquest estudi representen la primera valoració de la presència de proteïnes priòniques en el medi i de les seves possibles vies d'entrada, i suposen el desenvolupament de noves eines per al control del risc associat amb l'exposició als prions en el medi. / "Study of the excretion and stability of prions in the environment"TEXT:Prions are the causative agents of the transmissible spongiform encephalopathies: lethal diseases with long periods of incubation and associated to the deposition of a protease-resistant protein named PrPres. Concerns about the control and eradication of prion diseases increased with the identification of a new human disease (the variant of Creutzfeldt-Jakob disease) and its link with the bovine spongiform encephalopathy (BSE). This work evaluates for the first time the role of prion proteins as environmental contaminants, and the risk associated with its potential transmission.Slaughterhouses processing risky and infected animals may drain wastewaters containing infective tissues (brain, spleen, nervous tissues). By the detection of porcine and bovine adenovirus by nested-PCR protocols in these waters, it was determined the presence of pollution from porcine and bovine origin. After the development of a centrifugation-based western-blot method, the former was shown to contain less than 2-4 µg of infectious tissue per 15 ml of wastewater. According to published infectivity studies, these levels are equivalent to lower concentrations than 10-6-10-7 oral lethal dose 50 for humans. Prion excretion by the oral-fecal route may represent a direct input of infectious agents into the environment. A method based on elution with detergents, immunoprecipitation and western-blot detection was developed. Prion excretion was studied in terminally-sick infected mice and also on mice feed with infectious agents. The former show undetectable levels whereas the latter show prions 24-48 hours post-administration. Data presented could suggest a prion excretion in animals being feed with contaminated aliments.Considering the high resistance of prions to inactivating procedures, it was analyzed the persistence of PrPres molecules in the environment, especially in vehicular media such as water. By a protocol based on ultracentrifugation and western-blot detection, the time needed for the 90 and 99% inactivation (t90 and t99) of PrPres associated to BSE and scrapie agents inoculated in seawater, urban and slaughterhouse sewage. t99 values obtained were from 25 to 60 days for BSE, 2-fold higher for scrapie and 10-fold higher for physiological solutions. The loss of infectivity is currently being analyzed by murine bioassays. Data obtained in this study is the first evaluation of the presence of prion proteins in the environment and their potential routes of entrance, and represents the development of new tools for the control of the risk associated to the exposition to prions in the environment.

El novembre de 2002 el Prestige s'accidentà i enfonsà a 130 milles nàutiques del litoral gallec. Van vessar-se més de 60 kt de fuel Bunker C, que generaren un fort impacte ambiental, econòmic, social i mediàtic. Aquest treball ha pretès caracteritzar-ne químicament els processos d'envelliment per contribuir a conèixer-ne el destí ambiental, estudiar les comunitats microbianes implicades en la degradació i avaluar l'ús d'un fertilitzant oleofílic com a agent bioestimulant.En un primer experiment in vitro es constatà que el fertilitzant augmentava significativament la degradació de les fraccions lleugeres del fuel, en tenir un efecte tensioactiu, que n'incrementava la solubilitat i biodisponibilitat. Al camp, el fertilitzant augmentà i accelerà la degració d'n-alcans i hidrocarburs aromàtics policíclics (HAP), particularment els pesats i alquilats. La comunitat microbiana presentà una diversitat elevada i no van detectar-se canvis significatius en períodes de mostreig o entre parcel·les, excepte les mostres del dia 30 de la parcel·la tractada, les diferències de la qual s'expliquen per la presència del fertilitzant. Un gènere important a destacar seria Rhodococcus que podria estar relacionat amb la degradació d'n-alcans de cadena llarga.A partir de la mostra de chapapote de l'experiment in vitro, s'obtingué un consorci degradador autòcton per enriquiment. L'inòcul s'estudià per MPN, aïllament de soques degradadores, DGGE i llibreria de clons del gen 16S rRNA. Inicialment es detectaren 19 gèneres, sobretot de γ i α-proteobacteria, molts degradadors d'hidrocarburs (com Marinobacter o Alcanivorax). Al consorci resultant només se'n detectaren 13, amb predomini d'Alcanivorax.En un experiment dut a terme per avaluar la capacitat degradativa del consorci i estudiar l'evolució de la comunitat durant la degradació, els degradadors d'hidrocarburs alifàtics i n-alcans van augmentar ràpidament (de 105 to 108 MPN ml-1) i només hi hagué diferències significatives entre ambdós tipus de recompte al final de l'experiment, quan la població degradadora d'hidrocarburs alifàtics fou superior. Els degradadors d'HAP van créixer més lentament i els recomptes foren més baixos (de 104 to 107 MPN ml-1). Ambdues fraccions es degradaren més del 40% durant la cinètica.Els gèneres predominants foren d' α-proteobacteria (Thalassospira, Parvibaculum) i de γ (Alcanivorax, Marinobacter). En el cas dels degradadors de fracció alifàtica i n-alcans, la diversitat va reduir-se significativament i predominaren tres bandes corresponents a Thalassospira, Alcaligenes i Parvibaculum. El PCA dut a terme permet suposar que Marinobacter i Parvibaculum estarien relacionats amb la degradació tardana del fuel i que mentre que Marinobacter s'associaria a la degradació d'alcans o hidrocarburs alifàtics, Mesorhizobium s'associaria a la d'HAP.Com que al fuel del Prestige són abundants les resines i els asfaltens (fraccions més polars i pesants), que no havien estat analitzades prèviament, i que al medi es produeixen altres processos d'envelliment com la fotooxidació, es dugué a terme un experiment per conèixer la interacció entre ambdós processos, i com aquests afectaven la resta de fraccions del fuel (carbazols, resines i asfaltens). Les mostres s'analitzaren per GC-FID, GC-MS, FTIR i GCxGC-ToFMS.La fotooxidació afectà notablement la fracció aromàtica i la de resines augmentà relativament. La fracció d'asfaltens no es va veure alterada significativament. La biodegradació afectà les fraccions més lleugeres, però les pesants pràcticament no van variar. L'anàlisi en detall de les fraccions per GC-MS i GCxGC-ToFMS, revelà que, si bé el consorci degradava "només" la major part dels n-alcans, els HAP i els carbazols, l'acció conjunta dels processos de fotooxidació i biodegradació incrementava i accelerava la degradació. Va veure's, també, que la fotooxidació generava compostos més polars que eluïen a la fracció de les resines. Aquests compostos desapareixien en biodegradar les mostres. / In November 2002 the oil tanker "Prestige" had and accident and sank 130 nautical miles from the Galician coast, releasing more than 60 kt of Bunker C, which had strong environmental, economical, social and mediatic impacts. This work aims to contribute to understand the fate of the heavy oil and the microbial communities involved in its biodegradation.A laboratory assay was performed to provide preliminary information on the potential biodegradability of the heavy oil, using two microbial consortia and hydrophilic and oleophilic fertilizers (S200). S200 strongly increased the extent of biodegradation, especially of recalcitrant compounds. A subsequent field assay showed an enhanced biodegradation of both the aliphatic and aromatic fractions. No significant changes on microbial community structures were detected, with the exception of the fertilized samples taken at day 30.An autochthonous consortium was obtained from fuel by enrichment. The microbial community, studied using culture-dependent and non-dependent techniques (DGGE, clone libraries), was mainly comprised of α- (Thalassospira, Parvibaculum) and γ-proteobacteria (Alcanivorax, Marinobacter) and was able to degrade most of the n-alkanes, PAHs and carbazoles, but not the heavy fractions.To study the interactions between the photooxidation and biodegradation processes and to assess the degradation of the polar fractions of the heavy oil, a third in vitro assay was carried out. The samples were analized by GC-FID, GC-MS, FTIR, TLC and GCxGC-ToFMS. Phootoxidation affected basically the aromatic fraction, whereas the resines relatively increased and the asphaltenes experienced no significant alterations. The combination of both processes accelerated and enhanced the degradation of fuel, not only of the light fractions but also of polar photooxidation products.

Les infeccions causades per Legionella són un greu problema de salut pública al nostre país. La majoria de casos esporàdics i de brots epidèmics es relacionen amb aigües de consum que han estat sotmeses a un o més processos de desinfecció. Tot i això, Legionella spp. no només és capaç de sobreviure a aquests tractaments sinó que es multiplica al llarg dels sistemes de distribució convertint-se en un risc ambiental. Els principals factors que afavoreixen la supervivència i multiplicació de Legionella als sistemes d’aigua resideixen en la pròpia biologia del bacteri, que ha demostrat en moltes ocasions ser resistent a condicions físico-químiques extremes, així com les interrelacions que estableix amb altres microorganismes com els protozous, amb els que comparteix hàbitat. Els protozous, i en concret les amebes de vida lliure dels gèneres Acanthamoeba o Hartmannella s’han descrit en els últims anys com habitants freqüents dels sistemes de distribució d’aigua. Aquestes sobreviuen a condicions adverses mitjançant la formació d’estructures de resistència anomenades cists. La font nutricional de les amebes són els bacteris els qual fagocita i digereix. Tot i això, alguns d’aquests bacteris han desenvolupat estratègies per sobreviure la digestió amebiana i no sols això sinó que com en el cas de Legionella, poden fins i tot aprofitar els resursos cèl•lula hoste per multiplicar-se. A més, en estat endosimbiont Legionella queda protegida de l’efecte de desinfectants fet que podria originar una ràpida recolonització dels sistemes d’aigua un cop acabats els tractaments de desinfecció. Tres dels desinfectants més utilitzats a nivell europeu per tractar l’aigua de consum són el clor, la temperatura i la radiació UV. Tot i que el seu ús està regulat en nombroses normatives estatals, aquestes s’apliquen sense tenir en compte les amebes de vida lliure i les interrelacions que aquestes poden tenir amb altres microorganismes. L’objectiu principal d’aquest treball va ser estudiar l’eficàcia d’aquests tres desinfectants de l’aigua aplicant les mateixes condicions d’estudi sobre Legionella spp.; amebes de vida lliure en els dos estats de vida, trofozoïts i cists; i sobre els simbionts que estableixen Legionella i Acanthamoeba. En primer lloc es van obtenir soques de Legionella spp., i amebes de vida lliure de diferents orígens, tant ambientals com de col•lecció i es van optimitzar els protocols de cultiu dels diferents microorganismes, especialment pel que fa a les amebes. A continuació es van posar a punt mètodes quantitatius que ens permetessin comparar la viabilitat cel•lular després de cada tractament amb els tres desinfectants. I es van establir les condicions d’assaig per a cada un dels desinfectants. Finalment es van establir co-cultius per observar si l’associació entre Legionella i Acanthamoeba modificava d’alguna manera l’eficàcia dels desinfectant envers aquests dos microorganismes. La formació de co-cultius i el seu monitoreig mitjançant la tècnica del FISH ens va permetre observar com la soca de Legionella passava d’un estat plactònic a un estat d’emdosimbiont a l’interior dels trofozoïts. Analitzant la susceptibilitat de les diferents soques de Legionella, d’amebes de vida lliure, tan en estat de trofozoït com de cist, així com de Legionella com a endosimbiont d’Acanthamoeba per cadascun dels tractaments aplicats, es van proposar diferents models per descriure’n la cinètica d’inactivació. A partir d’aquí els resultats obtinguts es van comparar amb altres estudis publicats i se’n van extreure unes conclusions finals. Els resultats mostraren que clor, temperatura i radiació UV tenen un efecte desinfectant diferent pel que fa a les diferents soques de Legionella i amebes de vida lliure. Les diferències observades entre els diferents tractaments poden ser atribuïbles a la concentració de desinfectant, el temps d’exposició i a les diferències intrínseques de cada soca per cada microorganisme utilitzat. Pel que fa a la susceptibilitat de les amebes, trofozoïts i cists es van comportar de maneres diferents, sent els trofozoïts més sensibles que els cists. Finalment, L. pneumophila va resultar ser més resistent als tractaments amb desinfectants aplicats associada a trofozoïts d’Acanthamoeba en comparació amb el bacteri en condicions axèniques. Per tant, a l’hora d’aplicar tractaments de desinfecció, cal tenir en compte la complexa ecologia de Legionella com a endosimbiont d’amebes perquè aquests siguin eficaços i evitar així processos de recolonització. / Legionella infections are serious problem which causes concern to health public services in our country. Despite all measures and controls realized, most sporadic cases and outbreaks have been related to drinking water systems that have been subjected to one or more disinfection processes. Legionella spp., not only survive these treatments but multiplied over the distribution system becoming a potential environmental hazard. The main factors that promote Legionella survival and proliferation in water systems are the bacteria biology itself, since Legionella is able to survive under a wide range of environmental conditions, as well as the relationship that Legionella establishes with other microorganisms that live in the same habitat as protozoa. Protozoa, and specifically free-living amoebae of the genera Acanthamoeba and Hartmannella have been described as common inhabitants of drinking water distribution systems. These amoebae survive in front harsh environmental conditions by forming resistant structures called cysts. Amoebae feed mainly on bacteria which are engulfed by phagocitosis and digested intracellularly. However, some of these bacteria have developed some strategies to survive amoebae digestion and some of them, as Legionella are able to use host cellular resources to multiply within it. In addition, as an endosimbiont, Legionella remains protected from disinfectants which could lead to a rapid recolonization of water distribution systems once disinfection treatments have been applied. Three of the most commonly used water disinfectants in Europe for drinking water treatment are chlorine, temperature and UV radiation. Although its use is regulated by many national guidelines, its efficacy relies mainly on bacterial inactivation without considering other microorganisms such as free living amoebae and its relationships with other microorganisms as Legionella. Therefore, the main objective of this work was to study the effectiveness of these three water disinfectants applying the same study conditions, on Legionella spp.; free-living amoebae considering its two life stages; and on the simbionts between Legionella and Acanthamoeba. First of all, several strains of Legionella spp., and free-living amoebae from different origins (environmental and from culture collections) were obtained and culture protocols were optimized, especially for free-living amoebae. Second, test conditions were established for each of the disinfectants and a quantitative method was implemented in order to compare cell viability after every disinfection treatment. Finally, to see whether the association between Legionella and Acanthamoeba modifies the effectiveness of the three disinfectants towards these two types of microorganisms, co-cultures of Legionella and Acanthamoeba were realized. Co-culture formation was monitored by using a FISH method, which led us observe how axenic Legionella changed to an intracellular state within Acanthamoeba trophozoites. Analyzing the susceptibility of the Legionella spp. strains; free-living amoebae strains, either trophozoites and cysts stages; as well as Legionella as an Acanthamoeba endosymbiont, for each of the treatments applied, inactivation kinetics models were proposed. Results obtained were compared with studies published by other authors and final conclusions were considered. Results showed that, chlorine, temperature and UV radiation have a disinfectant effect on the different Legionella strains used, as well as on free living amoebae. Differences on the disinfectant effect could be atributted to disinfectant concentration, exposure time and strain intrinsic characteristics. Regarding free living amoeba, trophozoites and cysts had a significantly different behaviour, being trophozoites more sensitive to disinfectants than cysts. Finally, L. pneumophila as and endosymbiont of amoeba strains showed a greater resistance to disinfectant compared with the axenic state. Because of that, when applying disinfections treatments, the complex ecology of Legionella as an amoeba endosymbiont should be considered in order to prevent a system recolonization.

Fungi is the eukaryotic group with a largest amount of completely sequenced species and therefore it is particularly well suited for comparative genomics analyses. A species tree is often an important part of phylogenomics analysis. Concern about its reliability led us to design several methods by which we could identify nodes in the species tree that were poorly supported by a whole phylome. We determined that the species tree was mostly well supported but some nodes showed large discrepancies to most genes.These results could partly be attributed to evolutionary events that result in topological changes in gene trees. Our analyses have shown that HGT plays an important role in fungal evolution. Gene duplications followed by differential loss are also often the cause of incongruence. The OXPHOS pathway, despite being formed by multi-protein complexes, has been affected by this process at similar levels than the rest of the genome. / Els fongs són el grup d'espècies eucariotes amb un major nombre de genomes completament seqüenciats. Per això són un grup ideal on aplicar tècniques filogenòmiques. L'arbre de les espècies és un punt clau en molts anàlisis filogenòmics i com a tal necessitem saber si és fiable. Hem dissenyat diferents mesures que aprofiten la informació d'un filoma per identificar aquells punts en l'arbre de les especies que no estan ben suportats. Les discrepàncies que hem trobat poden ser degudes a successos evolutius (transferència horitzontal, duplicacions,...). Hem demostrat que la transferència horitzontal juga un paper important en l'evolució de fongs. També hem estudiat els efectes de duplicacions en l'evolució de la via metabòlica de la fosforilació oxidativa.Podem concloure que l'arbre de les especies és majoritàriament robust, però que necessitem ser capaços d'identificar nodes subjectes a variacions. Successos evolutius poden ser la causa de les discrepàncies observades en els arbres gènics.

Tesi realitzada a l'Institut de Recerca de l'Hospital Universitari Vall d'Hebron - Grup d'Immunologia / CIBBM-Nanomedicina / The main goal of this thesis was to investigate the function of the endogenous CD300f. Initially, CD300f was described as an inhibitory receptor, although some data generated in our lab strongly suggested the possibility that the receptor could trigger activating signals in specific situations. It was planned to use two monoclonal antibodies (UPD1 and UPD2), that recognize the extracellular domain of CD300f in order to analyze the function of the endogenous CD300f. However, extracellular domain of CD300f has a high homology with the extracellular domain of CD300d, a new member of the CD300 family receptors. Thus, it was essential to check if UPD1 and/or UPD2 cross-reacted with CD300d. Unexpectedly, CD300d was unable to reach the cell surface in transfected cells, so it was not possible to check if the antibodies recognize it. That result prompted us to further investigate and characterize the CD300d receptor. Finally, the cloning and characterization of CD300d has contributed to complete the description of the human CD300 locus. Concretely, the CD300d gene spans a 12.5 kb region on chromosome 17 (position 17q25.1), has an open reading frame of 585 bp and encodes for a type I transmembrane protein of 194 amino acids. The molecule is composed by an immunoglobulin-like extracellular domain, a transmembrane domain containing a negative charged residue and a short cytoplasmic tail without known signaling motifs. CD300d has a predicted molecular mass of 21.5kDa, however presents two distinct mature forms of 30 and 34 KDa in transfected COS-7 cells. Both conformations are posttranslationally modified by N-glycosylations in the Ig domain. The CD300d receptor is expressed by primary monocytes and granulocytes. Conversely, T, B or NK lymphocytes do not express the receptor. Unpredictably, CD300d is retained in the endoplasmic reticulum of transfected cells. Even so, the interaction with the FcR-gamma adapter permits a slight surface recovery of the receptor in COS-7 cells but not in RBL-2H3 cells. In addition, CD300d is able to interact in vitro with the rest of known CD300 family receptors, with the exception of CD300c. Therefore, CD300d could play a role in the formation of CD300 complexes on the cell surface and consequently could modulate the state of activation of myeloid cells. The CD300d and CD300f immunoglobulin domains present a 71% of identity. Nevertheless, UPD1 and UPD2 mAb recognize exclusively the CD300f receptor. Surprisingly, the stimulation of the endogenous CD300f receptor induces the production of TNF pro-inflammatory cytokine in primary monocytes, giving support to the dual activity of the receptor, initially described as inhibitor. Furthermore, crosslinking of endogenous CD300f, in PMA differentiated U937 or THP-1 monocytic cells, induce the production of TNF-alpha and IL-1-beta pro-inflammatory cytokines. The activating functions of the CD300f could be mediated through its association with FcR-gamma and/or DAP12 adapter molecules, proved in vitro. The binding involves the transmembrane charged residue of the adapters and the transmembrane domain of the receptor. The expression of endogenous FcR-gamma nd DAP12 adapter molecules was upregulated, in U937 and THP-1 cells. In addition Syk kinase, JNK kinase and PKC-delta are involved in the activating signaling mediated by CD300f. Altogether, supports the functional association of FcR-gamma and/or DAP12 with the CD300f receptor. Finally, we prove the existence of soluble forms of the CD300f receptor. / L’objectiu principal d’aquesta tesis era investigar la funció del receptor CD300f endogen. Inicialment, el CD300f es va descriure com a receptor inhibidor, tot i que alguns resultants del nostre laboratori suggerien la possibilitat que el receptor podia desencadenar respostes cel•lulars activadores en algunes circumstàncies. Amb el propòsit d’estudiar la funció del receptor CD300f endògen, es va decidir usar dos anticossos monoclonals (UPD1 i UPD2), que tenien la capacitat de reconèixer el domini extracel•lular del CD300f. Ambdós anticossos es varen obtenir en el nostre laboratori anteriorment, amb l’objectiu de permetre caracteritzar el receptor CD300f; varen ser seleccionats segons la seva capacitat per reconèixer el CD300f i no cross-reaccionar amb la resta de molècules CD300 conegudes fins al moment (CD300a, CD300b, CD300c i CD300e). Tot i així, poc temps abans de començar a treballar en aquesta tesis, en el laboratori s’havia clonat un nou membre de la família CD300, anomenat CD300d. Així doncs era necessari comprovar si els anticossos UPD1 o UPD2 cross-reaccionaven amb aquest nou membre de la família. Malauradament, el receptor CD300d era incapaç d’expressar-se a la membrana de cèl•lules transfectades, així doncs no era possible verificar si els anticossos el reconeixien. Aquest resultat ens va portar a investigar en més profunditat el CD300d. Finalment, el clonatge i caracterització del receptor CD300d ha contribuït a la descripció del locus humà CD300, que conté sis membres (del CD300a al CD300f) i ocupa una regió de 450 Kb en el cromosoma 17. Es va poder confirmar que els anticossos UPD1 i UPD2 reconeixien específicament el CD300f i no el CD300d. Sorprenentment, es va demostrar que l’estimulació del receptor CD300f endògen en monocits primaris o les línies monocítiques U937 i THP-1 generaven una resposta pro-inflamatòria. En referència al receptor CD300d es va observar que no s’expresa a nivell de membrana cel•lular sinó que era retingut al reticle endoplasmàtic, indicant que la seva funció biològica podria ser la de regular l’expressió superficial de la resta de membres de la família CD300.

La peste porcina africana (PPA) es una enfermedad hemorrágica altamente infecciosa que afecta principalmente a cerdos domésticos, causando verdaderos estragos en la producción porcina en los países afectados. El agente causal de la enfermedad, el virus de la peste porcina africana (VPPA), es extremadamente complejo e infecta tanto a suidos salvajes como domésticos y a las garrapatas del género Ornithodoros. A día de hoy, no existe una vacuna eficaz contra el VPPA, por lo que su erradicación depende de un diagnóstico rápido de la enfermedad acompañado del sacrificio de los animales infectados y/o expuestos al virus. Asimismo, existe un gran desconocimiento tanto sobre los mecanismos de protección implicados frente al VPPA, como respecto a los antígenos del virus potencialmente protectores, lo que dificulta aún más el desarrollo de estrategias vacunales efectivas. Así pues, dos fueron los principales objetivos de este trabajo. Primero, el desarrollo de nuevas estrategias vacunales frente a la PPA, caracterizando tanto el grado de protección alcanzado como los mecanismos y antígenos implicados en la misma. Segundo, la propuesta de un modelo de protección homóloga con virus atenuado que permitiera profundizar en el conocimiento de los mecanismos implicados tanto en protección como en inmunopatogenia. Los principales logros alcanzados se pueden resumir en: i) la caracterización, por primera vez en el caso del VPPA, de dos epítopos T-CD8+ con capacidad protectora, ambos localizados en la hemaglutinia (HA) del virus; ii) la demostración del enorme potencial de la estrategia de inmunización con librerías de expresión (ELI) utilizada, diseñada expresamente para optimizar una respuesta T-CD8+ específica, revelando su utilidad tanto para obtener niveles de protección nunca antes alcanzados con vacunas DNA, como para caracterizar nuevos antígenos virales capaces de estimular una respuesta T-CD8+ protectora; y iii) la puesta a punto de un modelo de protección homóloga utilizando un virus atenuado que ha permitido ratificar la relevancia de la respuesta celular en protección, esclareciendo los mecanismos implicados tanto en protección como en la inmunopatogenia asociada a la infección con cepas de VPPA altamente virulentas. Estamos convencidos de que los avances obtenidos durante esta Tesis Doctoral facilitarán el diseño más racional de futuras vacunas frente a la PPA. / African swine fever (ASF) is a fatal highly-infectious hemorrhagic disease which affects domestic and European wild pigs, albeit African wild boars and ticks from genus Ornithodoros can also be unapparently infected. ASF has a devastating effect on porcine production causing major economic impacts on the affected countries. The causal agent of the disease, African swine fever virus (ASFV), is an extremely complex virus and, unfortunately, against which there is no effective vaccine available. Consequently, ASF-eradication relies on its rapid diagnostic and the culling of the infected and/or exposed pigs. Little is known about both the mechanisms of protection and the potentially protective ASFV-viral antigens. Therefore, developing an efficient vaccine against ASFV is a must. The present study had two main objectives. On one hand, to develop new vaccine strategies against ASF, characterizing both the degree of protection achieved and the mechanisms and antigens involved in such protection. And, on the other hand, the proposal of an attenuated viral strain as the ideal model to deeply characterize the mechanisms implicated in homologous protection and for comparative immunopathogenesis studies. The main findings obtained can be summarized as follows: i) the characterization, for the first time in the case of ASFV, of two CD8+-protective epitopes, located in the viral hemagglutinin (HA); ii) the statement of the huge potential of an expression library immunization (ELI) as a vaccine strategy when designed to optimize a CD8+-specific response, such strategy has allowed us to obtain the highest levels of protection achieved using DNA-vaccines and to characterize new protective CD8+-antigenic determinants within the ASFV genome; and iii) the optimization of an animal model to characterize the mechanism involved in homologous protection based on the immunization with an attenuated viral strain, which has allowed us to ratify the relevance of the Tcell-response in the achieved protection, elucidating the specific mechanisms implicated in both the protection afforded by attenuated virus and the immunopathogenesis associated with the infection with highly pathogenic ASFV strains. We are convinced that the results obtained during the present Ph.D. Thesis will facilitate the design of more rational vaccines against ASF in the future.

Les pàgines 69 a 72 han estat retirades seguint instruccions de l’autora de la tesi, en existir participació d’empreses, existir conveni de confidencialitat o existeix la possibilitat de generar patents / Las págínas 69 a 72 han sido retiradas siguiendo instrucciones de la autora, al existir participación de empresas, convenio de confidencialidad o la posibilidad de generar patentes / Pages from 69 to 72 have been withdrawn on the instructions of the author, as there is participation of undertakings, confidentiality agreement or the ability to generate patent / Els alquilbenzens lineals són els precursors per a la fabricació dels alquilbenzens lineals sulfonats, un dels principals surfactants aniònics per a usos domèstics i industrials. Aquest producte és una barreja de diversos homòlegs i isòmers, composats per una part alifàtica i una part aromàtica, que presenten una molt baixa solubilitat en aigua. Els LABs s’han detectat en aigües i sediments en nombrosos estudis. La present tesi doctoral ofereix la valoració de l’estat d’un aqüífer contaminat per LABs i l’avaluació de diverses estratègies de remediació; alhora que estudia les comunitats microbianes implicades en les diverses estratègies de bioremediació i es fa una comparació entre diverses tècniques emprades per la caracterització de les poblacions microbianes. S’ha avaluat la biodegradabilitat dels LABs per part de consorcis degradadors obtinguts prèviament al grup de recerca, comparant-la amb la biodegradabilitat per part de la microbiota autòctona amb diverses estratègies de bioestimulació; obtenint molt bons resultats emprant la microbiota autòctona. En segon lloc, s’ha avaluat la biodegradabilitat d’aquests compostos sota diverses condicions redox, per tal de mimetitzar les condicions variables de l’emplaçament. S’ha comparat la degradació dels LABs en condicions aeròbies, desnitrificants i seqüencials aeròbies- desnitrificants per part de la població autòctona, obtenint degradacions relativament ràpides en tots els casos. Les poblacions microbianes implicades en cadascun dels casos s’han caracteritzat, tant mitjançant mètodes de fingerprinting (DGGE) com per piroseqüenciació i quantificant les poblacions i gens relacionats amb la degradació. D’altra banda, s’ha estudiat la possibilitat d’acoblar les tecnologies d’oxidació química i bioremediació per intentar obtenir degradacions més ràpides; emprant permanganat de potassi i reacció de Fenton modificada. Els resultats obtinguts no aconsegueixen millorar la degradació obtinguda amb la bioremediació sola. S’ha avaluat també l’afectació de les poblacions microbianes per l’aplicació dels oxidants químics, tant en assajos de tipus batch com emprant columnes de sòl, un mètode més aproximat a la situació real in situ. L’avaluació de la degradació en columnes de sòl ha mostrat també la diferència entre l’ús de batch i aquestes, requerint temps d’actuació molt més llargs. Les poblacions microbianes implicades en cadascun dels casos s’han descrit mitjançant DGGE i quantificant les poblacions i gens relacionats amb la degradació. Per últim, s’ha comparat els resultats obtinguts en la caracterització de les poblacions microbianes in situ emprant diversos mètodes, tant relacionats amb la microbiologia clàssica com tècniques moleculars. Les tècniques valorades han estat l’aïllament de microorganismes, tècniques de fingerprinting (DGGE), l’enriquiment de poblacions microbianes actives in situ (emprant les perles BioSep) seguida de DGGE i tècniques de seqüenciació massiva (piroseqüenciació). Aquesta comparació ha demostrat que els resultats obtinguts depenen fortament de la tècnica emprada, i que no existeix una tecnologia idònia per a la caracterització de les poblacions microbianes, sinó que s’ha te tenir en compte els avantatges i limitacions de cadascuna de les tècniques. L’opció recomanada és emprar diverses tecnologies combinant els resultats de cadascuna d’elles per tenir una idea global de la presència i composició de les comunitats microbianes. Mitjançant aquesta combinació de tecnologies, s’ha descrit la microbiota autòctona de l’aqüífer en condicions normals i en presència de la contaminació. A més, s’ha identificat diversos phya i gèneres relacionats amb la presència o absència dels contaminants, servint així com a indicadors de la presència de contaminants o de l’ocurrència de processos de degradació. / Linear alkyl benzenes (LABs) are used to manufacture alkyl benzene sulphonates, one of the most widely used anionic surfactants in domestic and industrial applications. An industrial site near Barcelona (Spain) whose groundwater was polluted following the rupture of an old storage tank was examined. The purpose of the present thesis is to assess the present state of the aquifer and evaluate diverse remediation strategies. In addition, microbial populations characterization was performed, as well as a comparison between several techniques used for this characterization. The biodegradability of LABs using a hydrocarbon-degrading consortium and using the autochthonous microbiota has been assessed using diverse biostimulation strategies; obtaining high levels of degradation by using the indigenous microbiota. Also, the ability of the autochthonous microbiota to degrade LABs under aerobic, denitrifying and sequential aerobic-denitrifying conditions was tested, obtaining promising results. In all cases, the quantification of functional genes related to alkane and aromatic biodegradation pathways was assessed. Additionally, in order to increase the degradation rates in vitro chemical oxidation assays were performed, coupled to bio stimulation. Potassium permanganate and a modified Fenton reaction were tested. In addition the capability of subsequent natural attenuation after chemical oxidation and the changes on the product bioavailability were also assessed. The results showed that chemical oxidation did not increase the degradation compared to biostimulation. To determine the effect of the oxidant on autochthonous microbiota the microbial populations were characterized. The evaluation of biodegradation and chemical oxidation was also performed in soil columns, evaluating the affectation of microbial populations using this method, more similar to the real in situ conditions than the batch experiments. Finally, the results obtained in the in situ microbial communities characterizations by means of diverse techniques were compared. The considered techniques were isolation, fingerprinting techniques (DGGE), enrichment of active microbial populations in situ (using BioSep beads, spiked or not with LABs) and further DGGE; and new generation sequencing tools (pyrosequencing). This comparison has shown the strong effect of the used technique in the microbial population characterization. Phyla and genera related with the presence of pollutant and the occurrence of biodegradation have been identified.

Les poblacions humanes i animals excreten una gran diversitat de virus patògens en les seves femtes i orina, de manera que l’aigua residual que generen representa un dels principals vehicles de la disseminació de patògens a les aigües superficials, subterrànies o costaneres i conseqüentment, als aliments. La contaminació del medi ambient suposa un risc greu de salut pública. S’ha estimat que en el conjunt del planeta, aproximadament 3.000 milions de persones no disposen d’aigua potable i que el 95% de l’aigua residual domèstica és abocada al medi ambient sense tractar. Aquesta tesi doctoral es basa en dues àrees d’estudi de la virologia ambiental. Per una banda s’ha avaluat l’estabilitat de virus contaminants en condicions naturals (Capítol I) i davant processos de desinfecció (Capítol II). En aquests estudis, els indicadors virals/patògens HAdV i JCPyV han estat analitzats. D’altra banda, s’ha proposat una nova eina per a la identificació de l’origen de la contaminació fecal al medi ambient (Capítol III). Al Capítol I, que inclou els estudis 1, 2 i 3, s’ha caracteritzat els factors ambientals i els mecanismes que intervenen en la inactivació natural dels HAdV a diferents ambients aquàtics i aliments, considerant la temperatura i la llum solar com els agents potencialment més rellevants, així com l’estandardització entre diferents laboratoris d’un mètode de qPCR per a la quantificació dels HAdV en mostres d’aliments (fruits rojos). Al Capítol II (estudis 4, 5 i 6) s’ha estudiat l’efectivitat de tractaments químics (clor) i físics (llum ultraviolada) en la inactivació de virus contaminants. Finalment, al Capítol III (estudi 7), s’ha considerat que era interessant completar les eines moleculars existents per a identificar les fonts de contaminació fecal en aigua i aliments, i s’ha desenvolupat una nova tècnica molecular per a traçar la contaminació fecal d’aviram al medi ambient, mitjançant la detecció i quantificació dels parvovirus de pollastre i gall d’indi. És evident que la contaminació viral en el medi representa un risc d’infecció important en països en vies de desenvolupament però també en zones industrialitzades on els tractaments d’aigua no aconsegueixen eliminar la totalitat dels virus presents. Durant el desenvolupament d’aquesta tesi doctoral s’ha demostrat que, en molts casos, els mètodes de desinfecció més habituals en la inactivació de virus contaminants no són completament eficients i sovint es detecten virus infecciosos després de tractaments a les dosis o concentracions habitualment utilitzades. Aquesta observació demostra la importància de seguir treballant per a caracteritzar els diversos factors i mecanismes particulars que condicionen la inactivació natural dels virus patògens al medi ambient, i de desenvolupar i optimitzar nous mètodes de desinfecció per assolir la inactivació d’un rang de microorganismes més ampli, més enllà dels indicadors bacterians tradicionals. Els avanços en la virologia ambiental han d’anar forçosament acompanyats d’avenços en els tècniques i mètodes utilitzats, que han de permetre detectar, quantificar i caracteritzar els virus presents al medi de manera rutinària. En aquest sentit, els mètodes moleculars representen eines valuoses que faciliten l’estudi de diversos aspectes de la disseminació de virus al medi ambient, com per exemple identificar l’origen de la contaminació fecal per a implementar mesures de remediació a les fonts de contaminació més rellevants en cada localitat. Els virus patògens contaminants representen un problema de salut pública que cal resoldre imperativament millorant els processos de control microbiològica de recursos tant imprescindibles com són l’aigua i els aliments, introduint paràmetres virals que complementin als indicadors fecals bacterians estàndards.

La contaminación de suelos con derivados del petróleo es un problema a nivel mundial, especialmente en los países productores y exportadores de crudo, teniendo consecuencias muy perjudiciales para el medio ambiente y la salud humana. Una de las mejores alternativas de remediación de suelos es la aplicación de métodos biológicos, como la biorremediación, por tratarse de una tecnología amigable con el medio ambiente y por sus menores costos en comparación con técnicas físicas y químicas. La presente Tesis Doctoral tiene como objetivo estudiar las poblaciones y los procesos microbianos implicados en la biodegradación ambiental de hidrocarburos en suelos contaminados con mezclas petrogénicas sometidas a biorremediación, especialmente sobre aquellos relacionados con los hidrocarburos aromáticos policíclicos (HAPs) y sus derivados metilados. Para ello, se ha utilizado como modelo el suelo procedente de un emplazamiento contaminado con gasoil y aceites hidráulicos pesados de la comunidad de Madrid sometido a biorremediación mediante tratamiento en biopilas aerobias estáticas on site. De esta forma, se ha analizado el destino de los HAPs, mediante su cuantificación y la detección de posibles productos de su oxidación parcial por GC-MS, y los cambios en la estructura de las comunidades bacterianas implicadas a lo largo del tratamiento, mediante la utilización de técnicas dependientes de cultivo y de ecología microbiana molecular, como la pirosecuenciación de librerías de ADNr 16S. Por otro lado, en incubaciones de este suelo a nivel de laboratorio, se han analizado, a nivel filogenético y funcional, las poblaciones implicadas en la degradación de las distintas fracciones de hidrocarburos del crudo de petróleo, y las posibles interacciones entre ellas. Para ello, se han establecido microcosmos en los que la microbiota nativa del suelo se ha expuesto a la presencia de fracción alifática (F1), fracción aromática (F3) y ambas en conjunto (F1F3). Se ha correlacionado el grado de degradación de alcanos, HAPs y, especialmente, de sus distintas familias de derivados metilados, con los cambios observados en la estructura (PCR-DGGE y pirosecuenciación del ADNr 16S) y la función (detección de genes funcionales y microarrays) de las comunidades bacterianas implicadas en su degradación a lo largo del tiempo. Los resultados obtenidos ofrecen una idea del comportamiento de las comunidades bacterianas ante la degradación de las distintas fracciones del petróleo, mostrando el efecto sinérgico de la presencia de alcanos sobre la degradación de HAPs, que no puede atribuirse únicamente al incremento de la biodisponibilidad. Al contrario, sería el resultado de la suma de distintos factores: el crecimiento inespecífico de poblaciones degradadoras a partir de subproductos de la degradación de los alcanos, el crecimiento específico de poblaciones degradadoras de alcanos y HAPs, y posibles fenómenos de cometabolismo de las poblaciones degradadoras de alcanos sobre los alquil-HAPs. / Soil contamination with crude oil derivatives is a worldwide problem, especially for oil producing and exporting countries, having very adverse consequences for the environment and human health. Bioremediation, consisting in the exploitation of the natural microbial biodegradation processes, is a cost effective and environmentally friendly alternative to traditional physical and chemical techniques for the restoration of polluted soils. This Thesis aims to study the microbial populations and processes involved in the biodegradation of hydrocarbons, especially polycyclic aromatic hydrocarbons (PAHs) and their alkyl-derivatives, in oil-polluted soils. For this purpose, we analyzed a real industrial soil polluted with oil derivatives, diesel and heavy hydraulic oils, from a site in the Community of Madrid that was submitted to on site bioremediation through large scale aerobic biopiles. We have analyzed the fate of PAHs, by determining their concentration and the formation of oxidation products (GC-MS), and followed the changes in bacterial community structure throughout the treatment, by using culture-dependent and molecular microbial ecology techniques, such as 16S rDNA barcoded pyrosequencing. In a second phase, soil microcosms were set up at the laboratory to investigate the bacterial populations involved in the degradation of the aliphatic and the PAH fractions from a crude oil, and the possible interactions between them. The results permitted to correlate degradation of alkanes, and of different PAHs families with changes in the community structure from a phylogenetic (PCR-DGGE and 16S rDNA pyrosequencing) and functional (detection of functional genes and microarrays) point of view. The results showed that the presence of alkanes has a synergistic effect in the degradation of PAHs, accelerating their degradation rates and increasing the extension of degradation at the end. This effect could not be attributed solely to an increase in bioavailability, but would be the result of the sum of several factors including the unspecific growth of PAH-degrading populations on the extra carbon provided though alkane degradation byproducts, the growth of specific populations able to degrade both alkanes and PAHs, and possible cometabolic actions of alkane-degrading populations on alkyl-PAHs.

La malaltia de Crohn és una malaltia inflamatòria intestinal crònica d'etiologia encara desconeguda. Actualment es pensa que hi participen factors genètics i immunològics que confereixen una susceptibilitat a l'hoste, i factors externs o ambientals, com serien els microorganismes i/o l'estil de vida. L'objectiu principal d'aquest treball ha estat descriure les poblacions bacterianes associades especialment als malalts de Crohn, amb la intenció d'identificar possibles agents etiològics. Els resultats d'aquest treball coincideixen amb investigacions prèvies que descriuen l'alteració bacteriana present en els malalts de Crohn (disbiosi) i recolzen la hipòtesi que implica el recentment descrit patovar "Adherent- Invasive Escherichia coli" (AIEC) en l'etiologia d'aquesta malaltia inflamatòria intestinal. A més, contribuïm a la descripció de les poblacions d'E. coli associades a la mucosa intestinal aportant dades sobre aspectes ecològics i patogènics. Finalment, descrivim nous aspectes fenotípics d'AIEC que podrien estar relacionats amb la seva patogènia, com seria la capacitat de formar biofilms. / Crohn's disease is a chronic inflammatory bowel disorder of unknown aetiology. Genetic and immunologic features that confer susceptibility on the host, together with external or environmental factors such as microorganisms and lifestyle, are thought to be involved. The main purpose of this work was to describe the bacterial populations particularly related with Crohn's disease patients in order to identify putative etiologic agents. The results are in agreement with previous research on the entire microbial community associated with Crohn's disease, providing evidence of a situation of dysbiosis, and further support the hypothesis of a putative implication of the recently described pathovar Adherent-Invasive Escherichia coli (AIEC). In addition, this work contributes to the understanding of mucosa-associated E. coli populations by providing new data about their ecological parameters and pathogenic features. Finally, we have also contributed to a better description of the AIEC pathovar by contrasting it with close pathogenic E. coli strains and finding new pathogenic features such as biofilm formation.